基于点击化学的载脂蛋白N-酰基转移酶荧光测定从酶表征到高通量筛选

摘要

这里介绍的是一种灵敏的荧光测定法，用于使用二酰基甘油肽和炔烃磷脂作为底物，通过点击化学来监测载脂蛋白N-酰基转移酶活性。

摘要

来自变形杆菌的脂蛋白在三种整合膜酶的作用下被源自膜磷脂的脂肪酸进行翻译后修饰，从而产生三酰化蛋白。脂蛋白修饰途径的第一步涉及将二酰基甘油基团从磷脂酰甘油转移到前脂蛋白上，从而产生二酰基甘油前脂蛋白。在第二步中，前脂蛋白的信号肽被裂解，形成载脂蛋白，而载脂蛋白又被源自磷脂的第三种脂肪酸修饰。最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）催化。脂蛋白修饰途径在大多数γ变形杆菌中是必不可少的，使其成为开发新型抗菌剂的潜在靶标。这里描述的是Lnt的灵敏测定，它与小抑制分子的高通量筛选兼容。酶和底物是膜嵌入的分子;因此，体外测试的开发并不简单。这包括在洗涤剂存在下纯化活性酶，炔磷脂和二酰基甘油肽底物的可用性，以及混合胶束中的反应条件。此外，为了在高通量筛选（HTS）设置中使用活性测试，直接读取反应产物优于偶联酶促反应。在该荧光酶测定中，炔烃-三酰化肽产物通过点击化学反应呈现荧光，并以多孔板形式进行检测。该方法适用于使用含脂肪酸底物的其他酰基转移酶，包括磷脂和酰基辅酶A。

引言

细菌脂蛋白的特征在于其氨基末端的共价结合脂肪酸，通过这些脂肪酸将它们锚定在膜^1，2中。蛋白质的成熟部分在结构和功能上高度多样化，从而解释了脂蛋白在细菌细胞包膜中各种生物过程中的作用。

脂蛋白在插入细胞质膜后被磷脂衍生的脂肪酸修饰。前脂肪蛋白包含一个标志性基序，即脂盒，它包含一个不变的半胱氨酸残基，该残基变成酰化和成熟蛋白质中的第一个氨基酸。该途径的第一步是由前脂蛋白磷脂酰甘油::d iacyl甘油转移酶（Lgt）催化的，其通过二酰基甘油和半胱氨酸之间的硫醚连接将二酰基甘油基团从磷脂酰甘油转移到前脂蛋白上。信号肽酶II（Lsp）从二酰基甘油前脂蛋白中切割信号肽，产生载脂蛋白，该载脂蛋白通过其二酰基甘油部分锚定在膜中。第三步也是最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）催化，该酶将脂肪酸从磷脂的 sn-1位置添加到载脂蛋白上，从而产生三酰化成熟脂蛋白（图1）³。Lnt反应是两步乒乓反应，其中形成稳定的硫酯酰基酶中间体。溶血磷脂副产物在反应的第二步载脂蛋白底物酰化之前释放。

磷脂底物特异性在Lnt测定中测定，基于N-酰基二酰基甘油肽在高百分比Tris-Tricine尿素^{SDS-PAGE 4}上的迁移率位移。具有小极性头基饱和[sn-1]和非饱和[sn-2]的磷脂是优选底物⁴。凝胶移位测定不适用于载脂蛋白N-酰基转移酶的广泛动力学研究，也不适用于HTS鉴定抑制分子。使用炔烃脂肪酸的点击化学已成功用于^{研究细菌中的}脂蛋白修饰5和真核生物6中的脂肪酸^代谢。最近，据报道，Ras 棕榈酰化的体外测定可鉴定抑制剂⁷。

在这里描述的方法中，洗涤剂中纯化的活性Lnt与混合胶束中的底物一起孵育以形成炔基 - 三酰化肽，随后通过荧光光谱法检测。

研究方案

1. 酶和底物制备

1. 酶的纯化
   1. 如^前所述，从洗涤剂溶解膜中产生和纯化Lnt酶4^，8。简而言之，诱导lnt-strep基因的表达，用C末端链球菌标签编码Lnt，OD₆₀₀为0.6，无水四环素（200ng / mL）在37°C下16小时。
   2. 通过以4，000× g 离心10分钟收获细胞并弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于缓冲液WA（20 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA）中至每mL 100 OD₆₀₀ 单位。
   4. 通过法国压力池压力机在 10，000 psi 下通过两次通道破碎细胞。
   5. 通过以13，000× g 离心20分钟来除去未破碎的细胞和碎片。保留上清液并丢弃沉淀。
   6. 将上清液以120，000× g 离心60分钟并收集膜囊泡（半透明的棕色颗粒）。弃去上清液。
   7. 在室温（RT）下用1%（w / v）正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM）在缓冲液WA中溶解膜沉淀中的整合膜蛋白30分钟。以120，000× g 离心并除去不溶性物质30分钟。使用上清液级分进行纯化。
   8. 如Nozeret等人8所述，在亲和色谱柱（见材料表）和S400凝胶过滤柱（见材料表）上纯化Lnt-strep^。
   9. 将纯化的酶储存在含有0.05%DDM和10%甘油的缓冲液WA中，温度为-80°C。
      注意:该酶可稳定保存5年以上。
2. 炔烃磷脂和生物素化成纤维细胞刺激配体（FSL-1-生物素）底物的制备
   1. 将 100 μL 定制合成的炔烃-POPE（1-十六烷基-15-炔酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，见 材料表）等分到 1.5 mL 管中。
   2. 用注射器刺穿试管，并在室温下以快速真空蒸发氯仿2小时。将干燥的磷脂样品储存在-20°C。
   3. 使用前将炔烃-POPE 溶解在 0.1% Triton X-100 中的 500 μM 中。如有必要，在室温超声水浴中加入3分钟的超声处理步骤以溶解炔烃-POPE。
   4. 将FSL-1-生物素重悬于水中，浓度为445μM。
      注意:两种溶液都可以在-20°C下储存至少2个月。

2. 试管检测

注意:在第1天，在1.5 mL管中设置Lnt反应（步骤2.1），并用链霉亲和素涂覆96孔板（步骤2.2）。

1. 试剂混合物的制备和酶促反应
   1. 对于标准 Lnt 测定，在 Lnt 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100，含 1% BSA）中以 18 μL 的最终体积在 1.5 mL 管中混合炔烃-POPE（来自 500 μM 储备液的最终 50 μM）和 FSL-1-生物素（来自 445 μM 储备液的终浓度为 50 μM）。执行所有条件一式三份。
   2. 将底物混合物（在步骤2.1.1中制备）在超声水浴中超声处理3分钟，并在加入Lnt酶（步骤2.1.3）之前在37°C下孵育5分钟。
      注意:MTSES（（2-磺乙基）甲硫代磺酸钠）是一种硫醇特异性试剂，可抑制Lnt⁸。向反应管（步骤2.1.1）中加入10mM MTSES（100mM储备溶液在100%DMSO中）用作阴性对照样品。调整Lnt反应缓冲液的体积，使总体积为18 μL。
   3. 加入活性（1 ng/μL，相当于 17.2 nM）或非活性 Lnt （C387S）（2 μL 10 ng/μL 储备液中含有 0.05% DDM）的缓冲液 WA），并通过上下移液与底物混合（步骤 2.1.2）。
   4. 将反应在37°C下在带加热盖的热混合器中孵育16小时。
2. 96孔板的链霉亲和素包被
   1. 在 H₂O 中制备 2 mg/mL 的链霉亲和素储备溶液。
      注意:该溶液可在-20°C下储存长达6个月。
   2. 从储备溶液中制备10 μg/mL链霉亲和素在水中作为工作溶液。向 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 溶液。通过在37°C下孵育过夜而不盖风干孔，将链霉亲和素结合到板上。

注意:在第2天进行点击化学（步骤2.3），将Lnt反应混合物结合到链霉亲和素包被的板（步骤2.4），并检测荧光并分析结果（步骤2.5）。

3. 咔嗒声化学反应
   1. 制备叠氮基-FAM（5 mM DMSO 溶液）、TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐;50 mM 在水中制备）、TBTA（三[（1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基）甲基]胺;2 mM 叔丁醇:DMSO （4:1））和 CuSO₄∙5H 2 O（50 mM 在 H₂O 中新鲜制备）的储备溶液。
   2. 在含有步骤2.1.4制备的Lnt反应混合物的1.5 mL管中，按以下顺序添加试剂进行点击化学:0.2 μL原液叠氮-FAM（终浓度50 μM），0.4 μL原液TCEP（终浓度1 mM），0.2 μL原液TBTA（终浓度0.02 mM）。
   3. 涡旋溶液5秒。然后加入 0.4 μL 原液_{CuSO 4} （终浓度 1 mM）。再次涡旋5秒。将样品在室温下在黑暗中孵育1小时。
4. Lnt反应混合物与链霉亲和素包被板的结合
   1. 用200μLPBS-T1（PBS含有0.05%吐温-20）从步骤2.2.2孵育3x过夜后洗涤链霉亲和素包被板的孔。
      注意:链霉亲和素板可以立即使用或在4°C干燥储存。
   2. 将步骤 2.3.3 中的点击化学混合物中的 18 μL 转移到 96 孔链霉亲和素包被板中的孔中，并加入 100 μL PBS-T1 以将 N-酰基-FSL-1-生物素-FAM 产物结合到链霉亲和素板上。
   3. 使用生物素-荧光素（来自 DMSO 中 3.1 mM 储备液的 0.26 μM）作为链霉亲和素结合和荧光读数的阳性对照。
   4. 将板在室温下在温混合器中在黑暗中孵育1小时，以300rpm振荡。
   5. 使用多通道电动移液器对96孔板进行手动洗涤步骤，如下所示:用200μLPBS-T2（PBS含有1%吐温-20）洗涤6次，用移液器冲洗3次，用200μLPBS洗涤三次，用移液器冲洗三次。
5. 荧光检测和分析
   1. 加入 200 μL PBS，并在荧光酶标仪中记录 520 nm 处的荧光。将结果保存在电子表格软件中。
      注意:生物素荧光素用作链霉亲和素结合和520nm荧光检测的阳性对照。预计使用 0.26 μM 生物素荧光素可获得 30，000–40，000 A.U. 的可重现读数。所有样品一式三份分析，包括对照。
   2. 使用统计软件使用非配对t检验计算每个反应的标准偏差，并计算阴性对照和阳性样品的P值。

3. 多孔板检测

注意:在第1天，在384孔板中设置Lnt反应（步骤3.1），并用链霉亲和素涂覆384孔板（步骤3.2）。

1. 试剂混合物的制备和酶促反应
   注意:与试管测定相比，试剂和酶的数量减少，Lnt反应直接在384孔板中进行。这允许使用更少的材料并减少可以进一步自动化的步骤。
   1. 在Lnt反应缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.2，150mM NaCl，0.1%Triton X-100，含1%BSA）中以13.5μL的体积在Lnt反应缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.2，150mM NaCl，0.1%Triton X-100，含1%BSA）中以13.5μL的体积混合炔烃-POPE（来自500μM储备液的终浓度50μM）和FSL-1-生物素（来自500μM储备液的最终浓度）。执行所有条件一式三份。计算要执行的反应次数所需的试剂总量（即，一个 384 孔板为 5，184 μL）。
   2. 在超声波水浴中超声处理底物混合物3分钟。
   3. 在 384 孔板中每孔等分试样 13.5 μL 底物混合物。
      注意:作为阴性对照，每孔可添加10mM的MTSES（100%DMSO中的625mM储备溶液）。调节Lnt缓冲液的体积（步骤3.1.1）以达到13.5μL的最终反应体积。
   4. 在加入Lnt酶之前在37°C孵育5分钟（步骤3.1.5）。
   5. 向含有步骤 3.1.3 中反应混合物的每个孔中加入 0.5 ng/μL（相当于 8.6 nM）活性 Lnt 酶或非活性变体 （C387S）（1.5 μL，来自含有 0.05% DDM 的缓冲液 WA 中的 5 ng/μL 原液）。通过上下移液混合试剂。总反应体积为15μL。
   6. 用塑料箔密封板，用于多孔板。
   7. 在37°C下在带加热盖的热混合器中孵育16小时。
2. 链霉亲和素包衣 384 孔板
   1. 使用步骤 2.2.2 中的 75 μL 链霉亲和素（10 μg/mL 在 H₂O 中）包被 384 孔板的孔。让链霉亲和素结合到板上，在37°C下孵育过夜，没有盖子风干孔。

注意:在第2天进行点击化学（步骤3.3），将Lnt反应混合物结合到链霉亲和素包被的板（步骤3.4），检测荧光并分析结果（步骤3.5）。

3. 咔嗒声化学反应
   1. 制备叠氮基-FAM（1.2 mM DMSO 溶液）、TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐;在 H 2 O 中制备的 24 mM）、TBTA（三[（1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基）甲基]胺;0.48 mM 叔丁醇:DMSO （4:1））和 CuSO₄∙5H 2 O（24 mM 在 H₂O 中新鲜制备）的储备溶液。
   2. 组合三种点击化学试剂:叠氮基-FAM（终浓度 50 μM）、TCEP（1 mM 最终浓度）和 TBTA（0.02 mM 最终浓度）的混合物，每种试剂的混合物为 0.75 μL，最终体积为每孔 2.25 μL。计算每个 384 孔板所需的体积（即，当使用 384 孔板的所有孔时，使用 864 μL）。用力混合。
   3. 每孔加入 2.25 μL 试剂溶液，直接加入步骤 3.1.7 中完成的 Lnt 反应中。
   4. 用多通道电动移液器上下移液混合。
   5. 加入CuSO₄ （从24 mM原液中加入0.75 μL，终浓度为1 mM），并用多通道电动移液器上下移液混合。
   6. 在室温下在黑暗中孵育1小时。
4. Lnt反应混合物与链霉亲和素包被的384孔板结合
   1. 用85μL PBS-T1从步骤3.2.1 1x孵育过夜后洗涤链霉亲和素包被的板的孔。
   2. 将步骤3.3.6孵育板每个孔中的11μL点击化学反应转移到步骤3.4.1的链霉亲和素包被的板中，以将N-酰基-FSL-1-生物素-FAM产物结合到链霉亲和素板上。
   3. 加入 64 μL 缓冲液 PBS-T1。
   4. 包括生物素荧光素（来自DMSO中3.1mM储备液的0.19μM）作为与链霉亲和素包被孔结合的对照。
   5. 将384孔板在室温下在室温下在温混合器中孵育1小时，以300rpm振荡。
   6. 使用自动洗板机洗涤板，如下所示:用85μL PBS-T2洗涤10次，两次洗涤之间摇动板;用 85 μL PBS 洗涤 5 次，两次洗涤之间摇动板。
5. 荧光检测和分析
   1. 加入PBS（85μL）并在荧光酶标仪中记录535nm的荧光。
   2. 按所述分析数据（步骤2.5.2）。

结果

在Lnt反应中，来自磷脂的 sn-1脂肪酸被转移到二酰基甘油肽上，产生成熟的三酰化肽⁸。此处描述的体外Lnt测定旨在使用含有炔烃脂肪酸（炔烃-POPE）和FSL-1-生物素的磷脂作为底物，从而形成炔烃-FSL-1-生物素。在与叠氮基-FAM进行点击化学反应时，该产品应具有荧光标记并通过荧光光谱法检测（图2）。

优化反应条件，以在酶标仪中...

讨论

此处描述的Lnt测定方案基于三酰化产物的荧光检测，具有灵敏度和可重现性。生物素与链霉亲和素的特异性和有效结合是测定中的关键要素。Lnt反应完成后留下的炔烃-POPE底物也用FAM进行荧光标记，但在通过多个洗涤步骤结合到链霉亲和素板上后被有效去除。此外，添加DMSO不会影响Lnt活性，对测定没有影响。底物和酶都具有高度亲脂性，需要在混合胶束中进行反应条件。依赖可溶性酶和底物进行?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation