Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Resumen

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Resumen

Las lipoproteínas de proteobacterias son modificadas postraduccionalmente por ácidos grasos derivados de fosfolípidos de membrana por la acción de tres enzimas integrales de membrana, lo que resulta en proteínas triaciladas. El primer paso en la vía de modificación de la lipoproteína implica la transferencia de un grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína, lo que resulta en la prolipoproteína diacilglicerilo. En el segundo paso, el péptido señal de la prolipoproteína se escinde, formando una apolipoproteína, que a su vez es modificada por un tercer ácido graso derivado de un fosfolípido. Este último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt). La vía de modificación de lipoproteínas es esencial en la mayoría de las γ-proteobacterias, por lo que es un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos. Aquí se describe un ensayo sensible para Lnt que es compatible con el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas inhibidoras. La enzima y los sustratos son moléculas incrustadas en la membrana; Por lo tanto, el desarrollo de una prueba in vitro no es sencillo. Esto incluye la purificación de la enzima activa en presencia de detergente, la disponibilidad de sustratos de péptidos alquinos-fosfolípidos y diacilglicerilo, y las condiciones de reacción en micelas mixtas. Además, para utilizar la prueba de actividad en una configuración de cribado de alto rendimiento (HTS), se prefiere la lectura directa del producto de reacción sobre las reacciones enzimáticas acopladas. En este ensayo enzimático fluorométrico, el producto peptídico alquino-triacilado se vuelve fluorescente a través de una reacción de química de clic y se detecta en un formato de placa de múltiples pocillos. Este método es aplicable a otras aciltransferasas que utilizan sustratos que contienen ácidos grasos, incluidos los fosfolípidos y el acil-CoA.

Introducción

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por ácidos grasos unidos covalentemente en sus aminoácidos a través de los cuales se anclan en membranas ^1,2. La parte madura de la proteína es muy diversa en estructura y función, lo que explica el papel de las lipoproteínas en diversos procesos biológicos en la envoltura celular bacteriana.

Las lipoproteínas son modificadas por ácidos grasos derivados de fosfolípidos después de la inserción en la membrana citoplasmática. Las prolipoproteínas contienen un motivo característico, el lipobox, que contiene un residuo de cisteína invariante que se acila y el primer aminoácido en la proteína madura. El primer paso de esta vía es catalizado por la prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacilgliceril transferasa (Lgt), que transfiere el grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína a través de un enlace tioéter entre diacilglicerilo y cisteína. La peptidasa señal II (Lsp) escinde el péptido señal de la prolipoproteína diacilglicerilo, lo que resulta en una apolipoproteína que se ancla en la membrana a través de su fracción diacilglicerilo. El tercer y último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt), que agrega un ácido graso de la posición sn-1 del fosfolípido a la apolipoproteína, lo que resulta en una lipoproteína madura triacilada (Figura 1)³. La reacción Lnt es una reacción de ping-pong de dos pasos donde se forma un intermediario de enzima acilo tioéster estable. El subproducto lisofosfolípido se libera antes de la acilación del sustrato de apolipoproteína en el segundo paso de la reacción.

La especificidad del sustrato de fosfolípidos se determina en un ensayo Lnt basado en el cambio de movilidad del péptido N-acil diacilglicerilo en un alto porcentaje de Tris-Tricine Urea SDS-PAGE⁴. Los fosfolípidos con pequeños grupos polares, saturados [sn-1] y no saturados [sn-2], fueron sustratos preferidos ⁴. El ensayo de desplazamiento de gel no es apropiado para estudios cinéticos extensos de apolipoproteína N-aciltransferasa ni para HTS para identificar moléculas inhibidoras. La química de clics utilizando ácidos grasos alquinos se ha utilizado con éxito para estudiar la modificación de lipoproteínas en bacterias⁵ y el metabolismo de ácidos grasos en eucariotas⁶. Recientemente, se informó de un ensayo in vitro de palmitoilación de Ras para identificar inhibidores⁷.

En el método descrito aquí, el Lnt activo purificado en detergente se incuba con sustratos en micelas mixtas para formar un péptido alquino-triacilado que posteriormente se detecta mediante espectrometría de fluorescencia.

Protocolo

1. Preparación de enzimas y sustratos

1. Purificación de la enzima
   1. Producir y purificar la enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas detergentes como se describió anteriormente ^4,8. Brevemente, inducir la expresión del gen lnt-estreptococo, codificando Lnt con una etiqueta de estreptococo C-terminal, en OD 600 de 0,6 con tetraciclina anhidra (₂₀₀ ng/mL) a 37 °C durante 16 h.
   2. Recolectar células por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min y desechar el sobrenadante.
   3. Resuspender el pellet celular en tampón WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) a 100 OD₆₀₀ unidades por mL.
   4. Rompa las celdas en dos pasajes a través de una prensa de celda de presión francesa a 10,000 psi.
   5. Eliminar las células intactas y los residuos por centrifugación a 13.000 x g durante 20 min. Conservar el sobrenadante y desechar la bolita.
   6. Centrifugar el sobrenadante a 120.000 x g durante 60 min y recoger las vesículas de membrana (pellet translúcido de color marrón). Deseche el sobrenadante.
   7. Solubilizar las proteínas integrales de membrana del pellet de membrana con 1% (p/v) de n-dodecil β-D-maltósido (DDM) en tampón WA durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar y eliminar el material insolubilizado a 120.000 x g durante 30 min. Utilice la fracción sobrenadante para la purificación.
   8. Purificar Lnt-strep en una columna de cromatografía de afinidad (ver Tabla de materiales) y una columna de filtración de gel S400 (ver Tabla de materiales) como se describe en Nozeret et ^al.8.
   9. Almacene la enzima purificada en un tampón WA que contenga 0,05% de DDM y 10% de glicerol a -80 °C.
      NOTA: La enzima es estable durante más de 5 años.
2. Preparación de sustratos de ligando estimulante de fibroblastos alquinos-fosfolípidos y biotinilados (FSL-1-biotina)
   1. Alícuota 100 μL de alquino-POPE sintetizado a medida (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ver Tabla de materiales) solubilizado en cloroformo en tubos de 1.5 mL.
   2. Perforar los tubos con una jeringa y evaporar el cloroformo en una velocidad de aspiración a RT durante 2 h. Conservar las muestras secas de fosfolípidos a -20 °C.
   3. Disuelva el alquino-POPE en Triton X-100 al 0,1% a 500 μM antes de su uso. Agregue un paso de sonicación de 3 minutos en un baño de agua ultrasónico en RT para solubilizar alquino-POPE si es necesario.
   4. Resuspender FSL-1-biotina en agua a 445 μM.
      NOTA: Ambas soluciones pueden conservarse a -20 °C durante al menos 2 meses.

2. Ensayo de tubo

NOTA: El día 1, configure la reacción Lnt en tubos de 1,5 ml (paso 2.1) y cubra las placas de 96 pocillos con estreptavidina (paso 2.2).

1. Preparación de mezcla de reactivos y reacción enzimática
   1. Para un ensayo Lnt estándar, mezclar alquino-POPE (50 μM finales de 500 μM de stock) y FSL-1-biotina (concentración final de 50 μM de un stock de 445 μM) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 que contiene 1% BSA) a un volumen final de 18 μL en tubos de 1.5 mL. Realizar todas las condiciones por triplicado.
   2. Sonicar la mezcla de sustrato (preparada en el paso 2.1.1) durante 3 min en un baño maría ultrasónico e incubar a 37 °C durante 5 min antes de añadir la enzima Lnt (paso 2.1.3).
      NOTA: MTSES (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate de sodio), un reactivo específico de tiol, inhibe Lnt⁸. Añadir 10 mM MTSES (solución madre de 100 mM en DMSO al 100%) a los tubos de reacción (paso 2.1.1) para utilizarlos como muestras de control negativo. Ajuste el volumen del tampón de reacción Lnt para que el volumen total sea de 18 μL.
   3. Añadir Lnt activo (1 ng/μL, correspondiente a 17,2 nM) o inactivo Lnt (C387S) (2 μL de material de 10 ng/μL en tampón WA que contenga 0,05% DDM) y mezclar con los sustratos (paso 2.1.2) pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   4. Incubar la reacción a 37 °C durante 16 h en un termomezclador con tapa calentada.
2. Recubrimiento de estreptavidina de placas de 96 pocillos
   1. Preparar una solución madre de estreptavidina a 2 mg/ml en_H2O.
      NOTA: Esta solución puede conservarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
   2. A partir de la solución madre, prepare 10 μg / ml de estreptavidina en agua como solución de trabajo. Añadir 100 μL de la solución a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Unir la estreptavidina a la placa incubando a 37 °C durante la noche sin tapa para secar al aire los pocillos.

NOTA: El día 2 realice química de clic (paso 2.3), una la mezcla de reacción Lnt a las placas recubiertas de estreptavidina (paso 2.4) y detecte fluorescencia y analice los resultados (paso 2.5).

3. Reacción química de clic
   1. Preparar soluciones madre de Azido-FAM (5 mM en DMSO), TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; 50 mM preparado en agua), TBTA (Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 2 mM en terc-butanol:DMSO (4:1)), y CuSO₄∙5H₂O (50 mM recién preparado en_H2O).
   2. En los tubos de 1,5 ml que contienen la mezcla de reacción Lnt preparada en el paso 2.1.4, realice la química de clic añadiendo los reactivos en el siguiente orden: 0,2 μL de azido-FAM madre (concentración final 50 μM), 0,4 μL de TCEP madre (concentración final 1 mM), 0,2 μL de TBTA madre (concentración final 0,02 mM).
   3. Vórtice la solución durante 5 s. A continuación, añadir 0,4 μL de CuSO₄ (concentración final de 1 mM). Vórtice de nuevo durante 5 s. Incubar las muestras en la oscuridad a RT durante 1 h.
4. Unión de la mezcla de reacción Lnt a placas recubiertas de estreptavidina
   1. Lave los pocillos de las placas recubiertas de estreptavidina después de la incubación durante la noche a partir del paso 2.2.2 3x con 200 μL de PBS-T1 (PBS que contiene 0,05% de Tween-20).
      NOTA: Las placas de estreptavidina pueden utilizarse inmediatamente o conservarse secas a 4 °C.
   2. Transfiera 18 μL de la mezcla de química de clic del paso 2.3.3 a un pocil en una placa recubierta de estreptavidina de 96 pocillos y agregue 100 μL de PBS-T1 para unir el producto N-acil-FSL-1-biotina-FAM a las placas de estreptavidina.
   3. Utilice biotina-fluoresceína (0,26 μM de un stock de 3,1 mM en DMSO) como control positivo para la unión a estreptavidina y la lectura de fluorescencia.
   4. Incubar las placas a RT durante 1 h en la oscuridad en un termomezclador, agitando a 300 rpm.
   5. Realice los pasos de lavado manual de las placas de 96 pocillos con una pipeta electrónica multicanal de la siguiente manera: seis lavados con 200 μL de PBS-T2 (PBS que contiene 1% de Tween-20), tres lavados con una pipeta, tres lavados con 200 μL de PBS, tres lavados con una pipeta.
5. Detección y análisis de fluorescencia
   1. Agregue 200 μL de PBS y registre la fluorescencia a 520 nm en un lector de microplacas de fluorescencia. Guarde los resultados en el software de hoja de cálculo.
      NOTA: La biotina-fluoresceína se utiliza como control positivo para la unión a estreptavidina y la detección de fluorescencia a 520 nm. Se espera una lectura reproducible de 30.000-40.000 U.A. con 0,26 μM de biotina-fluoresceína. Todas las muestras se analizan por triplicado, incluidos los controles.
   2. Calcule la desviación estándar para cada reacción y calcule los valores P para controles negativos y muestras positivas utilizando la prueba t no pareada utilizando un software estadístico.

3. Ensayo de placa multipocillo

NOTA: El día 1 configurar la reacción Lnt en placas de 384 pocillos (paso 3.1) y cubrir 384 placas de pocillos con estreptavidina (paso 3.2).

1. Preparación de mezcla de reactivos y reacción enzimática
   NOTA: La cantidad de reactivos y enzimas se reduce en comparación con el ensayo de tubo y la reacción Lnt se realiza directamente en 384 placas de pocillos. Esto permite el uso de menos material y una reducción de pasos que pueden automatizarse aún más.
   1. Mezclar los sustratos de la siguiente manera: alquino-POPE (concentración final 50 μM de 500 μM stock) y FSL-1-biotina (50 μM finales de 500 μM stock) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 que contiene 1% BSA) a un volumen de 13.5 μL por reacción por pozo en un formato de placa de 384 pocillos. Realizar todas las condiciones por triplicado. Calcule la cantidad total de reactivos necesarios para el número de reacciones a realizar (es decir, 5.184 μL para una placa de 384 pocillos).
   2. Sonicar la mezcla de sustrato durante 3 minutos en un baño de agua ultrasónico.
   3. Alícuota 13,5 μL de la mezcla de sustrato por pocillo en una placa de 384 pocillos.
      NOTA: Como control negativo, se pueden agregar 10 mM de MTSES (solución madre de 625 mM en DMSO al 100%) por pocillo. Ajustar el volumen del tampón Lnt (paso 3.1.1) para alcanzar un volumen de reacción final de 13,5 μL.
   4. Incubar a 37 °C durante 5 min antes de la adición de la enzima Lnt (paso 3.1.5).
   5. Añadir 0,5 ng/μL (correspondiente a 8,6 nM) de enzima Lnt activa, o variante inactiva (C387S) (1,5 μL de 5 ng/μL en tampón WA que contiene 0,05% de DDM) en tampón de reacción Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) a cada pocillo que contenga la mezcla de reacción del paso 3.1.3. Mezclar los reactivos pipeteando hacia arriba y hacia abajo. El volumen total de reacción es de 15 μL.
   6. Selle la placa con lámina de plástico para placas de pocillos múltiples.
   7. Incubar a 37 °C durante 16 h en un termomezclador con tapa calentada.
2. Recubrimiento de estreptavidina 384 placas de pocillos
   1. Utilizar 75 μL de estreptavidina (10 μg/ml en_H2O) a partir del paso 2.2.2 para recubrir los pocillos de una placa de 384 pocillos. Deje que la estreptavidina se una a la placa incubando a 37 °C durante la noche sin tapa para secar al aire los pocillos.

NOTA: El día 2, realice la química de clic (paso 3.3), una la mezcla de reacción Lnt a las placas recubiertas de estreptavidina (paso 3.4), detecte fluorescencia y analice los resultados (paso 3.5).

3. Reacción química de clic
   1. Preparar soluciones madre de Azido-FAM (1,2 mM en DMSO), TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; 24 mM preparado en H2O), TBTA (Tris[(1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina; 0,48 mM en terc-butanol:DMSO (4:1)) y CuSO₄∙_5H2O(24 mM recién preparado en_H2O).
   2. Combine los tres reactivos de química de clic: una mezcla de Azido-FAM (concentración final 50 μM), TCEP (1 mM final) y TBTA (0,02 mM final), cada uno a 0,75 μL en volumen final de 2,25 μL por pocillo. Calcule el volumen requerido por placa de 384 pocillos (es decir, use 864 μL cuando se usen todos los pocillos de la placa de pocillos 384). Mezclar vigorosamente.
   3. Añadir 2,25 μL de la solución reactiva por pocillo directamente a la reacción Lnt completada en la placa de 384 pocillos del paso 3.1.7.
   4. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica multicanal.
   5. Añadir CuSO₄ (0,75 μL de material de 24 mM para una concentración final de 1 mM) y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica multicanal.
   6. Incubar a RT durante 1 h en la oscuridad.
4. Unión de la mezcla de reacción Lnt a placas de 384 pocillos recubiertas con estreptavidina
   1. Lavar los pocillos de las placas recubiertas de estreptavidina después de la incubación nocturna a partir del paso 3.2.1 1x con 85 μL PBS-T1.
   2. Transfiera 11 μL de la reacción química de clic de cada pocillo de la placa de incubación del paso 3.3.6 a la placa recubierta de estreptavidina del paso 3.4.1 para unir el producto N-acil-FSL-1-biotina-FAM a las placas de estreptavidina.
   3. Añadir 64 μL de tampón PBS-T1.
   4. Incluir biotina-fluoresceína (0,19 μM de un stock de 3,1 mM en DMSO) como control para la unión a pocillos recubiertos de estreptavidina.
   5. Incubar las 384 placas de pocillos a RT durante 1 h en la oscuridad en un termomezclador, agitando a 300 rpm.
   6. Lave las placas con una lavadora automática de placas de la siguiente manera: 10 lavados con 85 μL PBS-T2, las placas se agitan entre lavados; 5 lavados con 85 μL PBS, las placas se agitan entre lavados.
5. Detección y análisis de fluorescencia
   1. Agregue PBS (85 μL) y registre la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia a 535 nm.
   2. Analice los datos como se describe (paso 2.5.2).

Resultados

En la reacción Lnt, el ácido graso sn-1 de los fosfolípidos se transfiere a un péptido diacilglicerilo, lo que resulta en un péptido triacilado maduro⁸. El ensayo Lnt in vitro descrito aquí está diseñado para utilizar fosfolípidos que contienen un ácido graso alquino (alquino-POPE) y FSL-1-biotina como sustratos, lo que resulta en la formación de alquino-FSL-1-biotina. Tras una reacción química de clic con azido-FAM, este producto debe marcarse fluorescentemente y detectarse ...

Discusión

El protocolo para el ensayo Lnt descrito aquí, basado en la detección de fluorescencia del producto triacilado, es sensible y reproducible. La unión específica y eficiente de la biotina a la estreptavidina es un elemento clave en el ensayo. El sustrato de alquino-papa que queda después de completar la reacción Lnt también se marca fluorescentemente con FAM, pero se elimina de manera eficiente después de unirse a las placas de estreptavidina mediante múltiples pasos de lavado. Además, la adición de DMSO no afec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation