Flypub Per studiare l'etanolo indotto disinibie comportamentali e sensibilitazione

Riepilogo

Il saggio Flypub misura i comportamenti che il volo della frutta che drosophila melanogaster mostra sotto l'influenza dell'etanolo. Il saggio può essere facilmente padroneggiato dagli sperimentatori a tutti i livelli e applicato a vari stimoli vaporizzati, facilitando l'abuso di sostanze e gli studi sulle dipendenze.

Abstract

Il disturbo da consumo di alcol (AUD) rimane un problema serio nella nostra società. Per sviluppare interventi efficaci per la dipendenza, è importante comprendere i meccanismi neurobiologici sottostanti, per i quali sono necessari diversi approcci sperimentali e sistemi modello. L'ingrediente principale delle bevande alcoliche è l'etanolo, che provoca cambiamenti adattativi nel sistema nervoso centrale e il comportamento all'assunzione cronica. La sensibilizzazione comportamentale (cioè le risposte aumentate) rappresenta in particolare un cambiamento adattivo chiave alla base della dipendenza. La maggior parte degli studi di sensibilizzazione comportamentale indotta dall'etanolo nei modelli animali sono stati condotti sull'effetto di attivazione del locomotore dell'etanolo. Un effetto prominente dell'etanolo è la disinibizione comportamentale. La sensibilizzazione comportamentale all'effetto disinibizione dell'etanolo, tuttavia, è sottorappresentata. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato il saggio Flypub che permette di misurare l'aumento aumentato delle attività di corteggiamento disinibite in base all'esposizione ricorrente all'etanolo nella Drosophila melanogaster. Qui, riportiamo il saggio Step-by-step Flypub tra cui l'assemblaggio di camere di esposizione all'etanolo, l'installazione della stazione di analisi, i criteri per la cura e la raccolta delle mosche, la consegna dell'etanolo, la quantificazione delle attività di corteggiamento disinibite, l'elaborazione dei dati e l'analisi statistica. Sono inoltre disponibili informazioni su come risolvere i problemi relativi ai passaggi critici, superare le limitazioni ed espandere la sua utilità per valutare comportamenti aggiuntivi indotti dall'etanolo. Il saggio Flypub in combinazione con potenti strumenti genetici nella Drosophila melanogaster faciliterà il compito di scoprire il meccanismo alla base della sensibilizzazione comportamentale indotta dall'etanolo.

Introduzione

L'alcol è uno dei farmaci più facilmente disponibili e ampiamente consumati al mondo. Ha un alto potenziale per uso improprio e dipendenza; tuttavia, il meccanismo alla base di questo processo rimane incompleto. L'etanolo induce disinibizione, euforia, danno cognitivo, iperattività, perdita di controllo motorio e sedazione nei vermi¹, moscerini della frutta^1,2,3, topi⁴, ratti 5 e umani⁶ , indicando componenti neurobiologici comuni che mediano gli effetti dell'etanolo dagli invertebrati ai mammiferi compresi gli esseri umani.⁶ L'assunzione cronica di etanolo provoca adattamenti neurali e modifiche comportamentali alla base dell'AUD. Uno degli adattamenti è la sensibilizzazione comportamentale definita come la risposta aumentata con ripetute esperienze di etanolo^7,8,9 o altre sostanze che creano dipendenza^10,11,12.

Nel corso dei decenni, gli studi sulla sensibilizzazione comportamentale indotta dall'etanolo (EIBS) si sono concentrati sull'effetto di stimolazione locomotore, che viene utilizzato come proxy per una risposta euforica^7,8,9,13. Ad esempio, ratti o topi su ripetuti (ogni 24, 48 o 72 h) amministrazione dell'etanolo visualizzare l'attività locomotore aumentata misurata dalla velocità di camminata^8,14,^{15,,16,17,18,}19^,2020,21. Allo stesso modo, i moscerini della frutta sottoposti alla seconda esposizione al vapore etanolo 4 h dopo la prima esposizione presentano la risposta locomotoria migliorata misurata dalla velocità di deambulazione e²². Sebbene non siano disponibili informazioni sul meccanismo alla base dell'EIBS all'effetto di stimolazione locomotore nei moscerini della frutta, gli studi su ratti e topi hanno scoperto i componenti molecolari e di segnalazione (ad esempio, i sistemi di dopamina, glutammato e GABA) così come i substrati neurali e il circuito (ad esempio, l'area tegmentale ventrale, il nucleo accumbens, l'amigdala e la corteccia prefrontale) che svolgono ruoli importanti per EIBS^6,9,23.

La disinibizione è un effetto importante dell'etanolo e porta alla manifestazione di comportamenti che sono tipicamente limitati. L'effetto disinibitante è esercitato sulle funzioni motorie, emotive, sociali, sessuali e cognitive, che possono portare a comportamenti sessuali inappropriati, aggressività verbale o fisica e atti impulsivi in esseri umani e modelli animali^{24,25,26,27,28,29}. La disinibizione indotta dall'etanolo è stata studiata nei modelli animali per studi meccanicistici e includono impulsività motoria e aggressività in roditori e scimmie, nonché disinibizione da foraggiamento nei vermi^6,9,24^,28,29,30.³⁰ Abbiamo dimostrato che i moscerini della frutta mostrano un comportamento sessuale disinibito sotto l'influenza dell'etanolo³¹. In particolare, i maschi selvatici volano raramente corteggiano altri maschi senza etanolo³¹ e quando lo fanno, i cortigiani rifiutano attivamente i maschi di corteggiamento. Sotto l'influenza dell'etanolo, tuttavia, le mosche maschili mostrano più corteggiamento verso altri maschi e i cortigiani mostrano meno rifiuto, con conseguente corteggiamento intermaschile generale migliorato. In particolare, le mosche sviluppano una sensibilizzazione comportamentale all'effetto disinibizione dopo l'esposizione ricorrente agli etanolo, che funge da sistema unico per studiare l'EIBS^31,32.

In questo rapporto viene descritto come impostare, eseguire, risolvere i problemi e analizzare il saggio Flypub e i dati per studiare la disinibizione indotta da etanolo e la sensibilizzazione nel filo della frutta Drosophila melanogaster. Per fornire la sua utilità ed efficacia, abbiamo testato il tipo selvaggio Canton-S (CS; controllo del ceppo di mosca) insieme alle mosche carenti di tirinamo - idrossilasi (th) che sintetizza octopamina (OA). OA è un importante neuromodulatore in invertebrati^33,34 e svolge un ruolo chiave nello sviluppo della tolleranza all'etanolo nelle mosche²². Riportiamo qui per la prima volta che l'OA è importante per la EIBS.

Protocollo

NOTA: la sezione del protocollo descrive in dettaglio le fasi preparatorie, di analisi e analisi Flypub che includono (1) l'assemblaggio della camera, (2) la cura e la raccolta delle mosche, (3) la configurazione della stazione di analisi, (4) l'esposizione all'etanolo, (5) il punteggio di corteggiamento e l'analisi dei dati e (6) l'analisi statistica. I passaggi principali per l'esecuzione dell'analisi e dell'analisi Flypub sono illustrati in un flusso di lavoro (Figura 1).

1. Assemblea della camera (Figura 2)

1. Tagliare la parte inferiore della bottiglia rotonda di Drosophila al marchio 25 mL utilizzando una lama di rasoio.
2. Fare un foro, 5 mm di diametro, al marchio 50 mL della bottiglia utilizzando un ferro da saldatura a caldo.
   NOTA: Questo è il punto di accesso in cui le mosche saranno trasferite nella camera.
3. Tagliare un foglio di rete in un cerchio, 54 mm di diametro, per inserirsi nella bottiglia di Drosophila al marchio 75 mL.
4. Fissare la maglia al marchio 75 mL della bottiglia utilizzando colla a caldo.
5. Tagliare il foglio di plastica in policarbonato in un cerchio, 70 mm di diametro.
6. Attaccare il foglio di plastica in policarbonato alla bottiglia al marchio 25 mL (area aperta in basso realizzata al punto 1.1) utilizzando colla a caldo.
7. Pressione verso il basso utilizzando pesi per garantire che il giro in policarbonato sia saldamente attaccato al fondo.
8. Lavare i pub con etanolo per rimuovere eventuali odori e sciacquarli abbondantemente più volte sotto l'acqua distillata corrente. Agitare vigorosamente i pub per rimuovere l'acqua in eccesso.
9. Asciugare i pub posandoli orizzontalmente su asciugamani di carta a temperatura ambiente.

2. Cura e ritiro del volo

1. Mantenere le mosche su un mezzo alimentare standard di farina di mais / agar / zucchero / lievito (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
2. Raccogliere da uno a due giorni maschio vola in un gruppo di 33, che rappresentano un punto dati, sotto anestesia di anidride carbonica (CO_2). Assicurati di selezionare le mosche con morfologia intatta e metterle in una fiala alimentare per recuperare.
   NOTA: Due o tre mosche in meno per gruppo sono tollerabili. I comportamenti possono essere sensibili alle impostazioni sperimentali, quindi potrebbe essere necessario regolare un numero di volo totale per pub con una linea di volo di controllo.
   NOTA: Assicurarsi che la fiala di cibo è posato sul lato in modo che le mosche anestesizzate non rimangano attaccate al cibo.
3. Mantenere le mosche nell'incubatrice di 25 gradi centigradi con almeno il 50% di umidità relativa e un ciclo di 12 h luce / 12 h di buio per 2 giorni prima dell'esposizione all'etanolo.
   NOTA: La clearance CO₂ è fondamentale per eliminare eventuali effetti fisiologici o comportamentali indotti da CO₂che possono alterare le risposte indotte dall'etanolo.
4. Usa i codici per adire genotipi di mosca cieca o condizioni di trattamento per gli sperimentatori che conducono l'esposizione all'etanolo e segnano comportamenti di corteggiamento.
   NOTA: I test ciechi aiutano a eliminare i pregiudizi sperimentali.

3. Stazione di saggio impostata (Figura 3A)

1. Impostare un supporto di copia con un braccio centrale collegato su una panca in una stanza ben ventilata.
   NOTA: il supporto di copia non è obbligatorio. Qualsiasi dispositivo di gestione temporanea che fornisce una piattaforma di livello è sufficiente.
2. Bloccare i due bracci laterali al supporto, con ogni braccio di circa 18 cm fuori dal centro del supporto.
3. Posizionare una luce fluorescente su ogni braccio del supporto e uno al centro.
4. Fissare il videoregistratore al braccio centrale, circa 38 cm sopra il centro della base. Questo registrerà i pub da una vista dall'alto.
5. Coprire la base del supporto con carta bianca, che aiuta a visualizzare le mosche di colore scuro per creare contrasto.
6. Durante il giorno di esposizione, accendere le luci fluorescenti e il computer collegato alla videocamera collegata al supporto di copia (Figura 3A).
   NOTA: L'intensità della luce 2100-2200 lux fornisce una buona qualità dei comportamenti registrati per il punteggio. Tuttavia, le condizioni di illuminazione ambientale in laboratorio sono sufficienti per osservare le attività di corteggiamento indotte dall'etanolo.
7. Preparare gli elementi da utilizzare per l'esposizione all'etanolo illustrata nella figura 3B.
8. Raccogli sei pub puliti e assemblati per una serie di esperimenti e etichettali con il codice da 1 a 6.
   NOTA: Assicurarsi di inserire i codici casuali su genotipi di volo o condizioni di trattamento.

4. Esposizione all'etanolo (Figura 3)

1. Trasferire delicatamente un gruppo di 33 maschi in una camera Flypub attraverso il foro al marchio 50 mL utilizzando un piccolo imbuto.
   NOTA: Per ridurre al minimo lo stress meccanico alle mosche, posizionare un tappetino per mouse o qualsiasi materiale di ammortizzazione sotto il pub durante il trasferimento.
2. Coprire il foro con un nastro adesivo.
   NOTA: Il nastro viene utilizzato per chiudere il foro, impedendo alle mosche di fuoriuscire dal pub.
3. Allineare i pub sul palco da 1 a 6.
4. Acclimatare le mosche alla camera per 10 min (Figura 3D).
5. Regola le impostazioni della fotocamera, tra cui messa a fuoco, zoom e luminosità, e registra gli ultimi 5 min di acclimatamento per misurare un livello di corteggiamento basale.
   NOTA: Per eliminare il bagliore generato dalla riflessione della luce da un pub, posizionare le salviette da laboratorio (in genere 4 strati o spessore inferiore a 1 mm) nella parte inferiore del pub per regolare l'angolo.
6. Preparare i batuffoli di cotone per la consegna dell'etanolo tagliando un pad in quattro quadranti uguali con forbici pulite e quindi tagliare gli angoli per farlo entrare in un piatto Petri durante l'acclimatazione (Figura 3C).
   NOTA: Non utilizzare le mani nude per maneggiare i batuffoli di cotone. Utilizzare pinze per maneggiare i batuffoli di cotone per evitare qualsiasi potenziale trasferimento di odori.
7. Aggiungere un batuffolo di cotone in ogni piatto Petri.
8. Aggiungere 1 mL di 95% di etanolo ad ogni batuffolo di cotone, assicurarsi che la soluzione di etanolo sia distribuita uniformemente su tutta l'area del pad.
9. Coprire con salviette da laboratorio a doppio strato per evitare una rapida evaporazione dell'etanolo.
10. Posizionare il piccolo piatto Petri contenente il batuffolo di cotone imbevuto di etanolo e le salviette da laboratorio a doppio strato attraverso l'apertura inferiore del pub dopo l'acclimatamento.
11. Allineare i pub sul palco, iniziare la registrazione e contemporaneamente avviare un timer.
12. Registrare i pub contenenti mosche durante l'esposizione all'etanolo fino a quando le mosche smettono di corteggiarsi o muoversi a causa della sedazione.
13. Togliere il piatto Petri contenente etanolo da ogni pub con una spatola quando oltre il 90% delle mosche sono sedati.
14. Trasferire delicatamente vola di nuovo alle loro fiale assegnate attraverso il foro al marchio 50 mL nel pub.
    NOTA: Posizionare un imbuto sopra le fiale di cibo per facilitare il trasferimento. Assicurati di posizionare mosche sedate sul lato delle fiale di cibo per evitare che rimangano bloccate nel cibo.
15. Pulire i pub con etanolo per rimuovere eventuali odori e sciacquarli abbondantemente più volte sotto l'acqua distillata corrente. Agitare vigorosamente i pub per rimuovere l'acqua in eccesso.
16. Asciugare i pub posandoli orizzontalmente su asciugamani di carta a temperatura ambiente.
17. Mantenere le mosche nell'incubatrice di 25 gradi centigradi con almeno il 50% di umidità relativa e un ciclo di 12 h luce / 12 h di buio.
18. Ripetere i passaggi 4.1-4.17 ogni 24 ore per sei giorni consecutivi e assicurarsi di condurre l'esposizione all'etanolo alla stessa ora del giorno per evitare effetti circadiani.
    NOTA: Cambiare le fiale di cibo ogni 2 – 3 giorni per mantenere mosche sane.

5. Punteggio di corteggiamento e analisi dei dati(Figura 4-6)

1. Aprire i video registrati utilizzando un lettore multimediale (ad esempio, VLC) e ingrandire il video per osservare chiaramente i moscerini per segnare (Figura 4A).
2. Allegare il codice temporale al video (Figura 4B).
3. Contare il numero di maschi impegnati in attività di corteggiamento tra cui il seguito, l'estensione unilaterale dell'ala, la catena di corteggiamento, il cerchio di corteggiamento, la piegatura addominale e il montaggio per ogni blocco temporale di 10 s³¹ (Figura 5).
4. Immettere il numero di maschi che visualizzano il corteggiamento per ogni blocco di tempo di 10 s in un foglio di lavoro (Figura 6A).
5. Utilizzare il numero massimo di maschi corteggiati nei tre blocchi temporali consecutivi di 10 s come punto dati rappresentativo (Figura 6B).
6. Calcolare la media di 10 punti dati consecutivi con il valore più alto (Figura 6C) e questo rappresenta la percentuale di corteggiamento intermale per pub (Figura 6A).

6. Analisi statistica (figura supplementare 1)

1. Aprire il software di analisi statistica (ad esempio Minitab 17) e aggiungere i dati di corteggiamento nel foglio di lavoro.
   NOTA: È possibile utilizzare qualsiasi software di analisi statistica.
2. Per determinare la distribuzione dei dati (distribuzione normale o non normale), passare alla scheda Statistiche, selezionare Statistiche di basee fare clic sull'opzione Test di normalità (Figura supplementare 1Ai).
3. In Variabileselezionare singole colonne (ogni colonna che rappresenta un set di dati di un genotipo o di un trattamento in studio), scegliere il test Anderson-Darling e fare clic su OK (Figura supplementare 1Aii).
   NOTA: il grafico di probabilità di normalità mostrerà il valore P calcolato: se il valore P è maggiore di 0,05, i dati vengono normalmente distribuiti. Se il valore P è minore di 0,05, i dati non vengono distribuiti normalmente (Figura supplementare 1Aiii).
4. Per un confronto tra più gruppi, impilare le colonne da confrontare facendo clic sulla scheda Dati , selezionare Stack, quindi Colonne (Figura supplementare 1Bi).
5. Nella finestra Stack colonne, selezionare le colonne di dati da impilare, selezionare l'impilamento fatto in Nuovo foglio di lavoro o Colonna del foglio di lavoro corrente con la colonna successiva designata per la denotazione di pedice (ad esempio, l'identità del gruppo di dati; Figura supplementare 1Bii-1Biii).
6. Fare clic sulla scheda Stat , selezionare il test ANOVA, selezionare il modello lineare generale, quindi fare clic su Adatta modello lineare generale ( Figurasupplementare 1Ci).
7. Nella finestra Modello lineare generale selezionare le colonne da confrontare nella casella Risposte, selezionare la colonna con pedice nella casella Fattori e fare clic su OK, che porta ai risultati dell'analisi statistica (Figura supplementare 1Cii-1Ciii).
8. Per confrontare due gruppi con dati normalmente distribuiti, fare clic sulla scheda Statistiche , selezionare Statistiche di basee selezionare il 2-Sample t-test (Figura supplementare 1Di).
9. Nella casella di controllo 2-Sample t per la finestra Mean selezionare Each sample is in itscolumn , from a dropdown box , selezionare i due gruppi da confrontare nelle caselle Sample 1 e Sample 2 (Esempio 2), quindi fare clic su OK, che consente di visualizzare i risultati dell'analisi statistica (Figura supplementare 1Dii-1Diii).
10. Per confrontare due gruppi con dati non distribuiti normalmente, passare alla scheda Statistiche, selezionare Non parametrica e fare clic su Mann-Whitney (Figura supplementare 1Ei)
11. Nella finestra Mann-Whitney selezionare i due gruppi da confrontare nelle caselle Primo campione e Secondo campione, quindi fare clic su OK, che porta ai risultati dell'analisi statistica (Figura supplementare 1Eii-1IiiEiii).
12. Per confrontare tre o più gruppi di dati non distribuiti normalmente, passare alla scheda Stat , selezionare Non parametrics, quindi fare clic sul test Kruskal-Wallis (Figura supplementare 1Fi).
13. Nella finestra Kruskal-Wallis selezionare le colonne da confrontare nella casella Risposta, selezionare la colonna con pedice nella casella Fattore e fare clic su OK, che porta ai risultati dell'analisi statistica (Figura supplementare 1Fii-1Fiii).

Risultati

Questa sezione mostra i risultati di un esperimento Flypub rappresentativo. I maschi di drosophila raramente corteggiano altri maschi^35,36. Durante la prima esposizione all'etanolo, i maschi di tipo selvaggio Canton-S (CS) hanno mostrato un piccolo ma insignificante aumento del corteggiamento intermale disinibito³¹ (Figura 7A). Tuttavia, i maschi CS hanno mostrato l'aumento aumentato dell'attività di corteggiamento disinibita nelle successive esposizioni all'etanolo (ANOVA GLM, CS: R²0,83, F_(5,66) 65,21, p < 0,0001; n - 12; Figura 7A), che indica la sensibilizzazione comportamentale all'effetto disinibizione dell'etanolo. Abbiamo dimostrato in precedenza che questo tipo di EIBS richiede dopamina e il recettore della dopamina DopEcR nei neuroni dei funghi^31,32.

Per identificare se sono coinvolti ulteriori neuromodulatori nell'EIBS, abbiamo studiato il ruolo dell'OA testando le mosche (th; nM18 null allele)^37,38 prive di tirofina e idrossilasi, l'enzima-tasso che limita nella biosintesi OA, quindi carente nell'OA. Imaschi di Cs CS (un gentile dono del Dr. Andreas Thum, Università di Lipsia, Germania) hanno mostrato la risposta di corteggiamento disinibita sensibilizzata alle esposizioni quotidiane di etanolo (ANOVA GLM, th: R²,67, F_(5,66) 27,60, p < 0.0001; n - 12; Figura 7B) ma al livello ridotto rispetto a CS (ANOVAGLM, effetto di interazione: F - 2,50, p <0.034). Al momento dell'analisi post-hoc, i maschi di t-hhanno mostrato livelli più bassi di corteggiamento intermale ad ogni esposizione che è più evidente durante la quarta e la sesta esposizione all'etanolo rispetto a CS (due campioni t-test: p < 0.002 in EXP4, p < 0,004 in EXP5, p < 0.021 in EXP6;h n - 12; Figura 7C). Insieme, questi risultati indicano che l'OA può svolgere un ruolo nell'EIBS per l'effetto disinibizione dell'etanolo. Ancora più importante, questi set di dati dimostrano chiaramente l'utilità e l'efficacia del saggio Flypub nello studio della disinibizione e della sensibilizzazione indotta dall'etanolo.

Figura 1: flusso di lavoro di assaggio Flypub. Diagramma del flusso di lavoro che evidenzia i passaggi chiave per l'esecuzione del test Flypub. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Materiali da camera Flypub e assemblaggio. (A) I materiali necessari per costruire una camera Flypub includono (i) hot glue gun glue stick, (ii) pistola a colla a caldo, (iii) lama di rasoio, (iv) saldatura ferro, (v) righello,(vi) mesh, (vii) foglio di plastica in policarbonato, e (viii) bottiglia di Drosophila rotondo-basso. (B) Rappresentazione schematica dell'assemblea della camera Flypub. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esposizione all'etanolo. (A) Una stazione Flypub completamente assemblata. (B) I materiali necessari per l'esposizione all'etanolo includonolamicropipetta P1000, (ii) nastro adesivo, (iii) batuffolo diviiicotone, (iv) Petri piatto, (v) salviette da laboratorio, (vi) piccolo imbuto, (vii) timer di medie dimensioni, (ix) mouse pad, (x) forbici, (xi) 95% etanolo, (xii) pinze e (xiii) spatula. (C) Passi su come tagliare i batuffoli di cotone. (D) Immagine di visualizzazione superiore dei pub allineati sul palco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Configurazione video per il punteggio comportamentale. Mostrato è la guida passo-passo su (A) come ingrandire il video e (B) come inserire il file del codice di tempo nel lettore multimediale VLC per il punteggio comportamentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Comportamenti di corteggiamento maschile. Le immagini rappresentative illustrano i comportamenti di corteggiamento maschile della Drosophila, tra cui la successiva e unilaterale estensione dell'ala per (A) canzone di corteggiamento, (B) circodiamministrazione di corteggiamento, (C) curvatura addominale (D) e (E)montaggio che vengono utilizzati per il punteggio comportamentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Inserimento e analisi dei dati. (A) Il numero di maschi impegnati nel corteggiamento in ogni blocco temporale di 10 s è trascritto in un foglio di lavoro. Il maggior numero di maschi di corteggiamento di tre blocchi temporali consecutivi di 10 s (freccia verde) viene utilizzato come punto dati rappresentativo. La media di 10 punti dati consecutivi (parentesi blu o arancione) con il valore massimo rappresenta la percentuale di corteggiamento intermaschile per pub [parentesi arancione; MAX (media), freccia nera] . (B, C) Le formule del foglio di lavoro utilizzate per calcolare il punto dati rappresentativo massimo e la media massima di 10 punti dati rappresentativi consecutivi per pub. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Disinibizione comportamentale indotta dall'etanolo e sensibilizzazione in CS e th. (A,B) I maschi CS e th mostravano disinibizione di corteggiamento sensibilizzata con ripetute esposizioni all'etanolo (ANOVA GLM, CS: R²-0,83, F_(5,66)65,21, p < 0,0001; th: R²0,67, F_(5,66)27,60, p < 0,0001; n - 12). (C) I maschi di t-hhanno mostrato un corteggiamento meno disinibito rispetto a CS (n. 12).h I valori p delle analisi post hoc sono mostrati sopra la riga. L'attività di corteggiamento intermaschile è stata analizzata dai video generati per ogni esposizione all'etanolo. Tutti i dati sono segnalati come mezzi : errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Analisi statistica. I passaggi del software Minitab 17 su come eseguire il test di normalità (A), (B) impilando i dati, (C) Modello lineare ANOVA test, (D) Test t a due campioni, (E) Mann-Whitney test e (F) Kruskal-Wallis test. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

In questa relazione, abbiamo descritto l'impostazione e il protocollo dettagliato del saggio Flypub; un nuovo metodo per misurare come l'esposizione ricorrente all'etanolo innesca il corteggiamento disinibito e la sensibilizzazione comportamentale. Anche se il test Flypub è relativamente semplice, diversi passaggi richiedono attenzione e attenzione per garantire risultati affidabili. In primo luogo, le mosche per il test devono essere completamente pigmentate (cioè mosche adulte completamente sviluppate), sane e intatte. Le deformità o i danni, in particolare nelle ali o nelle gambe, possono influenzare la capacità del maschio di corteggiare. In secondo luogo, l'età di mosca è importante e deve essere abbinata tra i gruppi di controllo e sperimentali (età ottimale: 3-5 giorni di età all'esposizione all'etanolo 1). Due settimane e mosche maschili di tipo selvatico più anziani tendono a visualizzare i livelli elevati di corteggiamento disinibito³¹. Pertanto, una corretta corrispondenza di età dei moscerini in fase di studio è essenziale per evitare risultati variabili. In terzo luogo, il numero di mosca per pub è vitale (ottimale: 33 per pub). Il numero di voli più bassi o più alti per pub può inclinare notevolmente i punteggi di corteggiamento (dati non mostrati). In quarto luogo, le camere Flypub devono avere volumi identici come illustrato nella figura 2B. Ciò garantisce che le mosche ricevano vapore etanolo in modo sincrono e che i comportamenti suscitati siano coerenti. In quinto luogo, la registrazione video chiara e il punteggio preciso del corteggiamento sono essenziali. Questo protocollo dipende fortemente dalle osservazioni comportamentali, quindi l'osservanza meticolosa al protocollo standardizzato del punteggio del corteggiamento è fondamentale per ridurre al minimo i risultati incoerenti. Infine, si raccomanda vivamente di eseguire alla cieca sia l'esposizione all'etanolo che le fasi di punteggio del corteggiamento, quando uno sperimentatore non è a conoscenza di genotipi di mosca o di trattamenti sperimentali, prevenendo così pregiudizi sperimentali.

Il saggio Flypub ha molteplici vantaggi. In primo luogo, più gruppi di mosche possono essere testati e confrontati contemporaneamente. In secondo luogo, è poco costoso, semplice da configurare e facile da imparare, il che lo rende altamente suscettibile di sperimentatori a tutti i livelli, tra cui elementari attraverso le scuole superiori, studenti universitari e laureati, post-dottorati e docenti, nonché laboratori di insegnamento con spazio limitato e budget. In terzo luogo, può essere utilizzato per misurare comportamenti aggiuntivi come il corteggiamento disinibito delle mosche femminili e l'effetto sedativo dell'etanolo o di altri sedativi per valutare lo sviluppo e la manutenzione iniziale di sensibilità e tolleranza^31,32. Insieme, il Flypub è un metodo versatile per studiare diverse caratteristiche di AUD.

La principale limitazione del test Flypub è il rigoroso e laborioso regime di punteggio di corteggiamento. Il comportamento di corteggiamento sotto l'influenza dell'etanolo è altamente dinamico in un modo che la durata del corteggiamento varia da meno di un secondo a molti minuti e le mosche impegnate nel corteggiamento cambiano spesso. Il regime di punteggio qui presentato è stato sviluppato per incorporare questa natura dinamica e per fornire punteggi coerenti sulle esposizioni individuali all'etanolo per un determinato genotipo^31,32. Come indicato nel protocollo, l'attività di corteggiamento viene valutata manualmente, il che richiede molto tempo. Diversi programmi di punteggio automatizzati sono stati sviluppati per facilitare lo screening comportamentale imparziale ad alta velocità e tutti si basano sui movimenti e posizioni dei singoli moscerini^{39,40,41,42,43,44,45}. Abbiamo anche tentato di sviluppare un software per computer per contare automaticamente l'attività di corteggiamento, ma non siamo riusciti a ottenere risultati coerenti e affidabili. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che il punteggio comportamentale include più passaggi di corteggiamento (cioè, a seguito di un'estensione unilaterale dell'ala, flessione addominale e montaggio)^35,36,46 delle mosche multiple contemporaneamente. Anche con questa limitazione, uno sperimentatore con una formazione adeguata dovrebbe essere in grado di quantificare i comportamenti di corteggiamento indotti dall'etanolo con coerenza e precisione. Ciò nonostante, sarebbe di grande aiuto e importanza adottare l'apprendimento automatico o altri algoritmi avanzati come follow-up.

Simile ai modelli di roditori, gli studi sull'etanolo nel modello fly si sono in gran parte concentrati sugli effetti locomotori e sedativi dell'etanolo. Il test Flypub, tuttavia, misura il corteggiamento disinibito, un tipo di disinibizione cognitiva che è un romanzo^31,32. Pertanto, il Flypub può aiutare a chiarire i giocatori molecolari, le vie cellulari e i circuiti neurali, nonché i fattori di rischio (ad esempio, età, sonno, dieta o ambiente sociale) critici per la disinibizione comportamentale e la sensibilizzazione. Abbiamo dimostrato in precedenza che la segnalazione della dopamina è necessaria per EIBS, che è in linea con i risultati nei modelli di roditori e soggetti umani^6,9,31. Anche come prova di concetto, abbiamo esaminato il mutante t-h privo di OA (la controparte invertebrata della noradrenalina) e abbiamo scoperto che l'OA è anche importante per la sensibilizzazione comportamentale all'effetto disinibizione dell'etanolo, anche se il suo contributo è relativamente piccolo rispetto a quello della dopamina³¹. Questa scoperta è in contrasto con l'osservazione da parte di Scholz⁴⁷ che le mosche mutanti di t-h non mostrano evidenti compromissione nella sensibilizzazione all'effetto di attivazione del locomotore dell'etanolo⁴⁷. Ciò suggerisce vie molecolari, cellulari e neurali distinte che mediano la sensibilizzazione comportamentale alla disinibizione rispetto all'attivazione locomotoria. Gli studi di follow-up dovrebbero collaborare ulteriormente a questa allettante nozione.

In sintesi, il Flypub è un metodo a basso costo, multiforme ed efficace per studiare le risposte comportamentali all'etanolo, in particolare la disinibizione e la sensibilizzazione comportamentale, che possono contribuire a far progredire la nostra comprensione dell'AUD e fornire informazioni sugli interventi efficaci per questo disturbo cronico.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
95 % Ethanol	VWR Chemicals	BDH1158-4LP
Canton-S	-	-	wild-type strain used as a control
Copy stand with arms	Kaiser	205411	model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds	Swisspers	COT-027	to deliver ethanol
Excel	Microsoft	-	to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb	Lights of America	7108N	maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software	Microsoft	-	version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio	Microsoft	Q2F-00013	1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17	Minitab	-	version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet	Sefar Nitex	-	model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes	Falcon	08-757-100A	35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size	Fisher scientific	10-348A	65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small	Fisher scientific	07-202-121	4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet	Lexan	-	0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle	Fisher scientific	AS115	polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron	Weller	WES51	to make a hole in a flypub
Time code	-	-	.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh)	-	-	mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player	VideoLAN	-	version 3.0.8; any media player can be used to score courtship