Flypub Etanol Kaynaklı Davranış saldirisi ve Sensitizasyon Çalışma

Özet

Flypub tsay meyve etanol etkisi altında Drosophila melanogaster görüntüler sineği davranışları ölçer. Tsay kolayca her düzeyde deneyciler tarafından hakim olabilir ve çeşitli buharlaşmış uyaranlara uygulanabilir, madde bağımlılığı ve bağımlılık çalışmaları kolaylaştırmak.

Özet

Alkol kullanımı bozukluğu (AUD) toplumumuzda ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. Bağımlılık için etkili müdahaleler geliştirmek için, farklı deneysel yaklaşımlar ve model sistemlerine ihtiyaç duyulan temel nörobiyolojik mekanizmaları anlamak önemlidir. Alkollü içeceklerin ana bileşeni etanol, merkezi sinir sisteminde adaptif değişikliklere neden olur ve kronik alımı üzerine davranış. Davranışsal duyarlılık (yani, artan tepkiler) özellikle bağımlılığın altında yatan önemli bir adaptif değişimi temsil eder. Hayvan modellerinde etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmalarının çoğu etanolün lokomotor aktive edici etkisi üzerine yapılmıştır. Etanolönemli bir etkisi davranışsal disinhibition olduğunu. Ancak, etanolün disinhibition etkisine karşı davranışsal duyarlılık yeterince temsil edilememaktadır. Bu sorunu gidermek için, Biz Drosophila melanogastertekrarlayan etanol maruz kalma üzerine disinhibited kur faaliyetlerinde artan artış ölçmesağlayan Flypub titre geliştirdi. Burada, etanol maruziyet odalarının montajı, tahlil istasyonunun kurulumu, sinek bakımı ve toplama kriterleri, etanol teslimatı, engelsiz kur faaliyetlerinin sayısallaştırılması, veri işleme ve istatistiksel analiz dahil olmak üzere adım adım Flypub tahlillerini rapor ediyoruz. Ayrıca, kritik adımları gidermek için nasıl sağlanan sınırlamalar aşmak ve ek etanol kaynaklı davranışları değerlendirmek için yardımcı programı genişletmek. Drosophila melanogaster güçlü genetik araçlar ile birlikte Flypub tsay etanol kaynaklı davranışsal sensitizasyon altında yatan mekanizma keşfetmek görevi kolaylaştıracaktır.

Giriş

Alkol dünyada en çok kullanılan ve yaygın olarak tüketilen ilaçlardan biridir. Bu kötüye kullanım ve bağımlılık için yüksek potansiyele sahiptir; ancak, bu sürecin altında yatan mekanizma tam olarak anlaşılamamıştır. Etanol disinhibition, öfori, bilişsel bozukluk, hiperaktivite, motor kontrol kaybı ve solucanlar^sedasyon1, meyve sinekler^1,2,3, fareler⁴, sıçanlar⁵ ve insanlar⁶, insanlar da dahil olmak üzere omurgasızlar için memelilere etanol etkileri aracılık ortak nörobiyolojik bileşenleri gösteren inhibe eder. Kronik etanol alımı aud altında yatan nöral adaptasyonlar ve davranışdeğişiklikleri neden olur. Adaptasyonlardan biri etanol^tekrarlanandeneyimleri ile artırılmış tepki olarak tanımlanan davranışsal duyarlılık 7^,8,9 veya diğer bağımlılık yapıcı maddeler^10,11,12.

On yıllar boyunca, etanol kaynaklı davranışsal duyarlılık çalışmaları (EIBS) lokomotor uyarıcı etkisi üzerinde duruldu, hangi bir öforik yanıt için bir proxy olarak kullanılır^7,8,9,13. Örneğin, tekrarlanan üzerine sıçan veya fareler (her 24, 48 veya 72 saat) etanol yönetimi yürüme hızı⁸,^14,15,,16^{,1717,18,19,20,21}ile ölçülen artırılmış lokomotor aktivitesini görüntüler. Benzer şekilde, meyve sinekler etanol buharı ikinci maruz kalma tabi 4 saat ilk maruz kalma dan sonra gelişmiş lokomotor tepki sergi olarak yürüme hızı ile ölçülen yanı sıra²². Meyve sineklerinde lokomotor uyarıcı etkiye karşı AyİBS'nin altında yatan mekanizma hakkında bilgi bulunmamakla birlikte, sıçan ve fareler de çalışmalar moleküler ve sinyal bileşenleri ortaya çıkarmış (örneğin, dopamin, glutamat ve GABA sistemleri) yanı sıra nöral substratlar ve devre (örneğin, ventral tegmental alan, çekirdek accumbens, amigdala ve prefrontal korteks) EIBS için önemli roller oynamaktadır^6,9,23.

Disinhibition etanol önemli bir etkisidir ve genellikle sınırlı davranışların tezahürü yol açar. Disinhibiting etkisi motor, duygusal, sosyal, cinsel ve bilişsel işlevler üzerinde uygulanan, hangi uygunsuz cinsel davranış, sözlü veya fiziksel saldırganlık ve dürtüsel eylemlere yol açabilir insan ve hayvan modellerinde^{24,25,26,27,28,29}. Etanol kaynaklı disinhibisyon mekanistik çalışmalar için hayvan modellerinde araştırılmıştır ve onlar kemirgenler ve maymunlar da motor dürtüsellik ve saldırganlık yanı sıra solucanlar^{6,9,,24,28,29,30}arama disinhibition içerir . Biz meyve sinekleri etanol etkisi altında cinsel davranış çekingen göstermek göstermiştir^31. Özellikle, vahşi tip erkekler nadiren etanol³¹ olmadan diğer erkekler mahkeme uçar ve bunu, nazik aktif erkekler kur reddediyorum. Etanol etkisi altında, ancak, erkek sinekler diğer erkekler ve kur daha az reddi sergileyen karşı daha fazla kur göstermek, genel olarak geliştirilmiş intermale kur ile sonuçlanan. Özellikle, sinekler tekrarlayan etanol maruziyeti üzerine disinhibition etkisi davranışsal duyarlılık geliştirmek, Hangi EIBS³¹çalışma için benzersiz bir sistem olarak hizmet vermektedir^,32.

Bu raporda, nasıl kurmak, gerçekleştirmek, sorun giderme ve etanol kaynaklı inhibisyon ve meyve sinek Drosophila melanogasterduyarlılık çalışma flypub analizi ve veri analiz açıklar. Faydasını ve etkinliğini sağlamak için, yaban tipi Kton-S 'yi(CS; kontrol sinek suşu) ve ahtapotin (OA) sentezleyen tiramin β hidroksilaz (tβh) eksikliği olan sineklerle birlikte test ettik. OA omurgasızlar büyük bir nöromodülatör^33,34 ve sinekler etanol toleransgelişiminde önemli bir rol oynar²². Burada ilk kez OA'nın EIBS için önemli olduğunu bildiriyoruz.

Protokol

NOT: Protokol bölümünde(1) odanın montajı, (2) sinek bakım ve toplama, (3) tahlil istasyonu kurulumu, (4) etanol maruziyeti, (5) kur puanlama ve veri analizi ve (6) istatistiksel analiz içeren hazırlık, Flypub tahlil ve analiz adımları ayrıntılı olarak anlatılabilir. Flypub tahlil ve analizinin yürütülmesi için önemli adımlar bir iş akışında gösterilmiştir (Şekil 1).

1. Odanın montajı (Şekil 2)

1. Yuvarlak Drosophila şişesinin alt kısmını jilet kullanarak 25 mL marktan kesin.
2. Sıcak lehim demiri kullanarak şişenin 50 mL işaretinde 5 mm çapında bir delik aç.
   NOT: Burası sineklerin odaya aktarılabildiği erişim noktasıdır.
3. 75 mL işaretinde Drosophila şişesine sığacak şekilde 54 mm çapında bir daire içine bir örgü levha kesin.
4. Sıcak tutkal kullanarak şişenin 75 mL işaretinde kafesi sabitleyin.
5. Polikarbonat plastik levhayı 70 mm çapında bir daire şeklinde kesin.
6. Polikarbonat plastik levhayı sıcak tutkal kullanarak 25 mL işaretinde (adım 1.1'de yapılan alt açık alan) şişeye takın.
7. Polikarbonat mermisinin dibe sıkıca bağlı olduğundan emin olmak için ağırlıkları kullanarak basınç uygulayın.
8. Herhangi bir kokuları kaldırmak ve bolca distile su altında birden çok kez durulayın etanol ile barlar yıkayın. Aşırı su kaldırmak için şiddetle barlar çalkalayın.
9. Oda sıcaklığında kağıt havlular üzerine yatay olarak koyarak barları kurulayın.

2. Sinek bakım ve toplama

1. Standart bir mısır unu / agar / şeker / maya gıda orta (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html) üzerinde sinek ler koruyun.
2. Bir-iki günlük erkek sinekleri toplayın 33 kişilik bir gruba, bir veri noktasını temsil eden, karbondioksit (CO₂₎anestezisi altında. Bozulmamış morfolojisi ile sinekler seçmek ve kurtarmak için bir gıda şişe koymak emin olun.
   NOT: Grup başına iki veya üç daha az sinek tolere edilebilir. Davranışlar deneysel ayarlara duyarlı olabilir, bu nedenle bar başına toplam sinek sayısının bir kontrol uçuş çizgisi ile ayarlanması gerekebilir.
   NOT: Anesteziye dayalı sineklerin yiyeceğe yapışmaması için gıda şişesinin yan tarafa serildiklerinden emin olun.
3. Sinekleri 25 °C'lik inkübatörde en az %50 bağıl nem ve etanol maruziyetinden 2 gün önce 12 saat açık / 12 saat karanlık döngü ile saklayın.
   NOT: CO₂ temizliği, etanol kaynaklı yanıtları değiştirebilecek herhangi bir CO₂kaynaklı fizyolojik veya davranışsal etkiyi ortadan kaldırmak için çok önemlidir.
4. Etanol maruziyeti ve puanlama kur davranışları yürüten deneycilere sinek genotiplerini veya tedavi koşullarını kör etmek için kodları kullanın.
   NOT: Kör testler deneysel önyargıortadan yardımcı olur.

3. Sayis istasyonu kurulumu (Şekil 3A)

1. İyi havalandırılan bir odada bankın üst kısmında ekli bir orta kol ile bir kopya standı ayarlayın.
   NOT: Kopyalama standı zorunlu değildir. Seviye platformu sağlayan herhangi bir evreleme cihazı yeterlidir.
2. Her kol standın merkezinden yaklaşık 18 cm uzakta olacak şekilde iki yan kolu standa kelepçele.
3. Standın her koluna ve ortasına bir floresan ışık yerleştirin.
4. Video kaydediciyi tabanın merkezinden yaklaşık 38 cm yukarıda, orta kola takın. Bu, barları en üstten kaydeder.
5. Kontrast oluşturmak için koyu renkli sinekleri görselleştirmeye yardımcı olan beyaz kağıt ile standın tabanını kapatın.
6. Pozlama günü boyunca, floresan ışıkları ve fotokopi standına bağlı video kameraya bağlı bilgisayarı açın (Şekil 3A).
   NOT: Işık yoğunluğu 2100-2200 lux puanlama için kaydedilen davranışların iyi kalite sağlar. Ancak, laboratuvardaki ortam aydınlatma koşulları etanol kaynaklı kur faaliyetlerini gözlemlemek için yeterlidir.
7. Şekil 3B'degösterilen etanol maruziyeti için kullanılacak öğeleri hazırlayın.
8. Bir dizi deney için altı temiz, bir araya getirilmiş pub toplayın ve bunları kod 1'den 6'ya kadar etiketleyin.
   NOT: Sinek genotiplerine veya tedavi koşullarına randomize kodları yerleştirdiğinden emin olun.

4. Etanol maruziyeti (Şekil 3)

1. 33 erkekten oluşan bir grubu küçük bir huni kullanarak 50 mL işaretindeki delikten Flypub odasına yavaşça aktarın.
   NOT: Sineklere karşı mekanik stresi en aza indirmek için, aktarım sırasında pub'ın altına bir fare yastığı veya herhangi bir yastıklama malzemesi yerleştirin.
2. Deliği bir bantla kapatın.
   NOT: Bant, sineklerin bardan kaçmasını önleyerek deliği kapatmak için kullanılır.
3. Sahnedeki barları 1'den 6'ya hizala.
4. Acclimate 10 dakika için odaya sinekler (Şekil 3D).
5. Odak, yakınlaştırma ve parlaklık da dahil olmak üzere kamera ayarlarını ayarlayın ve bazal kur düzeyini ölçmek için son 5 dakikaalış seviyesini kaydedin.
   NOT: Bir pub'ın ışık yansımasının yarattığı parlamayı ortadan kaldırmak için, açıyı ayarlamak için pub'ın altına laboratuvar mendilleri (genellikle 4 kat veya 1 mm'den az kalınlık) yerleştirin.
6. Temiz makas ile dört eşit dörtte bir ped keserek etanol teslimat ı için pamuk pedleri hazırlayın ve sonra uyum sırasında bir Petri kabına sığacak şekilde köşeleri kırpın(Şekil 3C).
   NOT: Pamuk pedleri işlemek için çıplak eller kullanmayın. Kokuların olası transferini önlemek için pamuk pedleri işlemek için forceps kullanın.
7. Her Petri kabına bir pamuk ped ekleyin.
8. Her pamuk pede 1 mL %95 etanol ekleyin, etanol çözeltisinin tüm ped alanına eşit olarak dağıtılmasını unutmayın.
9. Hızlı etanol buharlaşmasını önlemek için çift katmanlı laboratuvar mendilleri ile kaplayın.
10. Etanol ile ıslatılmış pamuk ped ve çift katmanlı laboratuvar silme içeren küçük Petri çanak yere uyum sonra pub alt açılış yoluyla.
11. Sahnede ki barları hizala, kayıt yapmaya başla ve aynı anda bir zamanlayıcı başlat.
12. Sinekler kur veya sedasyon nedeniyle hareket durdurmak kadar etanol maruz kalma sırasında sinekler içeren barlar kaydedin.
13. Sineklerin %90'ından fazlası sakinleştirildiğinde her pub'dan etanol içeren Petri kabını spatula ile çıkarın.
14. Yavaşça transfer barda 50 mL işareti delikten kendi atanan şişeleri geri uçar.
    NOT: Transfere yardımcı olmak için gıda şişelerinin üzerine bir huni yerleştirin. Yiyeceklere yapışmasını önlemek için sakinleştirilmiş sinekleri yiyecek şişelerinin kenarına yerleştirdiğinden emin olun.
15. Herhangi bir kokuları kaldırmak için etanol ile barlar temizleyin ve bolca distile su altında çalışan altında birden fazla kez durulayın. Aşırı su kaldırmak için şiddetle barlar çalkalayın.
16. Oda sıcaklığında kağıt havlular üzerine yatay olarak koyarak barları kurulayın.
17. Sinekleri en az %50 bağıl nem ve 12 saat Açık / 12 saat karanlık döngü ile 25 °C'lik kuluçka makinesinde tutun.
18. Adımları tekrarlayın 4.1-4.17 her 24 saat altı gün boyunca ve herhangi bir sirkadiyen etkileri önlemek için günün aynı saatinde etanol maruziyeti yapmak için emin olun.
    NOT: Sağlıklı sinekleri korumak için her 2 -3 günde bir gıda şişelerini değiştirin.

5. Kur puanlama ve veri analizi (Şekil 4-6)

1. Kaydedilen videoları bir medya oynatıcı kullanarak açın (örn. VLC) ve puanı elde etmek için sinekleri net bir şekilde gözlemlemek için videoyu yakınlaştırın(Şekil 4A).
2. Zaman kodunu videoya takın (Şekil 4B).
3. Aşağıdaki, tek taraflı kanat uzatma, kur zinciri, kur çemberi, karın bükme ve montaj dahil olmak üzere kur faaliyetleri yapan erkek sayısını saymak her 10 zaman bloğu³¹ (Şekil 5).
4. Her 10 zaman bloğu için kur gösteren erkek sayısını bir çalışma sayfasına girin (Şekil 6A).
5. Temsili veri noktası olarak art arda üç 10 s zaman bloğunda en yüksek sayıda erkek kur yaptı (Şekil 6B).
6. En yüksek değere sahip 10 ardışık veri noktasının ortalamasını hesaplayın(Şekil 6C)ve bu durum pub başına erkekler arası kur yapma yüzdesini temsil eder (Şekil 6A).

6. İstatistiksel analiz (Ek Şekil 1)

1. Açık istatistiksel analiz yazılımı (örneğin, Minitab 17) ve çalışma sayfasına kur verileri ekleyin.
   NOT: Herhangi bir istatistiksel analiz yazılımı kullanılabilir.
2. Verilerin dağılımını (normal veya normal olmayan dağılım) belirlemek için Stat sekmesine gidin, Temel İstatistikler'iseçin ve Normallik Testi seçeneğini tıklayın(Ek Şekil 1Ai).
3. Değişken'de,tek tek sütunları seçin (her sütun bir genotip veya çalışma altında tedavi veri kümesini temsil eden), Anderson-Darling testini seçin ve Tamam 'ı(Ek Şekil 1Aii)tıklatın.
   NOT: Normallik Olasılık Çizimi hesaplanan P-Değerini gösterir: P-Değeri 0,05'ten büyükse, veriler normal olarak dağıtılır. P-Değeri 0,05'ten azsa, veriler normal olarak dağıtılmamıştır(Ek Şekil 1Aiii).
4. Birden çok grubun karşılaştırılması için, Veri sekmesini tıklatarak karşılaştırmak için sütunları yığını, Yığın'ıve ardından Sütunları (Ek Şekil 1Bi)seçin.
5. Yığın Sütunları penceresinde, istiflenecek veri sütunlarını seçin, Yeni çalışma sayfasında veya geçerli çalışma sayfasısütununda yapılan istifleme yi seçin ve alt yazıyı (örn. veri grubu kimliğini) belirtmek için bir sonraki sütunu belirleyin; New worksheet Ek Şekil 1Bii-1Biii).
6. Stat sekmesini tıklatın, ANOVA testini seçin, Genel Doğrusal Modeli seçin ve ardından Fit Genel Doğrusal Modeli'ni tıklatın ( Ek Şekil1Ci).
7. Genel Doğrusal Model penceresinde, Yanıtlar kutusunda karşılaştırıldığında sütunları seçin, Etkenler kutusunda alt yazı içeren sütunu seçin ve istatistiksel analiz sonuçlarına yol açan Tamam'ıtıklatın (Ek Şekil 1Cii-1Ciii).
8. Normal dağıtılmış verilerle iki grubun karşılaştırılması için Stat sekmesini tıklatın, Temel İstatistikleriseçin ve 2-Örnek t-testi (Ek Şekil 1Di)seçeneğini belirleyin.
9. Ortalama pencere için 2-Örnek t'de, her örnek kendi sütunundadır,açılır kutudan, Örnek 1 ve Örnek 2 kutularında karşılaştırmak için iki grubu seçin ve sonra Tamam'ıtıklatın, bu da istatistiksel analiz sonuçlarına yol açar(Ek Şekil 1Dii-1Diii).
10. Normal olarak dağıtılmayan verilerle iki grubun karşılaştırılması için Stat sekmesine gidin, Nonparametrics'i seçin ve Mann-Whitney 'i tıklatın (Ek Şekil 1Ei)
11. Mann-Whitney penceresinde, Birinci Örnek ve İkinci Örnek kutularında karşılaştırmak için iki grubu seçin ve ardından istatistiksel analiz sonuçlarına yol açan Tamam'ıtıklatın(Ek Şekil 1Eii-1Eiii).
12. Normalde dağıtılmamış üç veya daha fazla veri grubu karşılaştırması için Stat sekmesine gidin, Nonparametrics'iseçin ve ardından Kruskal-Wallis testini tıklatın (Ek Şekil 1Fi).
13. Kruskal-Wallis penceresinde, Yanıt kutusunda karşılaştırıldığında sütunları seçin, Faktör kutusunda alt yazı içeren sütunu seçin ve istatistikselanaliz sonuçlarına yol açan Tamam'ı tıklatın (Ek Şekil 1Fii-1Fiii).

Sonuçlar

Bu bölümde temsili bir Flypub deneyinin sonuçları gösteriş. Drosophila erkekler nadiren mahkeme diğer erkekler^35,36. İlk etanol maruziyeti sırasında, yabani tip Kton-S (CS)erkekler, disinhibited intermale kur küçük ama önemsiz bir artış sergiledi³¹ (Şekil 7A). Ancak, CS erkekler sonraki etanol maruziyetinde (ANOVA GLM, CS: R²=0,83, F_(5,66) =65.21, p < 0.0001; n = 12; Şekil 7A), etanoldin disinhibition etkisine davranışsal duyarlılık gösterir. Biz daha önce EIBS bu tür mantar nöronlar dopamin ve dopamin reseptördopEcR gerektirir göstermiştir^31,32.

Ek nöromodülatörlerin EIBS'de yer alıp almadığını belirlemek için, oa biyosentezinde hız sınırlayıcı enzim olan tiramin β hidroksilaz dan yoksun^37,38nolu sinekleri test ederek OA'nın rolünü araştırdık.t³⁸ CS genetik geçmişindeki tβh erkekler (Leipzig Üniversitesi, Almanya'dan Dr. Andreas Thum'un bir tür hediyesi) günlük etanol maruziyeti (ANOVA GLM, tβh: R²=0,67, F_(5,66) =27.60, p < 0.0001; n = 12; Şekil 7B) ancak CS'e göre düşük seviyededir (ANOVAGLM, etkileşim etkisi: F =2.50, p <0.034). Post hoc analizi üzerine, tβh erkekler cs (Iki örnek t-testi: p < 0.002 EXP4, p < 0.004 EXP5, p < 0.021 EXP6 ile karşılaştırıldığında dördüncü ila altıncı etanol maruz kalma sırasında en belirgin her pozlama da erkekler arası kur daha düşük seviyelerde sergiledi; n = 12; Şekil 7C). Birlikte, bu sonuçlar OA etanol disinhibition etkisi EIBS bir rol oynayabilir göstermektedir. Daha da önemlisi, bu veri setleri açıkça etanol kaynaklı disinhibisyon ve sensitizasyon çalışmalarında Flypub tsay yarar ve etkinliğini göstermektedir.

Şekil 1: Flypub titreiş akışı. Flypub tamsasını yürütmek için önemli adımları vurgulayan bir iş akışı diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Flypub oda malzemeleri ve montajı. (A) Bir Flypub odası inşa etmek için gerekli malzemeler (i) sıcak tutkal tabancası tutkal sopa, (ii) sıcak tutkal tabancası, (iii) jilet, (iv) lehim demir, (v) cetvel, (vi) mesh, (vii) polikarbonat plastik levha, ve (viii) yuvarlak alt Drosophila şişe. (B) Flypub oda meclisinin şematik temsili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Etanol maruziyeti. (A) Tam olarak monte edilmiş bir Flypub istasyonu. (B) Etanol maruziyeti için gerekli malzemeler arasında (i) P1000 mikropipet, (ii) bant, (iii) pamuk ped, (iv) Petri çanak, (v) laboratuvar mendilleri, (vi) küçük huni, (vii) zamanlayıcı, (viii) orta boy huni, (ix) fare yastığı, (x) makas, (xi) % 95 etanol, (xii) forceps ve (xiii) spatula. (C) Pamuk pedlerin nasıl kesilen etütler üzerine adımlar. (D) Sahnede hizalanmış pubların üst görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Davranışsal puanlama için video kurulumu. Gösterilen (A) üzerinde adım adım kılavuz nasıl video yakınlaştırmak ve (B) nasıl davranışsal puanlama için VLC medya oynatıcı içine zaman kodu dosyası eklemek için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Erkek kur davranışları. Temsili görüntüler aşağıdaki ve tek taraflı kanat uzantısı da dahil olmak üzere Drosophila erkek kur davranışları göstermek (A) kur şarkısı, (B) kur zinciri, (C) kur daire (D) karın bükme ve (E) davranışsal puanlama için kullanılan montaj. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Veri girişi ve analizi. (A) Her 10'daki zaman bloğunda kur yapan erkek sayısı bir çalışma sayfasına dönüştürülr. Üç ardışık 10 s zaman blokları (yeşil ok) kur erkek en yüksek sayıda temsili bir veri noktası olarak kullanılır. Maksimum değere sahip 10 ardışık veri noktasının (mavi veya turuncu parantez) ortalaması, pub başına erkekler arası kur yapma yüzdesini temsil eder [turuncu parantez; MAX (ortalama), siyah ok]. (B,C) Maksimum temsili veri noktasını ve pub başına 10 ardışık temsili veri noktasının maksimum ortalamasını hesaplamak için kullanılan çalışma sayfası formülleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: CS ve tβ h'de etanol indüklenen davranışsal disinhibition ve sensitizasyon.h. (A,B) CS ve tβh erkekleri tekrarlanan etanol maruziyeti (ANOVA GLM, CS: R²=0.83, F_(5,66)=65.21, p < 0.0001; tβh: R²=0,67, F_(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) Tβh erkeklerde CS'ye göre daha az çekingen kur (n=12) saptırıldı. Post hoc analizlerinin p değerleri çizginin üzerinde gösterilir. Erkekler arası kur yapma etkinliği, her etanol maruziyeti için oluşturulan videolardan analiz edildi. Tüm veriler ortalama ± standart hata anlamına gelir olarak rapor edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: İstatistiksel analiz. Minitab 17 yazılımındaki adımlar (A) Normallik testi, (B) veri istifleme, (C) Genel doğrusal model ANOVA testi, (D) İki örnekli t-testi, (E) Mann-Whitney testi ve (F) Kruskal-Wallis testi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu raporda, Flypub testinin kurulum ve ayrıntılı protokolünü açıkladık; tekrarlayan etanol maruziyetinin, çekingen kur ve davranışsal duyarlılığı nasıl tetiklediğini ölçmek için yeni bir yöntem. Flypub tahsini nispeten basit olmasına rağmen, güvenilir sonuçlar elde etmek için birkaç adım dikkat ve dikkat gerektirir. İlk olarak, test için sinekler tamamen pigmentli olmalıdır (yani, tamamen gelişmiş yetişkin sinekler), sağlıklı ve bozulmamış. Özellikle kanatlarında veya bacaklarında oluşan deformiteler veya hasarlar erkeğin mahkeme yeteneğini etkileyebilir. İkinci olarak, sinek yaşı önemlidir ve kontrol ve deneysel gruplar arasında eşleşmelidir (optimal yaş: 3-5 gün etanol maruziyeti 1). İki hafta ve daha yaşlı vahşi tip erkek sinekler disinhibited kur yüksek seviyelerde görüntülemek eğilimindedir³¹. Bu nedenle, çalışma altında sineklerin uygun yaş eşleştirme değişken sonuçlar önlemek için esastır. Üçüncü olarak, pub başına sinek sayısı hayati önem taşımaktadır (optimal: pub başına 33). Pub başına daha düşük veya daha yüksek sinek numaraları büyük ölçüde kur puanları çarpık olabilir (veriler gösterilmez). Dördüncü olarak, Flypub odaları Şekil 2B'degösterildiği gibi aynı hacimlere sahip olması gerekir. Bu, sineklerin eşzamanlı olarak etanol buharı almasını ve ortaya çıkan davranışların tutarlı olmasını sağlar. Beşinci olarak, net video kaydı ve kesin kur puanlama esastır. Bu protokol ağır davranışsal gözlemlere bağlıdır, bu nedenle standart kur puanlama protokolüne titiz bir şekilde uyulması tutarsız sonuçları en aza indirmek için temeldir. Son olarak, hem etanol maruziyeti hem de kur puanlama adımlarının körü körüne yapılması tavsiye edilir, deneyci sinek genotiplerinden veya deneysel tedavilerden habersizdir ve bu da deneysel önyargıyı önler.

Flypub testinin birçok avantajı vardır. İlk olarak, birden fazla sinek grubu aynı anda test edilebilir ve karşılaştırılabilir. İkinci olarak, ucuz, kurulumu basit ve öğrenmesi kolay, lise, lisans ve yüksek lisans öğrencileri, doktora ve fakülte ile sınırlı alan ve bütçeleri ile öğretim laboratuvarları ile ilköğretim de dahil olmak üzere her düzeyde deneyciler için son derece münasip hale. Üçüncü olarak, bu kadın sinekler ve etanol veya diğer yatıştırıcı yatıştırıcı yatıştırıcı etkisi ilk duyarlılık ve tolerans geliştirme ve bakım değerlendirmek için sedatif etkisi gibi ek davranışları ölçmek için kullanılabilir^31,32. Flypub, AUD'un çeşitli özelliklerini birlikte incelemek için çok yönlü bir yöntemdir.

Flypub testinin en büyük sınırlaması sıkı ve zahmetli kur puanlama rejimidir. Etanol etkisi altında kur davranışı kur süresi az bir saniyeden birkaç dakika arasında değişmektedir ve kur yapan sinekler oldukça sık değişiyor bir şekilde son derece dinamiktir. Burada sunulan puanlama rejimi ve bu dinamik doğa dahil etmek için belirli bir genotip^31,,32için bireysel etanol pozlama tutarlı puanları sağlamak için geliştirilmiştir. Protokolde belirtildiği gibi, kur yapma faaliyeti elle puanlandırılır, bu da zaman alıcıdır. Birkaç otomatik puanlama programları tarafsız yüksek iş bölümü davranış tarama kolaylaştırmak için geliştirilmiştir ve bunların hepsi bireysel sinek 'hareketleri ve yerleri^{39,40,41,42,43,44,45}güveniyor . Ayrıca kur yapma etkinliğini otomatik olarak saymak için bir bilgisayar yazılımı geliştirmeye çalıştık ancak tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde edemedik. Bu davranışsal puanlama birden fazla kur adımları (yani, aşağıdaki, tek taraflı kanat uzatma, karın bükme ve montaj)^35,36,aynı anda birden fazla sinek⁴⁶ içerir gerçeği nedeniyle olabilir. Bu sınırlama ya da olsa, yeterli eğitime sahip bir deneyci, etanol kaynaklı kur davranışlarını tutarlılık ve doğrulukla ölçebilmelidir. Yine de, bir takip olarak makine öğrenimi veya diğer gelişmiş algoritmalar benimsemek için büyük yardım ve önem olacaktır.

Kemirgen modelleri ne kadar benzer, sinek modelinde etanol üzerinde yapılan çalışmalar büyük ölçüde etanolün lokomotor uyarıcı ve sedatif etkileri üzerinde yoğunlaşmış. Flypub tsay ancak, önlemler disinhibited kur, roman³¹olan bilişsel disinhibition bir tür^,32. Bu nedenle, Flypub moleküler oyuncular, hücresel yollar ve sinir devreleri yanı sıra risk faktörleri (örneğin, yaş, uyku, diyet veya sosyal çevre) davranışsal çekingenlik ve duyarlılık için kritik açıklığa kavuşturmak için yardımcı olabilir. Daha önce dopamin sinyalizasyonu eibs için gerekli olduğunu göstermiştir, hangi kemirgen modelleri ve insan deneklerde bulgular doğrultusunda^6,9,31. Ayrıca kavram kanıtı olarak, biz tβh mutant OA eksik inceledi (norepinefrin omurgasız meslektaşı) ve oa etanol disinhibition etkisi davranışsal sensitizasyon için de önemli olduğunu bulundu katkısı dopamin göre nispeten küçük olmasına rağmen³¹. Bu bulgu Scholz⁴⁷ tarafından tβh mutant sinekler etanol lokomotor aktivasyon etkisi⁴⁷sensitizasyon belirgin bir bozukluk sergilemek gözlem aksine . Bu farklı moleküler düşündürmektedir, hücresel ve nöral yollar lokomotor aktivasyon karşı disinhibition davranışsal duyarlılık aracılık. Takip çalışmaları bu tantalizing kavramı daha da işbirliği gerekir.

Özetle, Flypub düşük maliyetli, çok yönlü ve etkili bir yöntem etanol davranışsal tepkileri araştırmak için, özellikle disinhibition ve davranışsal duyarlılık, aud anlayışımızı ilerletmek ve bu kronik bozukluk için etkili müdahaleler hakkında fikir sağlamak yardımcı olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
95 % Ethanol	VWR Chemicals	BDH1158-4LP
Canton-S	-	-	wild-type strain used as a control
Copy stand with arms	Kaiser	205411	model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds	Swisspers	COT-027	to deliver ethanol
Excel	Microsoft	-	to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb	Lights of America	7108N	maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software	Microsoft	-	version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio	Microsoft	Q2F-00013	1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17	Minitab	-	version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet	Sefar Nitex	-	model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes	Falcon	08-757-100A	35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size	Fisher scientific	10-348A	65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small	Fisher scientific	07-202-121	4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet	Lexan	-	0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle	Fisher scientific	AS115	polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron	Weller	WES51	to make a hole in a flypub
Time code	-	-	.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh)	-	-	mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player	VideoLAN	-	version 3.0.8; any media player can be used to score courtship