Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Резюме

Здесь представлен чувствительный флуоресцентный анализ для мониторинга активности аполипопротеина N-ацилтрансферазы с использованием диацилглицерилпептида и алкин-фосфолипидов в качестве субстратов с клик-химией.

Аннотация

Липопротеины из протеобактерий посттрансляционно модифицируются жирными кислотами, полученными из мембранных фосфолипидов под действием трех интегральных мембранных ферментов, в результате чего образуются триацилированные белки. Первый этап в пути модификации липопротеинов включает перенос диацилглицерильной группы из фосфатидилглицерина в пролипопротеин, что приводит к диацилглицериловому пролипопротеину. На второй стадии сигнальный пептид пролипопротеина расщепляется, образуя аполипопротеин, который в свою очередь модифицируется третьей жирной кислотой, полученной из фосфолипида. Эта последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt). Путь модификации липопротеинов имеет важное значение в большинстве γ-протеобактерий, что делает его потенциальной мишенью для разработки новых антибактериальных агентов. Здесь описан чувствительный анализ для Lnt, который совместим с высокопроизводительным скринингом малых ингибирующих молекул. Фермент и субстраты представляют собой мембранно-внедренные молекулы; поэтому разработка теста in vitro не является простой. Это включает в себя очистку активного фермента в присутствии моющего средства, наличие алкин-фосфолипидов и субстратов диацилглицерильных пептидов, а также условия реакции в смешанных мицеллах. Кроме того, чтобы использовать тест активности в высокопроизводительной системе скрининга (HTS), прямое считывание реакционного продукта предпочтительнее связанных ферментативных реакций. В этом флуорометрическом ферментном анализе алкин-триацилированный пептидный продукт становится флуоресцентным посредством реакции щелчка-химии и обнаруживается в формате многоязычной пластины. Этот способ применим к другим ацилтрансферазам, в которых используются субстраты, содержащие жирные кислоты, включая фосфолипиды и ацил-КоА.

Введение

Бактериальные липопротеины характеризуются ковалентно связанными жирными кислотами на их амино-концах, через которые они закрепляются в мембранах ^1,2. Зрелая часть белка очень разнообразна по структуре и функции, тем самым объясняя роль липопротеинов в различных биологических процессах в оболочке бактериальной клетки.

Липопротеины модифицируются жирными кислотами, полученными из фосфолипидов, после введения в цитоплазматическую мембрану. Пролипопротеины содержат фирменный мотив, липобокс, который содержит инвариантный остаток цистеина, который становится ацилированным и первой аминокислотой в зрелом белке. Первая стадия этого пути катализируется пролипопротеином фосфатидилглицерином: :d яцилглицерилтрансферазой (Lgt), которая переносит диацилглицерильную группу из фосфатидилглицерина в пролипопротеин через тиоэтерную связь между диацилглицерилом и цистеином. Сигнальная пептидаза II (Lsp) расщепляет сигнальный пептид от диацилглицерильного пролипопротеина, в результате чего образуется аполипопротеин, который закрепляется в мембране через его диацилглицерильный фрагмент. Третья и последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt), которая добавляет жирную кислоту из положения sn-1 фосфолипида на аполипопротеин, в результате чего образуется триацилированный зрелый липопротеин (рисунок 1)³. Реакция Lnt представляет собой двухступенчатую реакцию пинг-понга, в которой образуется стабильный промежуточный продукт тиоэфирного ацилового фермента. Побочный продукт лизофосфолипида высвобождается до ацилирования аполипопротеинового субстрата на второй стадии реакции.

Специфичность фосфолипидного субстрата определяется в анализе Lnt на основе сдвига подвижности N-ацилдиацилглицерилового пептида на высоком процентном содержании Tris-Tricine Urea SDS-PAGE⁴. Фосфолипиды с небольшими полярными головными группами, насыщенными [sn-1] и ненасыщенными [sn-2], были предпочтительными субстратами⁴. Анализ сдвига геля не подходит для обширных кинетических исследований аполипопротеина N-ацилтрансферазы или для HTS для идентификации ингибирующих молекул. Click-химия с использованием алкиновых жирных кислот была успешно использована для изучения модификации липопротеинов у бактерий⁵ и метаболизма жирных кислот у эукариот⁶. Недавно сообщалось, что анализ пальмитоилирования Ras пальмитоилирования in vitro выявил ингибиторы⁷.

В способе, описанном здесь, очищенный активный Lnt в моющем средстве инкубируют с субстратами в смешанных мицеллах с образованием алкин-триацилированного пептида, который впоследствии обнаруживается флуоресцентной спектрометрией.

протокол

1. Ферментная и субстратная подготовка

1. Очистка фермента
   1. Производят и очищают фермент Lnt от моющих солюбилизированных мембран, как описано ранее ^4,8. Вкратце, индуцируют экспрессию гена lnt-стрептокка, кодирующего Lnt с помощью С-концевой стрептококковой метки, при OD₆₀₀ 0,6 безводным тетрациклином (200 нг/мл) при 37 °C в течение 16 ч.
   2. Собирайте клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 10 мин и выбрасывайте супернатант.
   3. Повторное суспендирование ячейки гранулы в буфере WA (20 мМ Tris-HCl pH 8, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА) до 100_{OD 600} единиц на мл.
   4. Разбейте ячейки двумя проходами через французский пресс нажимной ячейки при 10 000 фунтов на квадратный дюйм.
   5. Удалите неповрежденные клетки и мусор центрифугированием при 13 000 х г в течение 20 мин. Сохраните супернатант и выбросьте гранулу.
   6. Центрифугируют супернатант при 120 000 х г в течение 60 мин и собирают мембранные везикулы (полупрозрачные гранулы коричневого цвета). Выбросьте супернатант.
   7. Солюбилизируют интегральные мембранные белки из мембранной гранулы с 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозидом (ДДМ) в буфере WA в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга и удаление нерастворимого материала при 120 000 х г в течение 30 мин. Используйте надводную фракцию для очистки.
   8. Очистите Lnt-стрептококк на колонке аффинной хроматографии (см. Таблицу материалов) и колонне фильтрации геля S400 (см. Таблицу материалов), как описано Nozeret et al.8.
   9. Хранят очищенный фермент в буфере WA, содержащем 0,05% DDM и 10% глицерина при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент стабилен более 5 лет.
2. Получение алкин-фосфолипидных и биотинилированных субстратов фибробласт-стимулирующего лиганда (FSL-1-биотина)
   1. Аликвота 100 мкл специально синтезированного алкина-ПАПЫ (1-гексадек-15-иноил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, см. Таблицу материалов) солюбилизируется в хлороформе в пробирки по 1,5 мл.
   2. Проткните трубки шприцем и испарите хлороформ в скоростном вакууме при РТ в течение 2 ч. Хранить сухие образцы фосфолипидов при температуре -20 °C.
   3. Растворяют алкин-ПОУП в 0,1% Тритоне Х-100 при 500 мкМ перед применением. Добавьте 3-минутный этап обработки ультразвуком на водяной бане в RT для солюбилизации алкина-POPE при необходимости.
   4. Повторное суспендирование FSL-1-биотина в воде при 445 мкМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба раствора можно хранить при температуре -20 °C в течение не менее 2 месяцев.

2. Трубчатый анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день устанавливают реакцию Lnt в пробирках объемом 1,5 мл (стадия 2.1) и покрывают 96 пластин скважин стрептавидином (стадия 2.2).

1. Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
   1. Для стандартного анализа Lnt смешайте алкин-POPE (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 445 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) при конечном объеме 18 мкл в пробирках 1,5 мл. Выполняйте все условия в трех экземплярах.
   2. Соникировать субстратную смесь (приготовленную на стадии 2.1.1) в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане и инкубировать при 37°С в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 2.1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: MTSES (натрий (2-сульфонатоэтил)метанетиосульфонат), тиол-специфический реагент, ингибирует Lnt⁸. Добавьте 10 мМТЭС (100 мМ запасного раствора в 100% ДМСО) в реакционные трубки (этап 2.1.1), которые будут использоваться в качестве отрицательных контрольных образцов. Отрегулируйте объем реакционного буфера Lnt таким образом, чтобы общий объем составлял 18 мкл.
   3. Добавляют активный (1 нг/мкл, соответствующий 17,2 нМ) или неактивный Lnt (C387S) (2 мкл 10 нг/мкл запаса в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) и смешивают с подложками (стадия 2.1.2) путем пипетки вверх и вниз.
   4. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
2. Стрептавидиновое покрытие 96 плит скважин
   1. Готовят стоковый раствор стрептавидина по 2 мг/мл в_H2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при -20 °C до 6 месяцев.
   2. Из исходного раствора готовят 10 мкг/мл стрептавидина в воде в качестве рабочего раствора. Добавьте 100 мкл раствора в каждую лунку 96-луночной пластины. Связывают стрептавидин с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.

ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 2.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 2.4), а также обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 2.5).

3. Щелк-химическая реакция
   1. Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (5 мМ в ДМСО), TCEP (Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 50 мМ, приготовленный в воде), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 2 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO₄∙_5H2O(50 мМ свежеприготовленный в_H2O).
   2. В пробирках объемом 1,5 мл, содержащих реакционную смесь Lnt, приготовленную на стадии 2.1.4, выполняют щелк-химию путем добавления реагентов в следующем порядке: 0,2 мкл запаса Азидо-ФАМ (конечная концентрация 50 мкМ), 0,4 мкл запаса TCEP (конечная концентрация 1 мМ), 0,2 мкл запаса TBTA (конечная концентрация 0,02 мМ).
   3. Вихрь раствора в течение 5 с. Затем добавляют 0,4 мкл запаса CuSO₄ (конечная концентрация 1 мМ). Вихрь снова в течение 5 с. Инкубируют образцы в темноте при RT в течение 1 ч.
4. Связывание реакционной смеси Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином
   1. Промывайте лунки пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 2.2.2 3x с 200 мкл PBS-T1 (PBS, содержащий 0,05% Tween-20).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины стрептавидина можно использовать немедленно или хранить в сухом виде при температуре 4 °C.
   2. Перенесите 18 мкл из щелково-химической смеси со стадии 2.3.3 в скважину в пластине, покрытой стрептавидином, из 96 скважин и добавьте 100 мкл PBS-T1 для связывания N-ацил-FSL-1-биотина-FAM продукта со стрептавидиновыми пластинами.
   3. Используйте биотин-флуоресцеин (0,26 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и считывания флуоресценции.
   4. Инкубировать пластины на RT в течение 1 ч в темноте в термомиксаторе, встряхивая при 300 об/мин.
   5. Выполните этапы ручной мойки 96 плит скважины с помощью многоканальной электронной пипетки следующим образом: шесть промывок с 200 мкл PBS-T2 (PBS, содержащий 1% Tween-20), три промывки пипеткой, три промывки с 200 мкл PBS, три промывки с пипеткой.
5. Обнаружение и анализ флуоресценции
   1. Добавьте 200 мкл PBS и запишите флуоресценцию при 520 нм в считывателе флуоресцентных микропластин. Сохраняйте результаты в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-флуоресцеин используется в качестве положительного контроля для связывания стрептавидина и обнаружения флуоресценции при 520 нм. Ожидается воспроизводимое считывание 30 000–40 000 а.е. с 0,26 мкМ биотин-флуоресцеина. Все образцы анализируются в трех экземплярах, включая контрольные.
   2. Рассчитайте стандартное отклонение для каждой реакции и рассчитайте P-значения для отрицательных контрольных и положительных образцов с помощью непарного t-теста с использованием статистического программного обеспечения.

3. Многоязычный пластинчатый анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: На 1-й день наладили реакцию Lnt в 384 плитах скважины (стадия 3.1) и покрыли 384 пластины скважин стрептавидином (этап 3.2).

1. Приготовление смеси реагентов и ферментативная реакция
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество реагентов и фермента уменьшается по сравнению с трубчатым анализом, и реакция Lnt выполняется непосредственно в 384 пластинах скважины. Это позволяет использовать меньше материала и сократить шаги, которые могут быть дополнительно автоматизированы.
   1. Смешайте субстраты следующим образом: алкин-ПОУП (конечная концентрация 50 мкМ из запаса 500 мкМ) и FSL-1-биотин (конечные 50 мкМ из запаса 500 мкМ) в реакционном буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% тритона X-100, содержащего 1% BSA) в объеме 13,5 мкл на реакцию на скважину в формате пластины 384 лунки. Выполняйте все условия в трех экземплярах. Рассчитать общее количество реагентов, необходимых для количества реакций, которые должны быть выполнены (т.е. 5 184 мкл на одну пластину скважины 384).
   2. Наносите ультразвуком субстратную смесь в течение 3 мин на ультразвуковой водяной бане.
   3. Аликвота 13,5 мкл субстратной смеси на скважину в плите 384 скважины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отрицательного контроля на скважину можно добавить 10 мМТЭС (625 мМ запасного раствора в 100% ДМСО). Отрегулируйте объем буфера Lnt (шаг 3.1.1) для достижения конечного реакционного объема 13,5 мкл.
   4. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин до добавления фермента Lnt (стадия 3.1.5).
   5. Добавьте 0,5 нг/мкл (что соответствует 8,6 нМ) активного фермента Lnt или неактивный вариант (C387S) (1,5 мкл из запаса 5 нг/мкл в буфере WA, содержащем 0,05% DDM) в буфере Lnt (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) к каждой скважине, содержащей реакционную смесь со стадии 3,1.3. Смешайте реагенты путем пипетки вверх и вниз. Общий реакционный объем составляет 15 мкл.
   6. Запечатайте пластину пластиковой фольгой для многоскважинных пластин.
   7. Инкубировать при 37 °C в течение 16 ч в термомиксаторе с нагретой крышкой.
2. Стрептавидиновое покрытие 384 плиты скважины
   1. Используйте 75 мкл стрептавидина (10 мкг/мл в_H2O) со стадии 2.2.2 для покрытия скважин из 384 скважинной пластины. Пусть стрептавидин связывается с пластиной путем инкубации при 37 °C в течение ночи без крышки для воздушной сушки скважин.

ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день выполните химию щелчков (этап 3.3), свяжите реакционную смесь Lnt с пластинами, покрытыми стрептавидином (этап 3.4), обнаружите флуоресценцию и проанализируйте результаты (этап 3.5).

3. Щелк-химическая реакция
   1. Готовят исходные растворы Азидо-ФАМ (1,2 мМ в ДМСО), TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид; 24 мМ, приготовленные в_H2O), TBTA (Tris[(1-бензил-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина; 0,48 мМ в трет-бутаноле:DMSO (4:1)) и CuSO₄∙5H_2O(24 мМ, свежеприготовленные в_H2O).
   2. Смешайте три химических реагента: смесь Azido-FAM (конечная концентрация 50 мкМ), TCEP (конечная 1 мМ) и TBTA (конечная 0,02 мМ), каждая по 0,75 мкл в конечном объеме 2,25 мкл на лунку. Рассчитать необходимый объем на 384 плиты скважины (т.е. использовать 864 мкл при использовании всех скважин 384 плиты скважины). Энергично перемешать.
   3. Добавляют 2,25 мкл раствора реагента на скважину непосредственно к завершенной реакции Lnt в пластине 384 скважины со стадии 3.1.7.
   4. Смешивание путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
   5. Добавьте CuSO₄ (0,75 мкл из запаса 24 мМ для конечной концентрации 1 мМ) и перемешайте путем пипетки вверх и вниз с помощью многоканальной электронной пипетки.
   6. Инкубировать на RT в течение 1 ч в темноте.
4. Связывание реакционной смеси Lnt с 384 пластинами скважины со стрептавидиновым покрытием
   1. Промывайте колодцы пластин со стрептавидиновым покрытием после ночной инкубации со стадии 3.2.1 1x с 85 мкл PBS-T1.
   2. Перенесите 11 мкл реакции щелкающей химии из каждой лунки инкубационной пластины со стадии 3.3.6 на пластину, покрытую стрептавидином, со стадии 3.4.1 для связывания продукта N-ацил-FSL-1-биотин-FAM с пластинами стрептавидина.
   3. Добавьте 64 мкл буфера PBS-T1.
   4. Включить биотин-флуоресцеин (0,19 мкМ из запаса 3,1 мМ в ДМСО) в качестве контроля для связывания с скважинами, покрытыми стрептавидином.
   5. Инкубировать 384 пластины скважины на RT в течение 1 ч в темноте в термомикшере, встряхивая при 300 об/мин.
   6. Мойте пластины с помощью автоматизированной посудомоечной машины следующим образом: 10 стирок с 85 мкл PBS-T2, пластины встряхивают между промывками; 5 стирок с 85 мкл PBS, пластины встряхивают между стирками.
5. Обнаружение и анализ флуоресценции
   1. Добавьте PBS (85 мкл) и запишите флуоресценцию в считывателе флуоресцентных микропластин при 535 нм.
   2. Анализируйте данные, как описано (шаг 2.5.2).

Результаты

В реакции Lnt жирная кислота sn-1 из фосфолипидов переносится на диацилглицерилпептид, в результате чего образуется зрелый триацилированный пептид⁸. Анализ in vitro Lnt, описанный здесь, предназначен для использования фосфолипидов, содержащих алкиновую жирную кислоту (alkyne-POPE...

Обсуждение

Протокол для анализа Lnt, описанный здесь, основанный на флуоресцентном обнаружении триацилированного продукта, является чувствительным и воспроизводимым. Специфическое и эффективное связывание биотина со стрептавидином является ключевым элементом анализа. Субстрат Alkyne-POPE, оставший?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation