בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

Summary

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

Abstract

ליפופרוטאינים מפרוטאובקטריה משתנים לאחר תרגום על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים של הממברנה על ידי פעולה של שלושה אנזימי ממברנה אינטגרליים, וכתוצאה מכך חלבונים טריאצילטים. השלב הראשון במסלול שינוי ליפופרוטאין כרוך בהעברת קבוצת דיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך דיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין. בשלב השני, פפטיד האות של פרוליפופרוטאין נבקע, ויוצר אפוליפופרוטאין, אשר בתורו משתנה על ידי חומצת שומן שלישית הנגזרת מפוספוליפיד. שלב אחרון זה הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt). מסלול שינוי הליפופרוטאין חיוני ברוב הפרוטאובקטריה γ, מה שהופך אותו למטרה פוטנציאלית לפיתוח חומרים אנטיבקטריאליים חדשים. המתוארת כאן היא בדיקה רגישה עבור Lnt התואמת להקרנה בתפוקה גבוהה של מולקולות מעכבות קטנות. האנזים והסובסטרטים הם מולקולות משובצות ממברנה; לכן, הפיתוח של בדיקת מבחנה אינו פשוט. זה כולל טיהור של האנזים הפעיל בנוכחות דטרגנט, את הזמינות של אלקין-פוספוליפידים וסובסטרטים פפטידים diacylglyceryl, ואת תנאי התגובה במיזלים מעורבים. יתר על כן, על מנת להשתמש במבחן הפעילות במערך סינון בתפוקה גבוהה (HTS), עדיפה קריאה ישירה של מוצר התגובה על פני תגובות אנזימטיות מצומדות. בבדיקת אנזים פלואורומטרית זו, תוצר הפפטיד האלקין-טריאצטילטי הופך לפלואורסצנטי באמצעות תגובת קליק-כימיה ומזוהה בפורמט של צלחת מרובת בתים. שיטה זו ישימה לאצילטרנספראזות אחרות המשתמשות במצעים המכילים חומצות שומן, כולל פוספוליפידים ואציל-CoA.

Introduction

ליפופרוטאינים חיידקיים מאופיינים בחומצות שומן הקשורות באופן קוולנטי באמינו-טרמיני שלהם, שדרכן הם מעוגנים לממברנות ^1,2. החלק הבוגר של החלבון מגוון מאוד במבנה ובתפקוד, ובכך מסביר את תפקידם של ליפופרוטאינים בתהליכים ביולוגיים שונים במעטפת התא החיידקי.

ליפופרוטאינים משתנים על ידי חומצות שומן שמקורן בפוספוליפידים לאחר החדרתם לקרום הציטופלסמי. הפרוליפופרוטאינים מכילים מוטיב חתימה, הליפובוקס, המכיל שאריות ציסטאין אינווריאנטיות שהופכות לאצילציה וחומצת האמינו הראשונה בחלבון הבוגר. השלב הראשון של מסלול זה מזורז על ידי פרוליפופרוטאין פוספטידילגליצרול::d iacylglyceryl transferase (Lgt), אשר מעביר את קבוצת הדיאצילגליצריל מפוספטידילגליצרול אל הפרוליפופרוטאין באמצעות קישור תיואתר בין דיאצילגליצריל לציסטאין. אות פפטידאז II (Lsp) מבקע את פפטיד האות מדיאצילגליצריל פרוליפופרוטאין, והתוצאה היא אפוליפופרוטאין המעוגן לתוך הממברנה דרך הדיאצילגליצריל מואטי שלו. השלב השלישי והאחרון הוא זרז על ידי אפוליפופרוטאין N-acyltransferase (Lnt), אשר מוסיף חומצת שומן ממיקום sn-1 של פוספוליפיד על אפוליפופרוטאין, וכתוצאה מכך ליפופרוטאין בוגר טריאצילציה (איור 1)³. תגובת Lnt היא תגובת פינג-פונג דו-שלבית שבה נוצר אנזים תיואסטר אציל יציב. תוצר הלוואי של הליזופוספוליפידים משתחרר לפני האצילציה של מצע האפוליפופרוטאין בשלב השני של התגובה.

הספציפיות של המצע הפוספוליפידי נקבעת בבדיקת Lnt בהתבסס על תזוזת הניידות של N-אציל דיאצילגליצריל פפטיד על אחוז גבוה של Tris-Tricine Urea SDS-PAGE⁴. פוספוליפידים עם קבוצות ראש קוטביות קטנות, רוויים [sn-1] ולא רוויים [sn-2], היו מצעים מועדפים⁴. בדיקת הסטת הג'ל אינה מתאימה למחקרים קינטיים נרחבים של אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז וגם לא ל-HTS לזיהוי מולקולות מעכבות. כימיה של קליקים באמצעות חומצות שומן אלקין שימשה בהצלחה לחקר שינוי ליפופרוטאין בחיידקים⁵ ומטבוליזם של חומצות שומן באאוקריוטים⁶. לאחרונה דווח על בדיקה חוץ-גופית של Ras palmitoylation לזיהוי מעכבים⁷.

בשיטה המתוארת כאן, Lnt פעיל מטוהר בדטרגנט הוא דגירה עם מצעים ב micelles מעורבים כדי ליצור פפטיד alkyne-triacylated כי הוא זוהה לאחר מכן על ידי ספקטרומטריה פלואורסצנטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת אנזימים וסובסטרטים

1. טיהור אנזים
   1. לייצר ולטהר את אנזים Lnt מממברנות מסיסות דטרגנט כפי שתואר קודם לכן ^4,8. בקצרה, לגרום לביטוי של הגן lnt-strep, קידוד Lnt עם תג C-terminal Strep, ב OD 600 של 0.6 עם טטרציקלין נטול מים (₂₀₀ ng / mL) ב 37 °C במשך 16 שעות.
   2. קצירת תאים על ידי צנטריפוגה בגודל 4,000 x גרם למשך 10 דקות והשלכת הסופרנטנט.
   3. השהה את כדור התא במאגר WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA) ל-100 OD₆₀₀ יחידות למ"ל.
   4. לשבור את התאים על ידי שני מעברים דרך לחץ תא לחץ צרפתי ב 10,000 psi.
   5. הסר תאים רציפים ופסולת על ידי צנטריפוגה בגודל 13,000 x g למשך 20 דקות. שמור את הסופרנטנט והשלך את הכדור.
   6. צנטריפוגה supernatant ב 120,000 x גרם במשך 60 דקות ולאסוף את שלפוחית הממברנה (גלולה בצבע חום שקוף). השליכו את הסופר-נטנט.
   7. יש לבודד את חלבוני הממברנה האינטגרליים מכדור הממברנה עם 1% (w/v) n-דודציל β-D-מלטוזיד (DDM) במאגר WA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צנטריפוגה והסרה של חומר בלתי מבודד ב 120,000 x גרם למשך 30 דקות. השתמש בחלק העליון לטיהור.
   8. יש לטהר את Lnt-strep על עמודת כרומטוגרפיית זיקה (ראו טבלת חומרים) ועמודת סינון ג'ל S400 (ראו טבלת חומרים) כמתואר על ידי Nozeret et ^al.8.
   9. אחסנו את האנזים המטוהר ב-buffer WA המכיל 0.05% DDM ו-10% גליצרול בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: האנזים יציב למעלה מ-5 שנים.
2. הכנת מצעי ליגנד מגרה אלקין-פוספוליפידים וביוטינילציה פיברובלסטים (FSL-1-ביוטין)
   1. Aliquot 100 μL של אלקין-POPE מסונתז בהתאמה אישית (1-הקסדק-15-ינואיל-2-אולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין, ראו טבלת חומרים) מסולסל בכלורופורם לצינורות 1.5 מ"ל.
   2. חודרים את הצינורות עם מזרק ומאדים את הכלורופורם במהירות ב-RT למשך שעתיים. יש לאחסן את דגימות הפוספוליפידים היבשים בטמפרטורה של -20°C.
   3. יש להמיס את האלקין-POPE ב-0.1% Triton X-100 ב-500 μM לפני השימוש. הוסף שלב סוניקציה של 3 דקות באמבט מים קולי ב- RT כדי לבודד אלקיין-POPE במידת הצורך.
   4. יש למרוח את FSL-1-ביוטין במים בעוצמה של 445 מיקרומטר.
      הערה: ניתן לאחסן את שני הפתרונות בטמפרטורה של -20°C למשך חודשיים לפחות.

2. בדיקת צינור

הערה: ביום הראשון, הגדר את תגובת Lnt בצינורות 1.5 מ"ל (שלב 2.1) וצפה 96 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 2.2).

1. הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית
   1. עבור בדיקת Lnt סטנדרטית, יש לערבב אלקין-POPE (50 μM סופיים ממלאי של 500 μM) ו-FSL-1-ביוטין (ריכוז סופי של 50 μM ממלאי של 445 μM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח סופי של 18 μL בצינורות 1.5 מ"ל. בצע את כל התנאים במשולש.
   2. סוניקו את תערובת המצע (מוכנה בשלב 2.1.1) במשך 3 דקות באמבט מים קולי ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 2.1.3).
      הערה: MTSES (נתרן (2-סולפונטואתיל)מתנאתיוסולפונט), מגיב ספציפי לתיול, מעכב Lnt⁸. הוסף 10 mM MTSES (תמיסת מלאי של 100 mM ב- 100% DMSO) לצינורות התגובה (שלב 2.1.1) כדי לשמש כדגימות בקרה שלילית. כוונן את עוצמת הקול של מאגר התגובה Lnt כך שהנפח הכולל יהיה 18 μL.
   3. הוסף Lnt פעיל (1 ng/μL, המתאים ל-17.2 ננומטר) או לא פעיל Lnt (C387S) (2 μL מתוך מלאי של 10 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) וערבב עם המצעים (שלב 2.1.2) על-ידי צנרת למעלה ולמטה.
   4. לדגום את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.
2. ציפוי סטרפטווידין של 96 לוחות באר
   1. הכינו תמיסת מלאי של סטרפטאבידין במינון של 2 מ"ג/מ"ל ב-H₂O.
      הערה: ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של -20°C למשך עד 6 חודשים.
   2. מתמיסת המלאי יש להכין 10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטאבידין במים כפתרון עובד. הוסף 100 μL של התמיסה לכל באר של צלחת 96 באר. קושרים סטרפטאבידין לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האוויר של הבארות.

הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 2.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 2.4), וזיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 2.5).

3. תגובת קליק-כימיה
   1. הכן פתרונות מלאי של Azido-FAM (5 mM ב- DMSO), TCEP (טריס (2-קרבוקסיאתיל) פוספין הידרוכלוריד; 50 mM מוכן במים), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 2 mM בטרט-בוטאנול:DMSO (4:1)), ו- CuSO₄∙5H 2 O (50 mM מוכן טרי ב- H₂O).
   2. בצינורות של 1.5 מ"ל המכילים את תערובת התגובה Lnt שהוכנה בשלב 2.1.4, בצע כימיה של קליקים על ידי הוספת הריאגנטים בסדר הבא: 0.2 μL של מלאי Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), 0.4 μL של מלאי TCEP (ריכוז סופי 1 mM), 0.2 μL של מלאי TBTA (ריכוז סופי 0.02 mM).
   3. וורטקס הפתרון במשך 5 שניות. לאחר מכן להוסיף 0.4 μL של מלאי CuSO₄ (ריכוז סופי 1 mM). וורטקס שוב במשך 5 שניות. דגרו את הדגימות בחושך ב-RT למשך שעה אחת.
4. קשירת תערובת תגובת Lnt לצלחות מצופות סטרפטווידין
   1. לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 2.2.2 3x עם 200 μL של PBS-T1 (PBS המכיל 0.05% Tween-20).
      הערה: ניתן להשתמש בצלחות סטרפטווידין באופן מיידי או לאחסן יבשות בטמפרטורה של 4°C.
   2. העבר 18 μL מתערובת קליק-כימיה משלב 2.3.3 לבאר בצלחת מצופה סטרפטווידין 96 באר והוסף 100 μL של PBS-T1 כדי לקשור N-acyl-FSL-1-biotin-FAM המוצר ללוחות סטרפטאווידין.
   3. השתמש בביוטין-פלואורסצין (0.26 מיקרומטר ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה חיובית עבור קשירת סטרפטאבידין וקריאת פלואורסצנציה.
   4. דגרו את הצלחות ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, ורעדו ב-300 סל"ד.
   5. בצע שלבי שטיפה ידניים של 96 לוחות הבאר עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית כדלקמן: שש שטיפות עם 200 μL של PBS-T2 (PBS המכיל 1% Tween-20), שלוש שטיפות עם פיפטה, שלוש שטיפות עם 200 μL של PBS, שלוש שטיפות עם פיפטה.
5. זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
   1. הוסף 200 μL של PBS ורשום את הפלואורסצנציה ב-520 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי. שמור תוצאות בתוכנת גיליון אלקטרוני.
      הערה: ביוטין-פלואורסצין משמש כבקרה חיובית לקשירת סטרפטאבידין וזיהוי פלואורסצנטיות ב-520 ננומטר. קריאה ניתנת לשחזור של 30,000-40,000 A.U. עם 0.26 μM ביוטין-פלואורסצין צפויה. כל הדגימות מנותחות במשולש, כולל בקרות.
   2. חשב את סטיית התקן עבור כל תגובה ואת חישוב ערכי P עבור בקרות שליליות ודגימות חיוביות באמצעות בדיקת t לא מותאמת באמצעות תוכנה סטטיסטית.

3. בדיקת צלחת מרובת בתים

הערה: ביום 1 הגדר את תגובת Lnt ב-384 צלחות באר (שלב 3.1) וצפה 384 צלחות באר עם סטרפטווידין (שלב 3.2).

1. הכנת תערובת מגיבים ותגובה אנזימטית
   הערה: כמות הריאגנטים והאנזים מופחתת בהשוואה לבדיקת הצינורית ותגובת Lnt מבוצעת ישירות ב-384 צלחות קידוח. זה מאפשר שימוש בפחות חומר והפחתת צעדים שניתן להפוך לאוטומטיים עוד יותר.
   1. ערבבו את המצעים באופן הבא: אלקין-POPE (ריכוז סופי של 50 מיקרומטר ממלאי של 500 מיקרומטר) ו-FSL-1-ביוטין (50 מיקרומטר סופיים ממלאי של 500 מיקרומטר) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100 המכיל 1% BSA) בנפח של 13.5 μL לכל תגובה לכל באר בפורמט של צלחת באר 384. בצע את כל התנאים במשולש. חשב את הכמות הכוללת של ריאגנטים הנדרשת למספר התגובות שיש לבצע (כלומר, 5,184 μL עבור צלחת קידוח אחת של 384).
   2. סוניקו את תערובת המצע במשך 3 דקות באמבט מים קולי.
   3. Aliquot 13.5 μL של תערובת המצע לכל באר בלוח באר 384.
      הערה: כבקרה שלילית, ניתן להוסיף 10 mM של MTSES (תמיסת מלאי של 625 mM ב- 100% DMSO) לכל באר. התאם את עוצמת הקול של מאגר Lnt (שלב 3.1.1) כדי להגיע לנפח תגובה סופי של 13.5 μL.
   4. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפני הוספת אנזים Lnt (שלב 3.1.5).
   5. הוסף 0.5 ng/μL (המקביל ל-8.6 ננומטר) אנזים Lnt פעיל, או גרסה לא פעילה (C387S) (1.5 μL ממלאי של 5 ng/μL במאגר WA המכיל 0.05% DDM) במאגר התגובה Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1% BSA) לכל באר המכילה את תערובת התגובה משלב 3.1.3. ערבבו ריאגנטים על ידי צנרת למעלה ולמטה. נפח התגובה הכולל הוא 15 μL.
   6. אטמו את הצלחת עם רדיד אלומיניום ללוחות מרובי-כלים.
   7. דגירה ב-37°C למשך 16 שעות בתרמומיקסר עם מכסה מחומם.
2. ציפוי סטרפטאבידין 384 לוחות באר
   1. יש להשתמש ב-75 μL של סטרפטווידין (10 מיקרוגרם/מ"לב-H 2 O) משלב 2.2.2 כדי לצפות בארות של צלחת באר 384. תנו לסטרפטווידין להיקשר לצלחת על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא מכסה לייבוש האווירי של הבארות.

הערה: ביום 2 בצעו כימיה של קליקים (שלב 3.3), קשרו את תערובת התגובה Lnt ללוחות מצופים סטרפטאבידין (שלב 3.4), זיהו פלואורסצנטיות ונתחו את התוצאות (שלב 3.5).

3. תגובת קליק-כימיה
   1. הכן תמיסות מלאי של אזידו-FAM (1.2 mM ב-DMSO), TCEP (טריס(2-קרבוקסיאתיל)פוספין הידרוכלוריד; 24 mM מוכן ב-H 2 O), TBTA (טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-yl)מתיל]אמין; 0.48 mM בטרט-בוטנול:DMSO (4:1)) ו-CuSO₄∙5H 2 O (24 mM מוכן טרי ב-H₂O).
   2. שלבו את שלושת הריאגנטים בכימיה של קליקים: תערובת של Azido-FAM (ריכוז סופי 50 μM), TCEP (1 mM סופי) ו-TBTA (0.02 mM סופי), כל אחד ב-0.75 μL בנפח סופי של 2.25 μL לכל באר. חשב את הנפח הנדרש לכל צלחת באר 384 (כלומר, השתמש ב- 864 μL כאשר נעשה שימוש בכל הבארות של צלחת הבאר 384). מערבבים במרץ.
   3. הוסף 2.25 μL של תמיסת הריאגנט לכל באר ישירות לתגובת Lnt שהושלמה בלוח הבאר 384 משלב 3.1.7.
   4. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב ערוצית.
   5. הוסף CuSO₄ (0.75 μL ממלאי של 24 mM לריכוז סופי של 1 mM) וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית.
   6. דגירה ב-RT למשך שעה אחת בחושך.
4. קשירת תערובת תגובת Lnt ללוחות באר מצופים סטרפטווידין 384
   1. לשטוף את הבארות של לוחות מצופה streptavidin לאחר הדגירה בלילה משלב 3.2.1 1x עם 85 μL PBS-T1.
   2. העבר 11 μL של תגובת הקליק-כימיה מכל באר של לוחית הדגירה משלב 3.3.6 לצלחת המצופה סטרפטווידין משלב 3.4.1 כדי לקשור את המוצר N-acyl-FSL-1-biotin-FAM ללוחות הסטרפטאווידין.
   3. הוסף 64 μL של מאגר PBS-T1.
   4. כלול ביוטין-פלואורסצין (0.19 μM ממלאי של 3.1 mM ב-DMSO) כבקרה לקשירת בארות מצופות סטרפטאווידין.
   5. דגרו את 384 לוחות הקידוח ב-RT במשך שעה אחת בחושך בתרמומיקסר, רועדים ב-300 סל"ד.
   6. לשטוף את הצלחות באמצעות מכונת כביסה צלחת אוטומטית כדלקמן: 10 כביסות עם 85 μL PBS-T2, צלחות מזועזעות בין כביסות; 5 כביסות עם 85 μL PBS, צלחות מזועזעות בין הכביסה.
5. זיהוי וניתוח פלואורסצנציה
   1. הוסף PBS (85 μL) ורשום פלואורסצנטיות בקורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטיות במהירות של 535 ננומטר.
   2. ניתוח נתונים כמתואר (שלב 2.5.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בתגובת Lnt חומצת השומן sn-1 מפוספוליפידים מועברת לפפטיד דיאצילגליצריל, וכתוצאה מכך פפטיד טריאצילטי בוגר⁸. בדיקת Lnt במבחנה המתוארת כאן נועדה להשתמש בפוספוליפידים המכילים חומצת שומן אלקיין (אלקין-POPE) ו- FSL-1-ביוטין כמצעים, וכתוצאה מכך נוצרת אלקין-FSL-1-ביוטין. בתגובת קליק-כימיה עם...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול של בדיקת Lnt המתואר כאן, המבוסס על זיהוי פלואורסצנטי של המוצר הטריאצילי, הוא רגיש וניתן לשחזור. ההיקשרות הספציפית והיעילה של ביוטין לסטרפטווידין היא מרכיב מרכזי בבדיקה. מצע Alkyne-POPE שנותר לאחר השלמת תגובת Lnt מסומן גם הוא באופן פלואורסצנטי עם FAM אך מוסר ביעילות לאחר קשירת לוחות הסטרפ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Äkta Purifier FPLC system	GE Healthcare	NA	Purity: NA Lnt purification
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	Purity: >99% Lnt substrate
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	Purity: 100% (pure) Click reagent
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	Purity: NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer	BioTek	N° serie 115800, n° materiel 405 Select	Purity: NA Wash steps
biotin-fluorescein	Sigma	53608	Purity: ≥90% Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma	C3036	Purity: ≥98% Click reagent
DDM	Anatrace	D310A	Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Invitrogen	D12435	Purity: anhydrous Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL	INTEGRA	4721	Purity: NA Handling reagents
French Pressure Cell	N/A	N/A	Purity: NA Cell disruption
FSL-1-biotin	EMC microcollections	L7030	Purity: NA Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate	Greiner	781091	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding	Greiner	655097	Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)	Anatrace	S110MT	Purity: ~100% Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets	Thermo Scientific	AB-1170	Purity: NA Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column	GE Healthcare	GE28-9356-04	Purity: NA Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 %	IBA Biotechnology	2-1201-010	Purity: NA Lnt purification
streptavidin	Sigma	S4762-1MG	Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine	Sigma	678937	Purity: 97% Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma	75259	Purity: ≥98% Click reagent
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	Purity: NA Fluorescence detection
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	Purity: NA Heated lid
Triton X-100	Sigma	93443	Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge	Beckman LC	N/A	Purity: NA Cell fractionation