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摘要

评估候选抑制剂在完整细胞中参与目标的能力对药物的发现至关重要。该协议描述了一个384井格式的细胞热移检测，可靠地检测针对野生型SHP2或其致癌变异的抑制剂的细胞靶接触。

摘要

Src-同源性2（SH2）域包含磷酸酶2（SHP2）， 由PTPN11 原生基因编码，是受体酪氨酸激酶（RTK）驱动细胞信号的关键中介，促进细胞生存和增殖。此外，SHP2由免疫检查点受体招募，以抑制B和T细胞活化。异常SHP2功能已牵连到许多癌症的发展，进展和转移。事实上，小分子SHP2抑制剂最近已进入临床试验，用Ras/Raf/ERK通路活化治疗实体肿瘤，包括具有一些致癌Ras突变的肿瘤。然而，目前SHP2抑制剂的一类对白血病中频繁发生的SHP2致致致变异无效，而针对致癌SHP2的特定小分子的发育是当前研究的主题。大多数药物发现运动涉及细胞细胞酸蛋白（如 SHP2）的一个常见问题是，推动化学发现的主要检测方法通常是体外检测，不报告候选化合物的细胞靶度。为了提供一个测量细胞靶位参与度的平台，我们开发了野生型和突变型SHP2细胞热移测定。这些测定能够可靠地检测SHP2抑制剂在细胞中的目标接触。在这里，我们提供了该测定的综合方案，为SHP2抑制剂的评估和表征提供了宝贵的工具。

引言

酪氨酸磷酸化在细胞1、2,的信号转导中起着重要的作用。这种转化后修饰由蛋白质酪氨酸激酶（PTKs）催化，由蛋白质酪氨酸磷酸盐（PTPs）逆转。因此，异常PTK或PTP功能导致许多遗传或后天人类疾病3，4，5，6。,5,63,Src-同源性2（SH2）包含磷酸酶2（SHP2）是一种广泛表达的非受体类型PTP编码的原生基因PTPN117，是许多生理过程的关键调节器，涉及信号转导通过激活Ras/Raf/ERK，PI3K/Akt，或JAK/STAT信号通路8。通常，SHP2 活动受到严格调节，以防止异常信令。在基础条件下，SHP2由其N端子SH2域自动抑制，该域阻止访问催化磷酸酶域内的活性位点（图1A）9，10。9,10Figure 1A细胞活化后，酪氨酸磷酸化结合蛋白会招募SHP2，使其采用活性构象，其中活性位点现在可进入其基质。在许多癌症中，SHP2活性升高。PTPN11中的体动增益（GOF）突变主要在白血病中得到识别，并防止N-SH2域与磷酸酶域结合，导致形成活性SHP2（图1B）11。11PTPN11 中的细菌性 GOF突变导致 50% 的努南综合征病例，这是一种发育障碍，恶性肿瘤风险增加 12。在PPN11突变很少的实体肿瘤中，磷酸化结合蛋白的含量更高，导致SHP2活性增强（图1C）。SHP2对于免疫检查点信号也很重要，因为BTLA或PD-1等检查点受体招募SHP2去磷化关键信号分子，防止免疫细胞激活13、14、15。13,14,15

以小分子为目标PPT一直是一个挑战，因为PTP的活性位点具有高度的保存和高充电性;针对活动位点的抑制剂通常有效，但表现出较差的选择性和口服生物利用度16，17，18，19，20，21，22。16,17,18,19,20,21,22事实上，许多报告的SHP2抑制剂在细胞23中缺乏选择性和缺乏疗效。最近，SHP2的异体抑制剂具有良好的效力和优异选择性的报告（例如，SHP09924和RMC-455025），并引发了人们对SHP2抑制剂的重新兴趣。基于SHP099和RMC-4550的化合物目前处于第一阶段临床试验中，用受体酪氨酸激酶（RTK）通路激活26，27治疗实体肿瘤。虽然具有开创性，这些化合物是无效的许多SHP2的致癌突变体，推动白血病发生在大量的血液癌患者28，29，30。28,29,30SHP099样化合物对SHP2致致致变异的缺乏效力源于其独特的等量性机制，因为它们通过结合和稳定SHP2突变体中被破坏的不活跃的闭合构象抑制SHP2活性。此外，根据最近的一份报告31，适应抵抗机制在治疗SHP099样抑制剂的患者是相当可想而知的。因此，开发针对其主动、开放状态的下一代SHP2抑制剂是一个激烈研究的主题。

新型SHP2抑制剂在细胞中的表征是铅优化过程的一个重要方面。关键的，经过验证的靶向作用，抑制剂在生理条件下提供一个额外的信心水平，药用化学资源被有效地部署在具有有希望的细胞疗效的化合物上。过去，已经开发出几种评估小分子抑制剂与靶点结合的方法，主要针对蛋白激酶32。为了开发SHP2细胞靶点接触性测定，我们利用细胞热移检测33。这种测定类似于蛋白质34的体外热移（PTS）测定，监测目标蛋白质的热稳定性，这种稳定性通常由小分子的结合改变。原始检测是一种低通量检测，利用抗体来量化目标蛋白水平。或者，我们选择了最近报道的热移位测定的变种，利用β-半乳糖酶片段补充（EFC）测定（图2）35 。35对于这些实验，感兴趣的蛋白质在细胞中表达为N-或C-终端融合蛋白，携带增强的ProLabel标签（ePL，β-半乳糖酶的42个氨基酸片段）。然后将细胞转移到384孔PCR兼容板，并孵育感兴趣的化合物。热循环器用于对细胞施加温度梯度，其蛋白质会随着温度的升高而变性和聚合。这些细胞的热稳定性取决于其温度的升高。候选化合物结合和稳定感兴趣的蛋白质的能力将导致该蛋白质的热稳定性增加。因此，在细胞分解后，那些由候选化合物稳定下来的标记蛋白将在高于通过车辆控制孵育的细胞标记蛋白的高温下留在溶液中。报告器酶接受器（EA）能够补充可溶性ePL标记蛋白，从而使用发光基β-半乳糖酶活性。

我们最近开发了一个强大的细胞热移测定野生型SHP2（SHP2-WT）和频繁的SHP2致癌变种（SHP2-E76K）在小型384井格式36。在这里，我们报告此检测的详细协议，该检测可可靠地检测SHP2抑制剂在细胞中的目标参与度，并证明抑制剂效力与细胞热移数据之间的高度相关性。一般检测工作流如图3 所示。我们的平台使用N-终端标记全长ePL-SHP2融合蛋白。有关生成相应的 pICP-ePL-N-SHP2-WT 和 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 表达质粒，请参阅我们最近的出版物36。此测定可以使用热梯度进行，以建立 SHP2 热剖面，并确定存在或不存在抑制剂的 SHP2 熔化温度。一旦建立了热剖面，也可以在等温条件下进行，从而允许抑制剂剂量反应评估。下面描述了这两种类型的实验。

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研究方案

1. 细胞培养和试剂的准备

  1. 配配 10% 胎儿牛血清、1x 抗生素/抗菌剂、20 mM HEPES 和 1 mM 丙酮酸钠的 500 mL 生长介质。储存在4°C。
  2. 从冷冻原库存瓶中解冻蜂窝热移试剂（EA试剂、解液缓冲液和基材）。
  3. 将试剂和缓冲液分配为2 mL等分，储存在-20°C。
    注:避免冻结/解冻，以便可重复性，仅使用测定程序所需的试剂量。

2. HEK293T电池的生长和维护

  1. 从低温存储获得低通道粘附 HEK293T 细胞。
  2. 在37°C、5%CO2下保持生长介质中的 HEK293T 细胞。
  3. 每 4 天以 1:14 的比例拆分细胞。
    注:为了获得最佳性能，HEK293T 电池不允许超过 25 次。

3. HEK293T细胞制备，用于瞬态转染

  1. 使用 3 mL 的细胞分离试剂从 16 mL 板中分离 HEK293T 细胞。
  2. 用 12 mL 的生长介质稀释。以1，400 x g的离心 收集细胞 4分钟。
  3. 将颗粒重新在 10 mL 生长介质中重新暂停。使用 trypan Blue 和细胞计数器测量细胞的浓度和生存能力。
  4. 板 7.0 x 105 指数级增长 HEK293T 细胞每井在 6 井细胞培养板约 24 小时转染前。
    注:为每一质粒保留一个井，用于转染。
  5. 在37°C下孵育24小时，5%CO2.

4. HEK293T细胞的转染

  1. 从纯化质粒存量的pICP-ePL-N-SHP2-WT或pICP-ePL-N-SHP2-E76K（+200 ng/μL）稀释2μg质粒DNA到200μL的转染缓冲液。
  2. 10 s 的涡流和 1，400 x g 的离心机 4 分钟。
  3. 在稀释的DNA中加入4μL的转染试剂。10 s 的涡流和 1，400 x g 的离心机 4 分钟。
  4. 在23°C下孵育10分钟。
  5. 从培养箱中取出含有生长的 HEK293T 细胞的 6 个井板。将转染混合物添加到6井板的附着细胞中。在37°C下孵育24小时，5%CO2。

5. 检测板的准备

  1. 在要测试的 DMSO 中准备 10 mM 库存溶液。
  2. 将抑制剂溶液放入 384 井低死体积源板中，可立即使用。
  3. 使用液体处理器将所需的抑制剂或车辆 （DMSO） 的体积发现为 384 孔实时 PCR 板，目标最终体积小于 0.5% DMSO （v/v）。使用带惰性气体净化的板密封器密封板。
    注:对于抑制剂剂量反应测定，请确保相应地回填DMSO，以便每个抑制剂浓度使用同等数量的DMSO。为了获得最佳效果，请将板在 23 °C 下存放，并在 24 小时内使用板。

6. 转染细胞分离和制备

  1. 在37°C水浴中，预孵化生长培养基和细胞分离试剂。从培养箱中取出转染细胞。从板的孔中轻轻吸气介质。
    注:对每一个包含不同转染质粒的井使用新的吸气器。
  2. 加入0.3 mL的细胞分离试剂。来回轻轻摇动板，彻底覆盖板底表面。在23°C下孵育2分钟。
  3. 在每个井中添加 1 mL 的生长介质。轻轻移液介质和孔中的细胞，并转移到 15 mL 猎鹰离心管。以1，400 x g的离心 收集细胞 4分钟。
  4. 轻轻地但彻底吸气的媒体。
    注:细胞分离试剂中残留的酚红色会干扰测定。
  5. 在 2 mL 的生长介质中小心地重新暂停细胞颗粒。使用 trypan Blue 和细胞计数器测量细胞的浓度和生存能力。
    注:细胞生存能力应为 > 90%以获得最佳效果。
  6. 稀释细胞浓度为125个细胞/μL。例如，对于 5 μL 测定，这是 +625 细胞/+L。为了获得最佳生存能力，使细胞保持悬浮不超过2小时。

7. 使用SHP2抑制剂孵育细胞

  1. 将细胞分配到无菌单通道溶液槽中。
  2. 在2，500 x g的2，500 x g下，由SHP2抑制剂沉积预先准备的 384-井 实时PCR板，在23°C下5分钟。
  3. 从复合板上取下密封件。使用 125 μL 多通道移液器，将 5 μL 稀释的细胞添加到所需的孔中。
  4. 将板以 42 x g离心 30 s，无需在板上盖上。将盖子密封在板旋转后，在37°C下孵育检测板，5%CO2 1小时。2

8. 制备化学发光试剂主混合

  1. 电镀电池后，从-20°C存储中去除所需的检测试剂（EA试剂、Ly试剂、解液缓冲液和基材）。23 °C 下解冻试剂。
    注:为了便于传输，请准备一个体积是已沉积到板的细胞总体积的1.5倍。使用后不要重复使用试剂。
  2. 使用条件 EA-10 准备试剂的主组合，该组合由组件和体积分数组成，如下所示:EA 试剂 （0.17）、解液缓冲液 （0.17）、基板 （0.67）。
    注:试剂比基于供应商手册中指定的优化实验。

9. 等温或热轮廓梯度热脉冲

  1. 编程梯度热循环器以传递热脉冲。
    1. 对于热轮廓梯度实验，请预编程带以下示例规格的热循环器:
    2. 热脉冲:3分钟所需的熔化温度（垂直或水平梯度+/- 15 °C;例如38-68°C分布在24孔中，温度增量为1.25°C）。
  2. 平衡恢复步骤:3分钟20°C，斜坡速度 = 1 °C/s
    1. 对于等温实验，设置协议设置如下:
    2. 热脉冲:3分钟55°C。 平衡恢复步骤:3分钟20°C，斜坡速度 = 1°C/s
      注:为了提高可重复性，由于在热循环器达到所需温度时很难精确放置板，因此在开始 3 分钟脉冲之前，将程序设置为倒计时 15 秒。对于本实验中使用的热循环器， 请参阅材料表，盖子在热脉冲期间保持。

10. 分析检测和测量

  1. 通过向每孔添加等量（5 μL）来补充分析板，使用多通道移液器进行分析。
  2. 将板 42 x g 离心 30 s。在黑暗中23°C储存30-60分钟。
  3. 使用能够检测 384 孔格式的发光的微孔板读取器测量化学发光。使用优化的板型和集成时间（集成时间 1000 ms，稳定时间 0 s）执行发光测量。测量值作为计数/s 和输出，以进行进一步分析。

11. 数据分析

  1. 使用科学的 2D 图形和统计软件分析发光数据。
  2. 通过使用非线性回归和博尔茨曼西格莫德模型分析规范化的发光数据（与车辆控制规范化）来生成热剖面。
    注:在热剖面实验中，计算的V50（曲线底部和顶部之间的中点温度）定义了SHP2的熔化温度。在等温实验中，EC50 定义了抑制剂的浓度，这种浓度提供半最大值。

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结果

SHP2-WT的热梯度实验产生了一个西格莫德细胞热轮廓，其熔化过渡范围很窄，对于折叠蛋白来说，这是典型的和一致的（图4A）。SHP2 由三个独立的域组成:两个 SH2 域和催化域（图 1）。在自动抑制闭合构象这些域中，这些域是自关联的;在热剖面廓实验中观察到的熔化过渡大概反映了细胞中的这种状态。在10μM下与同性抑制剂SHP099的SHP2-WT的孵育，将SHP2-WT?...

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讨论

我们提出了一个目标参与性测定，可以确认小分子与细胞中的SHP2磷酸酶的直接结合。该测定可以区分低亲和力抑制剂和高亲和力抑制剂，更重要的是，证实SHP099型的类体抑制剂对高致癌SHP2-E76K突变体缺乏效力。这种小型化测定的优势在于它能够集成到SHP2抑制剂筛选运动中。检测方法通过未知化学物质确认细胞内与SHP2结合的能力，是保证有效部署筛选资源的重要能力。总体而言，小型化协议是可?...

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披露声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家卫生研究院赠款1R21CA195422（L.T.）、爱泼斯坦家庭基金会奖（至N.D.P.C.）和NCI癌症中心支持赠款P30CA030199的支持。此外，该项目由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金提供，根据《化学生物学联合会合同第12号》提供。HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着得到美国政府的认可。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well gradient equipped thermocyclerEppendorf AGX50h
384-well low dead volume microplate Echo qualifiedBeckman Coulter, Inc.LP-0200
6-well cell culture platesGreiner Bio-One657 160Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Cell counterThermo Fisher ScientificCountess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo acoustic liquid handlerBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Electronic multichannel pipetteThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES bufferThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse starter kitEurofins DiscoverX Corp.94-4007Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate readerTecan Trading AGSpark
Single channel solution troughThermo Fisher ScientificS253012005
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Thermal microplate sealerAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Transfection reagentsPolyplus TransfectionjetPRIME
Trypan blueThermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express reagentThermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR platesEppendorf AG30132734

参考文献

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