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摘要

Oikopleura二恶英是生物学各个领域的一种特长模型有机体。我们描述了动物和藻类饲料的取样方法、物种鉴定、培养设置和养殖方案。我们强调有助于加强文化体系的关键因素，并讨论可能出现的问题和解决办法。

摘要

Oikopleura二恶英是具有卓越的过滤喂养能力、快速生成时间、保存早期发育和紧凑的基因组的木板和弦剂。由于这些原因，它被认为是海洋生态学研究、进化发育生物学和基因组学的有用模型有机体。由于研究往往需要稳定的动物资源供应，因此建立可靠、低维护的培养系统是很有用的。在这里，我们描述了建立O. 二恶英文化的分步方法。我们描述了如何选择潜在的采样地点、收集方法、目标动物鉴定以及培养系统的设置。我们根据自己的经验提供故障排除建议。我们还强调有助于维持强大文化体系的关键因素。虽然这里提供的文化协议是针对O.二恶英的，但我们希望我们的采样技术和文化设置将激发维护其他脆弱的中上层无脊椎动物的新想法。

引言

模型生物在解决许多生物学问题方面发挥了重要作用，包括与发育、遗传学和生理学有关的问题。此外，额外的模型生物促进新的发现，因此是至关重要的，以更好地了解自然11，2。2海洋浮游动物是多种多样的生物群，在海洋生态系统3、4、5、64,5,6中起着重要作用。3尽管转基因生物，如浮游生物，其多样性研究往往代表性不足，因为它们的透明度和脆弱性使得实地收集和鉴定具有挑战性。,8经过改造的取样技术和实验室培养，可以更密切地观察体外动物，从而进一步推动了浮游生物99、10、11、1210,11,12的生物学知识。

拉瓦奇安人（附属动物）是一类自由游泳的海洋服，包括约70个描述物种，全世界8,8，13。由于幼鸟是浮游动物群落中最丰富的群体之一，14、15、16、17，幼虫是大型浮游生物的主要食物来源，如鱼幼虫14,15,16,1718、19。,19不像阿西德人-塞西利亚的长袍-拉瓦奇人保留一个类似小孔的形态，并在整个20年保持木板。每只动物都生活在一个自建的、复杂的过滤喂养结构内，称为房屋。他们通过尾巴的起伏运动产生水流来积累房屋中的颗粒物。被堵塞的房屋整天被丢弃，其中一些形成碳聚集物，最终沉入海底22;因此，拉瓦奇人在全球碳通量23中扮演着重要角色。据报道，大多数物种生活在水柱13的上100米内的中上层区域;然而，巨大的拉瓦坦巴托乔达乌斯是已知的居住在300米24的深度。加州蒙特利湾的巴索科达乌斯研究显示，这些动物也是微塑料的生物载体，这表明在了解附属动物在海洋中微塑料垂直运输和分布中的作用方面具有潜在的重要性。

由于几个显著的特点，小子拉二恶英是一种幼虫，近年来作为模范有机体引起了人们的注意。它通常报告在世界各地的海洋。它在沿海水域特别丰富26，这很容易从岸边取样。长期，稳定的养殖是可能的与天然和人工海水27，28，29。28,2927在实验室条件下，温度依赖生成时间短至4-9天。它具有很高的肥力，每个女性都能全年生产>300个鸡蛋。作为一种调谐，它占据着理解和弦进化30，31,31的重要遗传位置。在70Mb，O.迪奥尼卡在所有和弦32中拥有最小的识别基因组。在幼虫中，O. 二恶英是迄今为止唯一被描述的非赫马普罗蒂物种。

帕芬霍夫34报道了第一个成功与实验室生长的微藻的O.二恶英养殖。使用同步电机和桨的原始培养协议由 Fenaux 和 Gorsky35开发，后来被多个实验室采用。最近，Fujii等人36日报告了人工海水中的O.二恶英栽培、强大的养殖系统和田间采集，由Bouquet等人27日报道，对简化、经济实惠的系统进行了优化的规程。除了传统的Oikopleura文化系统外，新报道的带有双管饲养罐的设计也具有培养Oikopleura sp.的潜力。37.

我们提出了一个详细的协议，以Sars国际海洋分子生物学中心27号、巴塞罗那大学29号、大阪大学28号主要奥科普莱拉研究小组开发的协议以及我们自己的观测结果为基础，启动O.二元单一栽培。在以前公布的文化协议中，仅粗略地描述了有关藻媒组成、海岸采样技术和Oikopleura识别的详细信息，留下了许多模糊性。在这里，借助视频协议中的视觉信息，我们以直接、分步的方式从一个简单、分步的方式从开始建立O. dioica文化所需的所有关键信息。我们描述了如何区分O.dioica与另一个常见的物种，O. longicauda，这是最具挑战性的步骤之一。虽然现有的文化系统适用于全球种植O. 二恶英，但我们强调根据当地环境条件进行协议调整的重要性。所提交的信息结合了广泛发布的数据以及通过经验获得的知识。目前的协议非常适合有兴趣从头开始建立文化的研究人员。

研究方案

1. O. 迪奥维卡文化设施

  1. 滤水器系统 （图 1）
    1. 从2-3米深的港口收集天然海水。通过滤沙器（孔径 1.4 mm）将海水输送到实验室中的共享储水箱。使用罐过滤器循环水，以保持共享储水箱中的水质。
    2. 在培养室中，设置多步滤芯系统，该系统由带磁驱动泵的100升储液罐、5 μm和1 μm聚丙烯伤口滤芯过滤器以及紫外线消毒器（100 V）（图1）组成。
    3. 将海水从共用储水箱转移到培养室储水箱。进入培养室储水箱前，通过25μm过滤单元（图1A，B）通过海水。通过5和1μm过滤器循环海水，彻底去除可能阻碍动物发育的颗粒。
      注: 网格尺寸较大（25-50 μm）的附加滤镜有助于防止较大的颗粒堵塞网格尺寸较小的墨盒滤镜。过滤后的海水 （fSW） 可于次日早晨投入使用。
  2. 大子浦培养装置 （图 2）
    1. 将动物保持在 5 或 10 L 圆形透明塑料烧杯中。
    2. 将培养杯放在稳定的两层不锈钢搁板上（L x W x H = 150 厘米 x 45 厘米 x 90 厘米），带有 5 mm 厚的透明丙烯酸表面板。
    3. 将白色荧光灯放置在丙烯酸表面下方，从烧杯底部照亮动物。
    4. 在烧杯后面放置一块黑色塑料片。黑片创建对比度，增强透明动物的可视化效果。
    5. 将同步电机连接到丙烯酸桨（L x H = 8 厘米 x 27 厘米）（补充文件 2）。沿搁板长度的平行导轨悬挂培养烧杯中的桨（图2A）。
    6. 打开电机，以 15 RPM 的速度在烧杯中产生温和的圆形运动。
      注:纤维素房屋中的动物是中性浮力的;然而，水循环有助于使鸡蛋、幼虫和藻类食物悬浮，并在养殖烧杯中均匀分布。
  3. 自动给气泵（可选）
    注:自动进料装置减少了人员需求，尤其是在周末。
    1. 根据制造商的说明，从自动配药泵中校准分配液的体积。
    2. 使用 50 mL 管作为藻类储液罐。
    3. 在 50 mL 管的盖上钻两个 5 mm 孔，通过航空管。将一根管连接到标准水族空气泵，引入气泡，另一根管连接到加给泵的进港口（图2B）。
      注:引入薄气泡流有助于防止藻类沉降在管的底部。
    4. 对给定一天分配的藻类饲料的时间和体积进行编程。
  4. 藻站
    1. 使用搁板单元（L x W x H = 90 厘米 x 46 厘米 x 115 厘米）放置四个包含藻类工作培养物的 1 L 圆形底部烧瓶（参见步骤 2.1）。
    2. 通过在烧瓶后面放置荧光灯来背光工作培养物。
    3. 用双孔橡胶塞密封瓶。
    4. 通过橡胶止管将 1 mL 一次性移液器通过橡胶止管。使用航空管将移液器连接到水族馆空气泵。在烧瓶中引入气泡流。

2. 微藻食品

  1. 启动藻类培养物
    注:维持三种微藻种（种群、子种和工作培养物），即柴托切罗斯钙化物、伊索里西丝、犀牛分离，以及一种蓝藻，Synechocousss。股票和亚区域性用作备份。工作文化用于日常喂养。
    1. 准备培养微藻和蓝藻所需的试剂（表1）。
    2. 要启动库存培养，高压灭菌器（121 °C，25 分钟）60~ 80 mL fSW 在 100 mL Erlenmeyer 烧瓶中。无菌接种了指定数量的改性康威中27和微藻（表2）。例如，接种了C.钙化粒、高压灭菌60mL海水、无菌接种30μL的维生素和溶液A、15μL硅酸钠、60μL链霉素和30μL的C.钙化物。
      注:R. reticata在光线过多时从红粉变成猩红褐色。一旦他们开始从透明变成浅粉色，就把它们从光上移开。
    3. 通过连续照明，将培养箱中的库存培养体保持在 17°C。大约10天后，培养改变颜色以表示藻类生长（图3）。颜色出现后，将其移动到 4 °C，进行长达 1 个月的长期存储。
    4. 在干净的长凳上，无菌地从股票培养中接种亚文化（表2）。在17°C下用连续照明孵育。藻色出现后，继续将其储存在培养箱中长达 2 周。
    5. 从亚文化中接种工作文化（表2）。用橡胶盖密封烧瓶，插入 1 mL 一次性移液器。将烧瓶移到藻站，并在室温下保持8小时光周期。供应恒定曝气。每 4 天更新一次工作文化。
    6. 通过旋转每天搅拌两次股票和亚文化。
      注:长期储存在固体介质和冷冻保存上的藻类培养物，可长达3个月和1年，分别为29年。
  2. 创建藻类生长曲线（可选）
    注:准确评估进料量对于维持O.二恶英的稳定培养具有重要意义。我们为两种原藻类食物物种——柴托切罗斯钙西兰和伊索里西星——创造了生长曲线。
    1. 准备C.钙化物和伊索里西思工作文化（表2）。
    2. 对于每种工作培养，使用分光光度计对每一种工作培养进行三次单独采样，并在 660 nm 处测量吸收率。从每个工作区域性中对三脚架进行平均测量。
    3. 按照制造商关于自动细胞计数器的说明，准备藻类样品进行计数。对每个样本进行三次计数。以三个计数的平均值来确定每个样本中存在的单元格总数。
    4. 继续每天计数，直到记录大约 50 个平均测量值。
    5. 为两种藻类创建生长曲线（图4）。

3. 野生Oikopleura spp的野外收集。

  1. 改良浮游生物网 （图 5）
    注:成功取样Oikopleura spp的关键是缓慢拖曳浮游生物网与加权，非过滤鳕鱼末端。图 5显示了修改后的浮游生物网的示意图。
    1. 用经过修改的 500 mL 螺杆顶洗涤瓶更换手持浮游生物网的鳕鱼端。
    2. 在洗涤瓶直径为4厘米的螺柱顶部钻一个直径3厘米的孔，让水和动物进入鳕鱼端。
    3. 将瓶盖放在浮游生物网末端。用电带紧闭它。使用不锈钢软管夹进一步固定盖。
    4. 用拉链将 70 g 的重量连接到经过修改的鳕鱼端的外侧。
    5. 附加安全皮带，进一步确保鳕鱼末端的安全。
  2. 选择收集网站 （图 6）
    注:所有样品收集均获得OIST现场工作安全委员会的批准。根据位置的不同，Oikopleura spp 的存在可能存在季节性变化（图 6）。避免在极端天气事件（如严重暴雨）后立即进行采样。
    1. 使用地图网站上的卫星视图识别潜在的采样点。我们专注于港口和钓鱼码头，很容易开车到达，位于海湾内或浮游生物往往积累的海洋落客附近:日本冲绳金湾的石川港（GPS:26°25'39.3"N 127°49'56.6"E）。
    2. 访问潜在的采样地点，评估每个地点的海岸可及性和安全。根据需要从地方当局获得收集许可证。
  3. 取样程序
    1. 将浮游生物网撒入海中，让鳕鱼端沉入水面以下1-2米。
    2. 在50-100厘米-1下，用手水平牵引网。继续拖着来回行走2-5分钟。根据港口浮游植物的丰度调整牵引时间，当有更多的浮游植物时，用较短的牵引来调整牵引时间。
      注:拉瓦奇人是脆弱的动物。快速牵引或重复铸造网可能会损坏被困在鳕鱼端的动物。
    3. 轻轻提起网。慢慢将鳕鱼端的内容转移到500mL圆形玻璃瓶中。用海水将样品瓶完全装满，以避免气泡。
      注:Oikopleura spp. 的存在可以通过在黑色背景下查看样品瓶来确认。大多数动物在被收集时都抛弃了房子。因此，需要进行物种级鉴定的微观观察。
    4. 重复取样，直到收集三个 500 mL 瓶。
    5. 使用 CTD 探查器测量盐度、温度和叶绿素 a，以记录动物自然存在的物理参数范围。
    6. 将10-15L的表面海水收集在水桶中，使动物在实验室环境中适应。

4. 动物隔离和识别（图7，图8）

  1. 奥科普拉斯普识别
    注:其他可能类似于Oikopleura spp的木板生物，乍一看包括菊花、飞天虫、线虫、带蛋黄囊的鱼幼虫和Ciona spp.幼虫。
    1. 使动物适应实验室条件，将每500 mL样品从取样地点转移到含有1:1表面海水比的10升烧杯中，并过滤实验室中保持的海水（图7A，B）。根据浮游生物样品的浓度，将烧杯的体积调整到5-10升。
      注:如果浮游生物样品含有不需要的碎片，则在转移到 10 L 烧杯之前，通过粗滤片（网格大小 ±600 μm）运行。
    2. 使用连接到同步电机（15 RPM）的桨，使浮游生物在悬架中过夜（步骤 1.2.5）。
    3. 通过寻找1-2毫米长、长1-2毫米的短的短型动物，在一个球形、半透明的房子里，寻找尾巴起伏的动物，从而识别Oikopleura的pp。有些动物可能暂时自由游泳，没有房子。使用钝端移液器将 #5 动物轻轻转移到空的培养皿中。
    4. 为了识别属，用转移移液器轻轻戳动房子，将动物赶出家门。
    5. 在20-40x暗场显微镜下观察无房动物，确认Oikopleura spp（图8）。
  2. O. 迪奥尼卡识别
    注:O. 二恶英可以通过完全成熟的男性和女性或位于其尾巴的远端一半上的两个大型子和弦细胞的存在来直观地识别。两个亚和细胞之间的距离可能因个体而异。
    1. 接下来，检查是否有完全成熟的Oikopleura与一个充满卵子的果子（图8A）或精子（图8B）。如果动物只拥有卵子或精子，跳过步骤4.2.3，因为它是O.二恶英，唯一描述的非赫马普罗蒂物种。
    2. 如果动物不成熟（图8C），在尾巴末端寻找两个子和弦细胞（图8D）。
    3. 一旦物种被确认，转移到一个新的培养皿。重复步骤 4.1.3-4.2.2，直到 10-20 个个体在物种级别得到确认。
      注:为了便于识别，在fSW中含有0.015%三甲烷硫化酸酯（MS222）的培养皿中麻醉动物。
    4. 如果没有找到O. dioica，请将烧杯暂停一两天。可能有不成熟的O.二恶英，将继续生长，变得更容易被检测。如果一周后没有出现，请丢弃示例，然后重试采样。

5. O. 二恶英的培养规程

  1. 从收集的样本开始O. 二元单一培养 （图 7）
    注:藻类食物每天从工作文化中制备，每只单一养殖烧杯每天上午9点、下午12点和下午5点分别喂三次（参见步骤5.2）。动物保持在23°C。在这种情况下，冲绳O.二恶英的生命周期是4天（图7C）。
    1. 要启动O.二恶英的单一栽培，分离120只动物，并转移到含有5L新鲜fSW的新烧杯（图7B，C）。
    2. 第二天早上，寻找完全成熟的雄性与黄色鳄鱼和雌性与鸡蛋显示为金球（图8A，B）。
    3. 通过轻轻地将15名男性和30只雌性转移到含有2.5L新鲜fSW的新烧杯中，用5 mL钝端移液器制作产卵烧杯。
      注:如果没有足够的男性和女性，将尽可能多的成年人转移到含有1LfSW的烧杯，并让他们自然产卵。为了在手动转移过程中尽量减少对动物的身体压力，它们应缓慢地吸水并释放到水面下。
    4. 让动物自然产卵，以启动下一代。尾幼虫应在受精后约3小时出现。
      注:产卵是由完全成熟的动物放弃他们的房子，游向地表水，并释放他们的游戏。通过从产卵烧杯底部抽取5-10 mL的海水并在显微镜下识别有裂解的卵子，可以确认成功的受精。
    5. 在产卵后的第一天早上（第1天），新一代有膨胀房屋的动物应该出现在烧杯里。使用 500 mL 手持烧杯轻轻将产卵烧杯的内容转移到含有 7.5 L 新鲜 fSW（共 10 L）的新烧杯中。以一定角度浇注以避免飞溅运动。
    6. 第二天早上（第2天），手动将150只动物转移到含有5L新鲜fSW的新烧杯上。
    7. 在第三天早上（第3天），手动将120只动物转移到一个新的烧杯与5L的新鲜fSW。
      注:为了同步动物的发展，在第2天和第3天的手动转移中选择大小相似的个体是很重要的。在一次转移中，最多可吸走 10 只动物。
    8. 在第四天早上（第4天），完全成熟的动物应该出现。重复步骤 5.1.3 以关闭生命周期。
      注:可设置自动喂食泵，在周末下午 5 点喂动物，无需养殖人员。
  2. 每天从工作文化中准备藻类食物
    1. 测量 660 nm 工作培养的吸收度。
    2. 根据每日喂养图，找出需要为特定大小的动物喂养多少藻类细胞（表3）。
    3. 使用藻生长曲线（图4），求解下面的方程，计算给定日所需的藻类食物量（mL）。
      1. 要计算特定一天和喂食时间所需的特定藻类的体积，请使用以下方程:
        figure-protocol-7148
        figure-protocol-7219
        figure-protocol-7290
        figure-protocol-7361
        figure-protocol-7432
        figure-protocol-7503
        figure-protocol-7574
        YA是给定一天的藻类浓度，A是每次喂食所需的藻类数量。此外，图4中还显示了YA到x之间的线性关系，截距（c）和斜率（m）的值。有关K值，请参阅表 3。
      2. 例如，为了计算在维持在5L培养和藻类吸收度为0.234（660 nm下）的3天动物上午9点喂食时需要的Isochrysis sp.的体积，计算了以下方法:
        figure-protocol-7938
        figure-protocol-8009
        注:将这些方程存储在电子表格中，以便根据吸收度测量、动物大小和养殖海水体积自动计算每日喂食量（补充文件1）。
    4. 将计算出的藻类体积转移到50mL管中，在5000 x g下在20°C下离心5分钟。
    5. 取出上清液。用新鲜的 fSW 将管重新填充到原始体积，更换旧藻类介质。
    6. 将准备好的食物存放在冰箱中，直到准备好用于下一次饲料。第二天早上准备新食物后，扔掉旧藻类食物。
  3. 活性炭（可选）
    注:每个培养杯中加入10克活性炭，以保持水质。木炭可以重复使用四次。慢慢打开木炭袋，避免木炭灰尘进入养殖烧杯。
    1. 在容器中转移约700克活性炭。浸泡在淡水 （FW） 48 小时，让他们在底部定居。
    2. 用 FW 冲洗以清除残留的木炭灰尘。
    3. 在 FW 中煮木炭 15-20 分钟。从热中取出并冷却。
    4. 冲洗，直到去除大多数木炭粉尘，水变得清澈。
    5. 将干净的木炭存放在含有 fSW 的 2 L 烧杯中。盖住烧杯，防止灰尘进入。
    6. 在转移动物之前，在每个新烧杯中加入木炭。

结果

Oikopleura可以从船或港口收集，通过缓慢，轻柔地拖曳一个100μm网状浮游生物网与非过滤鳕鱼端（图5）。由于动物的脆弱性质，重要的是要避免任何可能导致身体压力的运动，如处理网的粗糙或由于样品罐中被困的气囊而飞溅。

了解当地Oikopleura种群的季节性模式以及取样点水物理特性的伴随波动非常重要。2015年至2019年的抽样调查显示，冲绳石川和金港存在O.dioica的季节性变化（图6）。地表海水温度似乎是一个主要因素。当地表海水达到+28°C时，O. 二恶英是主要物种，而O. longicauda在24°C至27°C的温度下与O.二恶英共存;然而，O. longicauda主导在23°C以下（图6A）。连续几天的大雨之后，盐度的逐渐变化与O.dioica的丰度无关（图6B）。

使用上述采样程序，我们回收的大多数O. 二恶英是在 4 天生命周期的第 2 天和第 3 天之间（图 7C）。成熟的雄性被鳄鱼的黄色着色所识别，而雌性鳄鱼则从直径为70-80μm的鸡蛋中闪闪发光的黄金（图8A，B）。未成熟的O.二恶英由尾巴上的两个亚弦细胞证实（图8D）。当地水域的另一个主要物种，O. longicauda，在大小和形态上相似。我们使用以下标准来区分O.longicauda和O.dioica38，39，40:尾部缺乏亚弦细胞，在躯干中存在静脉曲张，以及存在一个赫马克罗狄特·戈纳（38,39,40图8E，F）。不同的尾巴形态也可用于区分O.longicauda和O.二恶英。当一个没有房子的完整的裸动物横向定向时，O. longicauda的尾巴更直，曲率更低，与O. dioica相比，它的外观更"硬"了。

建立稳定的Oikopleura培养系统的三个最重要的因素是:（一） 保持高水质，（二） 确定最佳喂养制度，（三） 建立一个产卵烧杯，拥有足够数量的男性和女性。多步过滤系统的引入（图1）提高了养殖的水质和稳定性。人工海水不需要过滤系统;然而，天然海水的成本、可用性和便利性使其成为位于海岸附近的实验室的更好选择。为了建立喂养机制，我们建议测量适用于各个实验室设置的藻类生长曲线，因为温度和光线条件差异很大。我们将生长曲线与先前发布的喂养计划相结合，以优化藻类饲料浓度和成分27（图4）。我们还遵循严格的藻类接种计划，以保持藻类食物的新鲜供应（表2）。自动喂食系统使我们能够保持一致的每日喂养时间表，而无需养殖人员在场（图2B）。

一旦达到最佳海水和喂养条件，重要的是通过创建一个产卵烧杯与15个雄性和30个雌性在2.5L的fSW启动新一代。这可确保第二天早上第1天动物的浓度良好，这足以在第2天分离150只动物，在第3天隔离120只，在第4天分离45只成年成年动物产卵。如果没有足够的男性和女性在第4天，收集和转移尽可能多的成熟个体到1L的fSW，让他们自然产卵，希望有足够的幼虫进行下一代。按照所提供的协议，O. 二恶英的生命周期在23°C时为4天（图7C）。我们可靠地建立了六个独立的野生种群的O.dioica，所有这一切都持续了20多代。

figure-results-2191
图1:海水过滤系统的原理图。
（A 和 B）海水在进入储层罐（C）之前，首先通过25μm过滤单元过滤， 磁驱动泵用于从储液罐中抽取海水。然后，海水通过两个聚丙烯过滤器和一个紫外线消毒器，然后再返回到储液罐。请点击此处查看此图形的较大版本。

figure-results-2607
图2:O.二恶英的文化系统。
（A） 培养系统 （B） 自动给药泵同步电机和藻类储层的特写视图.硅管A和B的内径分别为2毫米和4毫米。请点击此处查看此图形的较大版本。

figure-results-2994
图3:O.dioica的股票文化。
从左C钙化物，伊索里西星，Synechocous sp.和R.reticata在17°C连续光下生长10天。请点击此处查看此图形的较大版本。

figure-results-3388
图4:两种主要食物物种的藻类生长曲线，C. 钙西兰和伊索里西星。
光密度 （OD） 的散射图（660 nm）和 （A）钙化物和 （B）异氧体 s 的总细胞浓度。每个点表示三个测量值的平均值。细胞计数器用于确定活细胞的百分比和总细胞浓度（细胞/mL）。测量记录为 20 天（n = 47）。请点击此处查看此图形的较大版本。

figure-results-3881
图5:用于Oikopleura取样的修改浮游生物网。
手持浮游生物网（100 μm网）的鳕鱼端被500mL洗涤瓶所取代。鳕鱼端有 70 g 的重量。约 5 米的绳索连接到钥匙环上。附加了安全皮带，以进一步确保鳕鱼末端的安全。请点击此处查看此图形的较大版本。

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图6:冲绳的O.二恶英的季节性。
在石川 （26°25'39.3'N 127°49'56.6"E） 和 Kin （26°26'40.2"N 127°55'00.3"E） 的港口中，与（A）温度和（B）盐度的季节性变化相关的O. dioica和O. longicauda的存在和不存在。如果人工统计了50多只动物，每个物种都记录为现在。记录了地表水的温度和盐度测量。请点击此处查看此图形的较大版本。

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图 7:用于启动O. 二恶英单一培养的流程图。
（A） 从取样点（B）采集三个500mL浮游生物样本（B），每个样品罐被稀释，O. 二甲被从浮游生物（C）的其余部分中分离出来，通过手动将120天3只动物转移到含有5升新鲜过滤海水（fSW）的新烧杯中启动O.二甲二甲的单一栽培。设置一个产卵烧杯，包含30只雌性，15个雄性和2.5升的新鲜fSW。第一天早上产卵后（第1天），小心翼翼地将新一代动物的产卵烧杯倒入含有7.5L新鲜fSW的烧杯中。在产卵后的第二天（第2天），将150只动物转移到含有5L新鲜fSW的烧杯中。在产卵后的第三天（第3天），将120只动物转移到含有5L新鲜fSW的烧杯中。在最后一天（第4天），设置一个新的产卵烧杯，包括30只雌性，15只雄性和2.5L新鲜fSW，为下一代做准备。这些动物在23°C时有4天的生命周期。请点击此处查看此图形的较大版本。

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图8:识别Oikopleura spp.（A-D:O.二恶英，E和F:O.longicauda）。 O. longicauda
（A） 雌性O. 二恶英与卵子 （B） 雄性O. 二恶英与精子 （C） 未成熟的O. 二恶英 （D） 侧视图未成熟的O. 二恶英与两个子和弦细胞指示白箭头 （E） 成熟O. longicauda携带卵子 （ 箭头 1） 和精子 （ 箭头 2 ） （F） 视图O. longicauda显示请点击此处查看此图形的较大版本。

试剂化工产品量最终卷 （mL）灭菌股票/ 已打开
解决方案 ANa2EDTA45 克1000高压 釜-20 °C / 4 °C
纳诺3 100 克
H3BO3 33.6 克
NaH2PO4 20 克
MnCl2+4H2O0.36 克
FeCl3+6H2O1.3 克
解决方案 B1.0 mL
解决方案 BZnCl2 2.1 克1000高压 釜4 °C / 4 °C
CoCl2+6H2O2.0 克
（NH4）6Mo7O24+4H2O0.9 克
库SO4+5H2O2.0 克
*HCl-- mL
维生素Thiamin （B1） |盐酸200毫克1000高压 釜-20 °C / 4 °C
素1毫克
钴胺 （B12）1毫克
硅酸钠Na2SiO3 5%10000.22 μm 过滤器4 °C / 4 °C
链霉素C21H39N7O12 25毫克/米拉500.22 μm 过滤器-20 °C / -20 °C

表1:维持藻类食物所需的试剂配方。溶解溶液B所列的所有化学物质后，将添加HCl，直到溶液变得清晰，无浊度。所有试剂均通过高压灭菌（120°C，25分钟）或使用0.22 m过滤器进行灭菌。除维生素储存外，所有试剂在添加指定化学物质后均进行灭菌。对于维生素储存，先高压水，然后溶解列出的化学物质。库存和打开的试剂的存储温度列出。

区域性类型阿尔加尔斯普。ASW （mL）维生素解决方案 A硅酸钠链霉素藻类 （mL） / 培养类型孵化/存储频率
股票文化柴托601/20001/20001/4000
（仅限查托）		1/1000
（除 Syn 外，所有内容）		0.03 / 库存17°C / 4°C双周
Iso600.03 / 库存
犀牛800.06 / 库存
Syn600.03 / 库存
亚文化柴托5001/20001/20001/4000
（仅限查托）		1/1000
（除 Syn 外，所有内容）		10 / 库存17°C / 17°C每周
Iso50010 / 库存
犀牛50020 / 库存
Syn50010 / 库存
工作文化柴托4001/20001/20001/4000
（仅限查托）		1/1000
（除 Syn 外，所有内容）		100 / 子RM / RM每4天
Iso400100 / 子
犀牛400150 / 子
Syn400100 / 子

表2:三种藻类培养型的维护说明。将指定数量的补充剂添加到含有自生水的烧瓶中。用指定数量的藻培养量对每瓶进行接种。在指定温度下孵育和储存藻类培养物。从以前的股票文化中接种了新的股票文化和亚文化，从以前的亚文化中接种了新的工作文化。每两周、一周和四天接种一次新的股票文化、亚文化和工作文化。这个时间表为大约10个O.二恶英文化的烧杯提供了足够的食物。保持 2 + 3 套每种藻类培养类型作为备份。RM = 室温。

一天阿尔加尔斯普。上午 9 点和下午 5 点中午 12 点
1柴托——
Iso10002000
Syn20,00040,000
2柴托10002000
Iso20002000
犀牛10001000
3柴托30004000
Iso30004000
犀牛15001500
4柴托10002000
Iso10002000
犀牛10001000

表3:从花束等27号中修改的每次喂食藻浓度。藻类浓度（细胞mL-1）和藻类在冲绳O.二恶英的4天生命周期内用于日常喂养。

补充文件 1:每日进料图表。在输入每日藻吸收度测量 （OD）、动物大小（天）和每个培养烧杯中的海水量 （SW vol.） 后，自动计算每个培养杯的每日喂食量。R. reticulata和Synechococcus s. 的生长曲线是从Bouquet等人27.请点击此处下载此文件。

补充文件 2:如何将同步电机连接到丙烯酸桨。使用六边形扳手将桨拧紧到电机上。请点击此处下载此文件。

讨论

为了便于在建立O.二恶英文化中的灵活性，了解动物的自然栖息地是很重要的。季节性数据提供有关物理参数范围的信息，可用于指导实验室的培养条件。它还有助于理解动物数量丰富的季节性波动。在冲绳，O. dioica最可靠地发现从6月到10月。然而，在东京湾，人口高峰在2月和10月41日。虽然O.dioica的培养经常在20°C或更低27°C或更低27，28，29，28,29冲绳O.二恶英显示更好的生存温度超过20°C;27这可以解释为冲绳的最低地表海水温度为+20°C（图6）。O. 二恶英的丰度也可能受到浮游植物盛开42和捕食者丰度43，44,44的影响。无论在何处收集O. dioica，了解当地人口的季节性，都最大限度地利用取样和培养成功的机会。

鉴于适当的季节和位置，净采样是收集大量Oikopleura的有效方法，只需付出最少的努力。网状尺寸较小的浮游生物网（60-70 μm）也可用于收集动物的所有阶段。完全成熟的动物很少在网中被发现，也许是因为它们在生命周期结束时很脆弱。因此，通过对亚弦细胞的微观观察，对物种进行鉴定，然后进行取样。成熟个体通常在取样后出现一两天，因为动物在实验室里继续生长。虽然净抽样是有效的，但在不同情况下可能需要采用替代采样方法。例如，城区附近的净采样可以收集大量的浮游植物，因此很难分离Oikopleura。在这种情况下，建议从港口以外地区收集表面海水或船只取样的简单桶式取样。结果表明，连续几天降雨导致盐度的逐渐变化，不影响奥二恶英的丰度;但是，在极端天气事件（如热带气旋）之后，应避免立即进行岸上取样。这些事件导致突然和剧烈的生物地球化学变化在庇护水体45，46。45,雨水径流可能携带污染物、沉积物和过量的营养物质，增加浊度和水质下降47。过滤器喂养浮游生物，如Oikoplea，可能特别容易受到这些变化的影响，因为他们的喂养方式和有限的流动性。在这种情况下，我们建议将采样推迟几天，直到当地情况恢复正常。

引入多步过滤系统对于维持小的过滤喂养生物（如O.二恶英）至关重要。使用过滤不良的海水（例如，以前培养系统中的25μm网状物），培养通常不稳定，特别是在夏季，这可能是由于浮游植物的丰度较高。虽然一些浮游植物有利于O.二甲体的生长，但其他产生生物毒素，可能导致O.二甲胚胎的异常发育48。此外，高浓度的硅藻，如柴托切罗斯spp.有可能有害O.二恶英的生长，因为他们可以拥有长集，可以堵塞房子，防止有效的喂养49。我们经常观察到小动物的房屋被C.钙化物塞塔堵塞;因此，我们现在只在第2天和更年纪的动物饲料（表3）。

虽然这里不是问题，但由于遗传瓶颈，小规模长期栽培O.dioica可能经历人口规模的突然下降;在这种情况下，Marté-Solans等人29日建议每20代在文化中增加新的野生个体。

欧高浦文化系统是灵活的。稳定的文化可以在一周内建立。长期培养O.dioica是有可能在有限的预算与非专业设备。维修5-10个小焦树的每日工作通常少于2小时，Oikopleura有2人。O. 二恶英也可以保存在人工海水中，这对没有天然海水的人有益。长期储存藻类食物，可以使用固体培养和冷冻保存29。此外，O. 二恶英精子可以冷冻保存，并保持活超过50年。所有这些因素都意味着文化很容易重新建立。最后，过去的经验与普鲁拉布拉基亚斯普的意外培养。可能暗示为Oikopleura开发的培养系统有可能扩展到更广泛的脆弱的中上层生物群落。

O. 迪奥尼卡继续为各种生物领域提供强有力的见解。对当地季节性的理解、细致的文化体系以及一些敬业的个人，使得有效的文化得以毫不费力地建立起来。Oikopleura培养系统为研究与生态、发育、基因组学和进化这一独特的海洋弦弦酶相关的广泛生物领域提供了基线资源。

披露声明

提交人没有要申报的。

致谢

我们感谢加思·伊尔斯利对建立文化体系的支持。我们感谢苏山和西尔万·吉洛特在早期取样和物种鉴定方面的贡献。特别感谢西田弘子、小野平和大田洋子的慷慨支持和指导，包括初步建立当地的养殖系统，分享动物和微藻文化。我们还感谢丹尼尔·乔鲁特、让-玛丽·布凯、安妮·阿索德、克里斯蒂安·卡埃斯特罗和阿方索·费伦德斯-罗登分享他们在取样和培养方面的专长。杰·丹顿、查尔斯·普莱西和杰弗里·乔利对手稿提供了宝贵的反馈。夏洛特·韦斯特为藻类计算制定了一个通用方程。最后，我们感谢OIST的资助，玛丽·柯林斯和OIST现场工作安全委员会就安全取样程序提供建议，OIST机器车间的工作人员为建造养殖和取样设备，以及小池东田提供海水。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Activated charcoalSigmaC2764-2.5KG
Alluminum pulleyRainbow Products10604-10607
BiotinSigmaB4501-100MG
Boric acidWako021-02195
Cobalamin (B12)SigmaV2876-100MG
Cobalt(II) chloride hexahydrateWako036-03682
Copper(II) sulfate pentahydrateWako039-04412
Disodium edetate hydrateWako044-29525
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrateWako019-03212
Hexagon wrenchAnexNo.6600
Hydrochloric acidWako080-01066
Iron(III) chloride hexahydrateWako091-00872
Jebao programmable auto dosing pumpJebaoDP-4
Magnet pumpREI-SEARMD-201
Manganese(II) chloride tetrahydrateWako134-15302
Polypropylene wound cartridge filterAdvantecTCW-10N-PPS
TCW-5N-PPS
TCW-1N-PPS
Screwless terminal blockSATO PARTSSL4500
Simple plankton netRIGO, Japan5512-C
Sodium metasilicateSigma307815-1KG
Sodium nitrateWako195-02545
Sodium phosphate monobasic anhydrousMP Biomedicals194740
Streptomycin sulfate saltSigmaS6501-25G
Synchronous electric motorServoD5N6Z15M
Thiamin hydrochlorideWako201-00852
UV sterilizerIwakiUVF-1000
Zinc chlorideMP Biomedicals194858

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