Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Riepilogo

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Abstract

Le lipoproteine dei proteobatteri sono modificate post-traduzionalmente dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi di membrana mediante l'azione di tre enzimi integrali di membrana, con conseguente proteine triacilate. Il primo passo nella via di modificazione della lipoproteina comporta il trasferimento di un gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina, con conseguente diacilgliceril prolipoproteina. Nella seconda fase, il peptide segnale della prolipoproteina viene scisso, formando un'apolipoproteina, che a sua volta viene modificata da un terzo acido grasso derivato da un fosfolipide. Quest'ultimo passaggio è catalizzato dall'apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt). La via di modificazione delle lipoproteine è essenziale nella maggior parte dei γ-proteobatteri, rendendola un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi agenti antibatterici. Qui è descritto un test sensibile per Lnt che è compatibile con lo screening ad alto rendimento di piccole molecole inibitorie. L'enzima e i substrati sono molecole incorporate nella membrana; Pertanto, lo sviluppo di un test in vitro non è semplice. Ciò include la purificazione dell'enzima attivo in presenza di detergente, la disponibilità di alchino-fosfolipidi e substrati del peptide diacilglicerile e le condizioni di reazione nelle micelle miste. Inoltre, al fine di utilizzare il test di attività in una configurazione di screening ad alta produttività (HTS), la lettura diretta del prodotto di reazione è preferibile rispetto alle reazioni enzimatiche accoppiate. In questo saggio enzimatico fluorometrico, il prodotto peptidico alchino-triacilato viene reso fluorescente attraverso una reazione click-chimica e rilevato in un formato multipozzetto. Questo metodo è applicabile ad altre aciltransferasi che utilizzano substrati contenenti acidi grassi, inclusi fosfolipidi e acil-CoA.

Introduzione

Le lipoproteine batteriche sono caratterizzate da acidi grassi legati covalentemente ai loro amino-termini attraverso i quali sono ancorati nelle membrane ^1,2. La parte matura della proteina è molto diversificata nella struttura e nella funzione, spiegando così il ruolo delle lipoproteine in vari processi biologici nell'involucro cellulare batterico.

Le lipoproteine sono modificate dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi dopo l'inserimento nella membrana citoplasmatica. Le prolipoproteine contengono un motivo distintivo, il lipobox, che contiene un residuo di cisteina invariante che diventa acilato e il primo amminoacido nella proteina matura. Il primo passo di questa via è catalizzato dalla prolipoproteina fosfatidilglicerolo::d iacylglyceryl transferasi (Lgt), che trasferisce il gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina attraverso un legame tioetere tra diacilgliceril e cisteina. La peptidasi segnale II (Lsp) fende il peptide segnale dalla diacilgliceril prolipoproteina, risultando in un'apolipoproteina che è ancorata nella membrana attraverso la sua porzione di diacilglicerile. La terza e ultima fase è catalizzata dall'apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt), che aggiunge un acido grasso dalla posizione sn-1 del fosfolipide all'apolipoproteina, risultando in lipoproteina matura triacilata (Figura 1)³. La reazione Lnt è una reazione ping-pong in due fasi in cui si forma un intermedio enzima acilico tioestere stabile. Il sottoprodotto lisofosfolipide viene rilasciato prima dell'acilazione del substrato dell'apolipoproteina nella seconda fase della reazione.

La specificità del substrato fosfolipidico è determinata in un saggio Lnt basato sullo spostamento della mobilità del peptide N-acildiacilglicerile su un'alta percentuale di Tris-Tricine Urea SDS-PAGE⁴. I fosfolipidi con piccoli gruppi polari, saturi [sn-1] e non saturi [sn-2], erano substrati preferiti ⁴. Il test di spostamento del gel non è appropriato per studi cinetici approfonditi sull'apolipoproteina N-aciltransferasi né per HTS per identificare molecole inibitorie. La click-chemistry che utilizza acidi grassi alchini è stata utilizzata con successo per studiare la modificazione delle lipoproteine nei batteri⁵ e il metabolismo degli acidi grassi negli eucarioti⁶. Recentemente, è stato riportato un test in vitro di palmitoilazione di Ras per identificare gli inibitori⁷.

Nel metodo qui descritto, Lnt attivo purificato nel detergente viene incubato con substrati in micelle miste per formare peptide alchino-triacilato che viene successivamente rilevato mediante spettrometria di fluorescenza.

Protocollo

1. Preparazione di enzimi e substrati

1. Purificazione dell'enzima
   1. Produrre e purificare l'enzima Lnt dalle membrane solubilizzate detergenti come descritto in precedenza ^4,8. In breve, indurre l'espressione del gene lnt-streptococco, che codifica per Lnt con un tag C-terminale Streptococco, a OD 600 di 0,6 con tetraciclina anidra (₂₀₀ ng/mL) a 37 °C per 16 ore.
   2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 x g per 10 minuti e scartare il surnatante.
   3. Risospendere il pellet cellulare nel tampone WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) a 100 OD₆₀₀ unità per ml.
   4. Rompere le celle di due passaggi attraverso una pressa a pressione francese a 10.000 psi.
   5. Rimuovere le cellule ininterrotte e i detriti mediante centrifugazione a 13.000 x g per 20 minuti. Conservare il surnatante e scartare il pellet.
   6. Centrifugare il surnatante a 120.000 x g per 60 minuti e raccogliere le vescicole della membrana (pellet traslucido di colore marrone). Scartare il surnatante.
   7. Solubilizzare le proteine integrali di membrana dal pellet di membrana con 1% (p/v) di n-Dodecil β-D-maltoside (DDM) in tampone WA per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare e rimuovere il materiale insolubilizzato a 120.000 x g per 30 minuti. Utilizzare la frazione surnatante per la purificazione.
   8. Purificare Lnt-strep su una colonna cromatografica di affinità (vedi Tabella dei materiali) e una colonna di filtrazione in gel S400 (vedi Tabella dei materiali) come descritto da Nozeret et ^al.8.
   9. Conservare l'enzima purificato in tampone WA contenente 0,05% DDM e 10% glicerolo a -80 °C.
      NOTA: L'enzima è stabile da oltre 5 anni.
2. Preparazione di substrati di alchino-fosfolipidi e leganti stimolanti i fibroblasti biotinilati (FSL-1-biotina)
   1. Aliquot 100 μL di alchino-POPE (1-esadec-15-ynoyl-2-oleoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, vedi Tabella dei materiali) solubilizzato in cloroformio in provette da 1,5 ml.
   2. Forare i tubi con una siringa ed evaporare il cloroformio in un thermovac a RT per 2 ore. Conservare i campioni di fosfolipidi secchi a -20 °C.
   3. Sciogliere alchino-POPE in Triton X-100 allo 0,1% a 500 μM prima dell'uso. Aggiungere una fase di sonicazione di 3 minuti in un bagno d'acqua ad ultrasuoni a RT per solubilizzare alchini-POPE, se necessario.
   4. Risospendere FSL-1-biotina in acqua a 445 μM.
      NOTA: Entrambe le soluzioni possono essere conservate a -20 °C per almeno 2 mesi.

2. Saggio del tubo

NOTA: Il giorno 1, impostare la reazione Lnt in tubi da 1,5 ml (punto 2.1) e rivestire 96 piastre di pozzetto con streptavidina (punto 2.2).

1. Preparazione della miscela di reagenti e reazione enzimatica
   1. Per un test Lnt standard, miscelare alchino-POPE (50 μM finale da 500 μM di stock) e FSL-1-biotina (concentrazione finale di 50 μM da uno stock di 445 μM) in tampone di reazione Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenente 1% BSA) ad un volume finale di 18 μL in provette da 1,5 ml. Eseguire tutte le condizioni in triplice copia.
   2. Sonicare la miscela di substrato (preparata al punto 2.1.1) per 3 minuti in bagnomaria ad ultrasuoni e incubare a 37 °C per 5 minuti prima dell'aggiunta dell'enzima Lnt (fase 2.1.3).
      NOTA: MTSES (sodio (2-sulfonatoetil)metantiosolfonato), un reagente specifico del tiolo, inibisce Lnt⁸. Aggiungere 10 mM MTSES (100 mM di soluzione madre in DMSO al 100%) alle provette di reazione (fase 2.1.1) da utilizzare come campioni di controllo negativi. Regolare il volume del tampone di reazione Lnt in modo che il volume totale sia di 18 μL.
   3. Aggiungere Lnt attivo (1 ng/μL, corrispondente a 17,2 nM) o inattivo (C387S) (2 μL di 10 ng/μL in tampone WA contenente 0,05% di DDM) e mescolare con i substrati (fase 2.1.2) mediante pipettaggio su e giù.
   4. Incubare la reazione a 37 °C per 16 h in un termomiscelatore con coperchio riscaldato.
2. Rivestimento in streptavidina di 96 piastre di pozzetto
   1. Preparare una soluzione madre di streptavidina a 2 mg/ml in H₂O.
      NOTA: Questa soluzione può essere conservata a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
   2. Dalla soluzione madre preparare 10 μg/ml di streptavidina in acqua come soluzione di lavoro. Aggiungere 100 μL della soluzione a ciascun pozzetto della piastra del pozzetto 96. Legare la streptavidina alla piastra incubando a 37 °C durante la notte senza coperchio per asciugare all'aria i pozzetti.

NOTA: Il giorno 2 eseguire la chimica dei clic (fase 2.3), legare la miscela di reazione Lnt a piastre rivestite di streptavidina (fase 2.4), rilevare la fluorescenza e analizzare i risultati (fase 2.5).

3. Reazione click-chimica
   1. Preparare soluzioni madre di Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato; 50 mM preparato in acqua), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina; 2 mM in terz-butanolo:DMSO (4:1)) e CuSO₄∙5H 2 O (50 mM appena preparato in H₂O).
   2. Nelle provette da 1,5 mL contenenti la miscela di reazione Lnt preparata al punto 2.1.4, eseguire la chimica a scatto aggiungendo i reagenti nel seguente ordine: 0,2 μL di Azido-FAM (concentrazione finale 50 μM), 0,4 μL di TCEP di stock TCEP (concentrazione finale 1 mM), 0,2 μL di TBTA di stock (concentrazione finale 0,02 mM).
   3. Vortice la soluzione per 5 s. Quindi aggiungere 0,4 μL di stock CuSO₄ (concentrazione finale 1 mM). Vortice di nuovo per 5 s. Incubare i campioni al buio a RT per 1 ora.
4. Legame della miscela di reazione Lnt a piastre rivestite di streptavidina
   1. Lavare i pozzetti delle piastre rivestite di streptavidina dopo l'incubazione notturna dal punto 2.2.2 3x con 200 μL di PBS-T1 (PBS contenente 0,05% Tween-20).
      NOTA: Le piastre di streptavidina possono essere utilizzate immediatamente o conservate asciutte a 4 °C.
   2. Trasferire 18 μL dalla miscela click-chimica dal punto 2.3.3 a un pozzetto in una piastra rivestita di streptavidina da 96 pozzetti e aggiungere 100 μL di PBS-T1 per legare il prodotto N-acil-FSL-1-biotina-FAM alle piastre di streptavidina.
   3. Utilizzare la biotina-fluoresceina (0,26 μM da uno stock di 3,1 mM in DMSO) come controllo positivo per il legame con la streptavidina e la lettura della fluorescenza.
   4. Incubare le piastre a RT per 1 ora al buio in un termomixer, agitando a 300 giri / min.
   5. Eseguire le fasi di lavaggio manuale delle piastre a 96 pozzetti con una pipetta elettronica multicanale come segue: sei lavaggi con 200 μL di PBS-T2 (PBS contenente 1% Tween-20), tre lavaggi con una pipetta, tre lavaggi con 200 μL di PBS, tre lavaggi con una pipetta.
5. Rilevazione e analisi della fluorescenza
   1. Aggiungere 200 μL di PBS e registrare la fluorescenza a 520 nm in un lettore di micropiastre a fluorescenza. Salva i risultati nel software per fogli di calcolo.
      NOTA: La biotina-fluoresceina viene utilizzata come controllo positivo per il legame della streptavidina e la rilevazione della fluorescenza a 520 nm. Si prevede una lettura riproducibile di 30.000-40.000 U.A. con 0,26 μM di biotina-fluoresceina. Tutti i campioni vengono analizzati in triplice copia, compresi i controlli.
   2. Calcola la deviazione standard per ogni reazione e calcola i valori P per i controlli negativi e i campioni positivi utilizzando il t-test spaiato utilizzando un software statistico.

3. Saggio su piastre multipozzetto

NOTA: Il giorno 1 impostare la reazione Lnt in 384 piastre di pozzetto (fase 3.1) e rivestire 384 piastre di pozzetto con streptavidina (fase 3.2).

1. Preparazione della miscela di reagenti e reazione enzimatica
   NOTA: La quantità dei reagenti e dell'enzima è ridotta rispetto al saggio del tubo e la reazione Lnt viene eseguita direttamente in piastre a 384 pozzetti. Ciò consente l'utilizzo di meno materiale e una riduzione dei passaggi che possono essere ulteriormente automatizzati.
   1. Miscelare i substrati come segue: alchino-POPE (concentrazione finale 50 μM da 500 μM di stock) e FSL-1-biotina (finale 50 μM da 500 μM di stock) in tampone di reazione Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 contenente 1% BSA) ad un volume di 13,5 μL per reazione per pozzetto in un formato a piastra a 384 pozzetti. Eseguire tutte le condizioni in triplice copia. Calcolare la quantità totale di reagenti necessaria per il numero di reazioni da eseguire (cioè 5.184 μL per una piastra da 384 pozzetti).
   2. Sonicare la miscela di substrato per 3 minuti a bagnomaria ad ultrasuoni.
   3. Aliquota 13,5 μL della miscela di substrato per pozzetto in una piastra da 384 pozzetti.
      NOTA: Come controllo negativo, è possibile aggiungere 10 mM di MTSES (625 mM di soluzione madre in DMSO al 100%) per pozzetto. Regolare il volume del tampone Lnt (punto 3.1.1) per raggiungere un volume di reazione finale di 13,5 μL.
   4. Incubare a 37 °C per 5 minuti prima dell'aggiunta dell'enzima Lnt (fase 3.1.5).
   5. Aggiungere 0,5 ng/μL (corrispondente a 8,6 nM) enzima Lnt attivo o variante inattiva (C387S) (1,5 μL da 5 ng/μL in tampone WA contenente 0,05% DDM) in tampone di reazione Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) a ciascun pozzetto contenente la miscela di reazione del punto 3.1.3. Miscelare i reagenti mediante pipettaggio su e giù. Il volume totale di reazione è di 15 μL.
   6. Sigillare la piastra con un foglio di plastica per piastre multipozzetto.
   7. Incubare a 37 °C per 16 h in un termomiscelatore con coperchio riscaldato.
2. Rivestimento in streptavidina 384 piastre per pozzetti
   1. Utilizzare 75 μL di streptavidina (10 μg/mL in H 2 O) dal punto2.2.2 per rivestire i pozzetti di una piastra da 384 pozzetti. Lasciare che la streptavidina si leghi alla piastra incubando a 37 °C durante la notte senza un coperchio per asciugare all'aria i pozzetti.

NOTA: Il giorno 2 eseguire la chimica dei clic (fase 3.3), legare la miscela di reazione Lnt a piastre rivestite di streptavidina (fase 3.4), rilevare la fluorescenza e analizzare i risultati (fase 3.5).

3. Reazione click-chimica
   1. Preparare soluzioni madre di Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato; 24 mM preparati in H 2 O), TBTA (Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina; 0,48 mM in terz-butanolo:DMSO (4:1)) e CuSO₄∙5H 2 O (24 mM appena preparati in H₂O).
   2. Combinare i tre reagenti click-chemistry: una miscela di Azido-FAM (concentrazione finale 50 μM), TCEP (1 mM finale) e TBTA (0,02 mM finale), ciascuno a 0,75 μL in volume finale di 2,25 μL per pozzetto. Calcolare il volume richiesto per piastra di pozzetto 384 (cioè, utilizzare 864 μL quando vengono utilizzati tutti i pozzetti della piastra del pozzo 384). Mescolare energicamente.
   3. Aggiungere 2,25 μL della soluzione di reagente per pozzetto direttamente alla reazione Lnt completata nella piastra a 384 pozzetti del punto 3.1.7.
   4. Miscelare mediante pipettaggio su e giù con una pipetta elettronica multicanale.
   5. Aggiungere CuSO₄ (0,75 μL da 24 mM di materiale per una concentrazione finale di 1 mM) e mescolare mediante pipettaggio su e giù con una pipetta elettronica multicanale.
   6. Incubare a RT per 1 ora al buio.
4. Legame della miscela di reazione Lnt a piastre da 384 pozzetti rivestite di streptavidina
   1. Lavare i pozzetti delle piastre rivestite di streptavidina dopo l'incubazione notturna dal punto 3.2.1 1x con 85 μL di PBS-T1.
   2. Trasferire 11 μL della reazione chimica a scatto da ciascun pozzetto della piastra di incubazione dal punto 3.3.6 alla piastra rivestita di streptavidina dal punto 3.4.1 per legare il prodotto N-acil-FSL-1-biotina-FAM alle piastre di streptavidina.
   3. Aggiungere 64 μL di tampone PBS-T1.
   4. Includere la biotina-fluoresceina (0,19 μM da uno stock di 3,1 mM in DMSO) come controllo per il legame ai pozzetti rivestiti di streptavidina.
   5. Incubare le piastre da 384 pozzetti a RT per 1 ora al buio in un termomiscelatore, agitando a 300 giri / min.
   6. Lavare le piastre utilizzando una lavapiastre automatica come segue: 10 lavaggi con 85 μL PBS-T2, le piastre vengono agitate tra un lavaggio e l'altro; 5 lavaggi con 85 μL di PBS, le piastre vengono agitate tra un lavaggio e l'altro.
5. Rilevazione e analisi della fluorescenza
   1. Aggiungere PBS (85 μL) e registrare la fluorescenza in un lettore di micropiastre a fluorescenza a 535 nm.
   2. Analizzare i dati come descritto (passaggio 2.5.2).

Risultati

Nella reazione Lnt l'acido grasso sn-1 dai fosfolipidi viene trasferito su un peptide diacilglicerile, risultando in^peptide triacilato 8 maturo. Il test Lnt in vitro qui descritto è progettato per utilizzare fosfolipidi contenenti un acido grasso alchino (alchino-POPE) e FSL-1-biotina come substrati, con conseguente formazione di alchino-FSL-1-biotina. Dopo una reazione chimica a scatto con azido-FAM, questo prodotto dovrebbe essere marcato con fluorescenza e rilevato mediante spettromet...

Discussione

Il protocollo per il saggio Lnt qui descritto, basato sulla rilevazione a fluorescenza del prodotto triacilato, è sensibile e riproducibile. Il legame specifico ed efficiente della biotina alla streptavidina è un elemento chiave nel test. Anche il substrato alchino-POPE rimasto dopo il completamento della reazione Lnt è marcato in modo fluorescente con FAM, ma viene rimosso in modo efficiente dopo il legame sulle piastre di streptavidina mediante più fasi di lavaggio. Inoltre, l'aggiunta di DMSO non influisce sull'at...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation