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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, das Zielengagement von Kandidateninhibitoren in intakten Zellen zu bewerten, ist entscheidend für die Entdeckung von Arzneimitteln. Dieses Protokoll beschreibt einen 384 gut formatierten zellulären thermischen Schichttest, der zuverlässig die zelluläre Zielinteraktion von Inhibitoren erkennt, die entweder auf Den Wildtyp SHP2 oder seine onkogenen Varianten abzielen.

Zusammenfassung

Die vom PTPN11 Proto-Onkogen kodierte Src-Homologie 2 (SH2) ist ein wichtiger Vermittler der Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK)-gesteuerte Zellsignalisierung, die das Überleben und die Proliferation von Zellen fördert. Darüber hinaus wird SHP2 von Immun-Check-Point-Rezeptoren rekrutiert, um die Aktivierung von B- und T-Zellen zu hemmen. Aberrant SHP2 Funktion wurde in die Entwicklung, Progression, und Metastasierung vieler Krebsarten beteiligt. Tatsächlich sind kleine Molekül-SHP2-Inhibitoren kürzlich in klinische Studien zur Behandlung von soliden Tumoren mit Ras/Raf/ERK-Signalwegaktivierung eingetreten, einschließlich Tumoren mit einigen onkogenen Ras-Mutationen. Jedoch, die aktuelle Klasse der SHP2-Inhibitoren ist nicht wirksam gegen die SHP2 onkogene Varianten, die häufig bei Leukämien auftreten, und die Entwicklung von spezifischen kleinen Molekülen, die oncogenic SHP2 zielen, ist das Thema der aktuellen Forschung. Ein häufiges Problem mit den meisten Arzneimittel-Entdeckungskampagnen mit zytosolischen Proteinen wie SHP2 ist, dass die primären Assays, die chemische Entdeckung vorantreiben, oft In-vitro-Assays sind, die nicht über das zelluläre Zielengagement von Kandidatenverbindungen berichten. Um eine Plattform zur Messung des zellulären Zielengagements zu bieten, haben wir sowohl Wildtyp- als auch mutierte SHP2-Zell-Thermoschicht-Assays entwickelt. Diese Assays detektieren zuverlässig die Zielinteraktion von SHP2-Inhibitoren in Zellen. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll dieses Assays zur Verfügung, das ein wertvolles Werkzeug für die Bewertung und Charakterisierung von SHP2-Inhibitoren darstellt.

Einleitung

Tyrosin-Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion in den Zellen1,2. Diese posttranslationale Modifikation wird durch Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs) katalysiert und durch Protein-Tyrosinphosphatasen (PTP) umgekehrt. Daher führt abnorme PTK- oder PTP-Funktion zu vielen vererbten oder erworbenen menschlichen Krankheiten3,4,5,6. Die Src-homology 2 (SH2) domänenhaltige Phosphatase 2 (SHP2) ist ein weit verbreiteter Nicht-Rezeptor-Typ PTP, der vom Proto-Onkogen PTP117 kodiert wird und ein wichtiger Regulator zahlreicher physiologischer Prozesse ist, die Signaltransduktion durch Aktivierung der Ras/Raf/ERK,PI3K/Akt oder JAK/STAT-Signalwege8beinhalten. Normalerweise ist die SHP2-Aktivität streng reguliert, um eine abnorme Signalisierung zu verhindern. Unter basalen Bedingungen wird SHP2 durch seine N-Terminal-DOMÄNE SH2 automatisch gehemmt, die den Zugriff auf den aktiven Standort innerhalb der katalytischen Phosphatase-Domäne blockiert (Abbildung 1A)9,10. Bei der Zellaktivierung rekrutieren Tyrosinphosphorylbindungsproteine SHP2, wodurch es seine aktive Konformation annimmt, bei der die aktive Stelle nun für ihre Substrate zugänglich ist. Bei vielen Krebsarten ist die SHP2-Aktivität erhöht. Somatische Gain-of-Function-Mutationen (GOF) in PTPN11 wurden hauptsächlich bei Leukämien identifiziert und verhindern die Bindung der N-SH2-Domäne an die Phosphatase-Domäne, was zu konstitutiv aktivem SHP2 (Abbildung 1B)11 führt. Germline GOF-Mutationen in PTPN11 sind verantwortlich für 50% der Fälle von Noonan-Syndrom, eine Entwicklungsstörung mit einem erhöhten Risiko für Malignität12. Bei soliden Tumoren, bei denen PTPN11-Mutationen selten sind, führen höhere Konzentrationen phosphorylierter Bindungsproteine zu einer verbesserten SHP2-Aktivität (Abbildung 1C). SHP2 ist auch wichtig für die Immun-Checkpoint-Signalisierung, da Checkpoint-Rezeptoren wie BTLA oder PD-1 SHP2 rekrutieren, um wichtige Signalmoleküle zu dephosphorisieren und die Aktivierung von Immunzellen zu verhindern13,14,15.

Die Ausrichtung von PTPs mit kleinen Molekülen war eine Herausforderung, da die aktive Stelle von PTPs hochkonserviert und hoch aufgeladen ist; Inhibitoren, die auf die aktive Stelle abzielen, sind oft potent, weisen jedoch eine schlechte Selektivität und orale Bioverfügbarkeitauf 16,17,18,19,20,21,22. Tatsächlich leiden viele berichtete SHP2-Hemmer an schlechter Selektivität und mangelnder Wirksamkeit in den Zellen23. Kürzlich wurden allosterische Inhibitoren von SHP2 mit guter Potenz und ausgezeichneter Selektivität berichtet (z. B. SHP09924 und RMC-455025) und haben erneutes Interesse an SHP2-Inhibitoren geweckt. Verbindungen auf Basis von SHP099 und RMC-4550 befinden sich derzeit in klinischen Phase-I-Studien zur Behandlung solider Tumoren mit Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Signalwegaktivierung26,27. Während wegweisend, Diese Verbindungen sind unwirksam gegen viele der SHP2 onkogene Erbmutanten, die Leukemogenese bei einer signifikanten Anzahl von Blutkrebspatienten28,29,30. Dieser Mangel an Potenz von SHP099-ähnlichen Verbindungen gegenüber den sHP2 onkogenen Varianten ergibt sich aus ihrem einzigartigen allosterischen Mechanismus, da sie die SHP2-Aktivität hemmen, indem sie die inaktive, geschlossene Konformation binden und stabilisieren, die in SHP2-Mutanten gestört wird. Darüber hinaus sind auf der Grundlage eines aktuellen Berichts31adaptive Resistenzmechanismen bei Patienten, die mit SHP099-ähnlichen Inhibitoren behandelt wurden, durchaus denkbar. Folglich ist die Entwicklung von SHP2-Inhibitoren der nächsten Generation, die auf ihren aktiven, offenen Zustand abzielen, Gegenstand intensiver Forschung.

Die Charakterisierung neuartiger SHP2-Inhibitoren in Zellen ist ein wesentlicher Aspekt des Lead-Optimierungsprozesses. Entscheidend ist, dass das bewährte Zielengagement des Inhibitors unter physiologischen Bedingungen ein zusätzliches Maß an Vertrauen dafür bietet, dass Ressourcen für die medizinische Chemie effizient auf Verbindungen mit vielversprechender zellulärer Wirksamkeit eingesetzt werden. In der Vergangenheit wurden mehrere Methoden zur Beurteilung der Bindung kleiner Molekülinhibitoren an ihre Targets entwickelt, vor allem für Proteinkianasen32. Um einen SHP2-Zellziel-Engagement-Assay zu entwickeln, haben wir einen zellulären thermischen Schichttest33verwendet. Dieser Assay, ähnlich wie der In-vitro-Thermoshift-Assay (PTS) für Proteine34, überwacht die thermische Stabilität des Zielproteins, die typischerweise durch die Bindung kleiner Moleküle verändert wird. Der ursprüngliche Assay ist ein Test mit niedrigem Durchsatz, der Antikörper nutzt, um den Zielproteinspiegel zu quantifizieren. Alternativ haben wir uns für eine kürzlich gemeldete Variante des thermischen Schicht-Assays entschieden, die eine β-Galactosidase-Enzymfragmentkomplementierung (EFC) verwendet (Abbildung 2)35. Für diese Experimente wird das Protein von Interesse in Zellen als N- oder C-terminales Fusionsprotein mit einem verbesserten ProLabel-Tag (ePL, einem 42-Aminosäure-Fragment von β-Galactosidase) ausgedrückt. Die Zellen werden dann auf 384-Well-PCR-kompatible Platten übertragen und mit verbindungen von Interesse inkubiert. Ein Thermocycler wird verwendet, um einen Temperaturgradienten auf die Zellen anzuwenden, deren Proteine denaturieren und aggregieren, wenn die Temperatur aufgrund ihrer thermischen Stabilität steigt. Die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung, das Protein von Interesse zu binden und zu stabilisieren, führt zu einer erhöhten thermischen Stabilität dieses Proteins. Daher bleiben nach der Lyse der Zellen die getaggten Proteine, die durch eine Kandidatenverbindung stabilisiert wurden, bei höheren Temperaturen in Lösung als markierte Proteine von Zellen, die mit Fahrzeugkontrolle inkubiert werden. Reporter-Enzym-Akzeptor (EA) ist in der Lage, die löslichen ePL-markierten Proteine zu ergänzen, was zu einer nachweisbaren β-Galactosidase-Aktivität mit einem Lumineszenzsubstrat führt.

Wir haben vor kurzem einen robusten zellulären thermischen Schichttest für Wildtyp SHP2 (SHP2-WT) und eine häufige SHP2 onkogene Variante (SHP2-E76K) in einem miniaturisierten 384-Well-Format36entwickelt. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll dieses Assays, das das Zielengagement von SHP2-Inhibitoren in Zellen zuverlässig erkennt und einen hohen Grad an Korrelation zwischen Inhibitor-Potenz und zellulären thermischen Schichtdaten aufzeigt. Der allgemeine Assay-Workflow ist in Abbildung 3dargestellt. Unsere Plattform verwendet N-terminalmarkierte ePL-SHP2-Fusionsproteine in voller Länge. Zur Erzeugung der entsprechenden pICP-ePL-N-SHP2-WT und pICP-ePL-N-SHP2-E76K Expressionsplasmide finden Sie in unserer aktuellen Publikation36. Dieser Test kann mit einem thermischen Gradienten durchgeführt werden, um SHP2-Thermoprofile zu erstellen und SHP2-Schmelztemperaturen in Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren zu bestimmen. Sobald thermische Profile erstellt wurden, kann es auch unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden, so dass Inhibitor Dosis-Wirkungs-Bewertung. Beide Arten von Experimenten werden im Folgenden beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung von Zellkultur und Reagenzien

  1. Formulieren Sie eine 500 ml Flasche Wachstumsmedien mit 10% fetalem Rinderserum, 1x Antibiotikum/Antimicotika, 20 mM HEPES und 1 mM Natriumpyruvat. Bei 4 °C lagern.
  2. Tauen Sie zelluläre thermische Schichtreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus gefrorenen Original-Lagerflaschen.
  3. Reagenzien und Puffer als 2 ml Aliquots abgeben und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Einfrieren/Tauen für die Reproduzierbarkeit und verwenden Sie nur das Volumen des Reagenzes, das für das Assay-Verfahren erforderlich ist.

2. Wachstum und Wartung von HEK293T-Zellen

  1. Erhalten Sie niedrig durchgangshafte HEK293T-Zellen aus Kryospeicher.
  2. HEK293T-Zellen in Wachstumsmedien bei 37 °C, 5%CO2erhalten.
  3. Teilen Sie Zellen alle 4 Tage im Verhältnis 1:14.
    HINWEIS: Für eine optimale Leistung dürfen HEK293T-Zellen nicht mehr als 25 Mal durchgehen.

3. HEK293T Zellpräparat zur transienten Transfektion

  1. Trennen Sie HEK293T-Zellen von 16 ml-Platten mit 3 ml des Zellablösungsreagenz.
  2. Mit 12 ml Wachstumsmedien verdünnen. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 4 min.
  3. Setzen Sie das Pellet in 10 ml Wachstumsmedien wieder aus. Messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler.
  4. Platte 7,0 x 105 exponentiell wachsende HEK293T-Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Zell-Kulturplatte ca. 24 h vor der Transfektion.
    HINWEIS: Reservieren Sie einen Brunnen für jedes Plasmid, das transfiziert werden soll.
  5. Inkubieren für 24 h bei 37 °C, 5%CO2.

4. Transfektion von HEK293T-Zellen

  1. Aus einem gereinigten Plasmidbestand aus pICP-ePL-N-SHP2-WT oder pICP-ePL-N-SHP2-E76K (ca. 200 ng/l) verdünnen Sie 2 g Plasmid-DNA in 200 l Transfektionspuffer.
  2. Wirbel für 10 s und Zentrifuge bei 1.400 x g für 4 min.
  3. Fügen Sie der verdünnten DNA 4 L Transfektionsreagenz hinzu. Wirbel für 10 s und Zentrifuge bei 1.400 x g für 4 min.
  4. Bei 23 °C für 10 min inkubieren.
  5. Entfernen Sie die 6 Well-Platten, die wachsende HEK293T-Zellen enthalten, aus dem Inkubator. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den angeschlossenen Zellen in der 6-Well-Platte hinzu. 24 h bei 37 °C, 5%CO2 inkubieren.

5. Vorbereitung von Assayplatten

  1. Bereiten Sie 10 mM Stofflösungen in DMSO von zu testenden Compounds vor.
  2. Dosieren Sie Inhibitorlösungen in eine 384-well Low-Low-Volume-Quellplatte für den sofortigen Gebrauch.
  3. Erkennen Sie das gewünschte Volumen von Inhibitoren oder Fahrzeugen (DMSO) mit einem Flüssigkeitshandler in 384-well-Echtzeit-PCR-Platten bei einem Zielendvolumen von weniger als 0,5% DMSO (v/v). Versiegeln Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler mit Inertgasspülung.
    HINWEIS: Achten Sie bei Inhibitor-Dosis-Wirkungs-Assays darauf, DMSO entsprechend zu verschließen, so dass für jede Inhibitorkonzentration gleiche Mengen an DMSO verwendet werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, lagern Sie Platten bei 23 °C und verwenden Sie Platten innerhalb von 24 h.

6. Transfizierte Zellablösung und -zubereitung

  1. Vorinkubieren Sie Wachstumsmedien und Zellablösungsreagenz in einem 37 °C Wasserbad. Entfernen Sie transfizierte Zellen aus dem Inkubator. Behutsam Medien aus den Brunnen der Platte absaugen.
    HINWEIS: Verwenden Sie einen neuen Aspirator für jeden Brunnen, der ein anderes transfiziertes Plasmid enthält.
  2. 0,3 ml des Zellablösungsreagenz hinzufügen. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um die Oberfläche des Plattenbodens gründlich zu bedecken. Bei 23 °C für 2 min inkubieren.
  3. Fügen Sie 1 ml Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu. Sanfte Pipettenmedien und Zellen im Brunnen und auf ein 15 ml Falcon Zentrifugenrohr übertragen. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 4 min.
  4. Sanft, aber gründlich von den Medien absaugen.
    HINWEIS: Restphenolrot in der Zellablösung reagenz kann den Assay stören.
  5. Zellpellet in 2 ml Wachstumsmedien vorsichtig resuspendieren. Messen Sie die Konzentration und Lebensfähigkeit von Zellen mit Trypanblau und einem Zellzähler.
    HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit sollte > 90 % betragen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  6. Verdünnung der Zellen auf eine Konzentration von 125 Zellen/L. Zum Beispiel ist dies für einen 5-L-Test 625 Zellen/L. Für eine optimale Lebensfähigkeit halten Zellen in Suspension für nicht mehr als 2 h.

7. Inkubation von Zellen mit SHP2-Inhibitoren

  1. Geben Sie Zellen in einen sterilen Einkanal-Lösungstrog.
  2. Zentrifuge 384-well Echtzeit-PCR-Platte, die durch SHP2-Inhibitorabscheidung bei 2.500 x g für 5 min bei 23 °C vorgefertigt wurde.
  3. Entfernen Sie die Dichtung von der Verbundplatte. Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Pipette von 125 L 5 l der verdünnten Zellen zu den gewünschten Brunnen hinzu.
  4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 42 x g für 30 s ohne Deckel auf der Platte. Befestigen Sie eine Deckeldichtung an der Platte, nachdem die Platte nach unten gesponnen wurde, und bebrüten Sie die Assayplatte bei 37 °C, 5%CO2 für 1 h.

8. Herstellung von chemilumineszierenden Reagenz-Master-Mix

  1. Entfernen Sie die erforderliche Menge an Nachweisreagenzien (EA-Reagenz, Lysepuffer und Substrat) aus der Lagerung von -20 °C nach der Beschichtung von Zellen. Taureagenzien bei 23 °C.
    HINWEIS: Bereiten Sie aus Gründen der Übertragung ein Volumen vor, das das 1,5-fache des Gesamtvolumens der Zellen beträgt, die auf der Platte abgelagert wurden. Reagenzien nach Gebrauch nicht wiederverwenden.
  2. Bereiten Sie einen Master-Mix der Reagenzien unter Verwendung der Bedingung EA-10 vor, die aus Komponenten- und Volumenfraktion wie folgt besteht: EA-Reagenz (0,17), Lysepuffer (0,17), Substrat (0,67).
    HINWEIS: Die Reagenzienverhältnisse basieren auf Optimierungsexperimenten, die gemäß dem Lieferantenhandbuch durchgeführt werden.

9. Isotherm oder thermisches Profil Gradient Wärmeimpuls

  1. Programmieren Sie den gradientenfähigen Thermocycler für die Abgabe von Wärmeimpuls.
    1. Für thermische Profilgradientenexperimente programmieren Sie den Thermocycler mit den folgenden Beispielspezifikationen vor:
    2. Wärmeimpuls: 3 min gewünschte Schmelztemperatur (vertikaler oder horizontaler Gradient +/- 15 °C; Beispiel 38-68 °C verteilt auf 24 Brunnen ergibt Temperaturschritte von 1,25 °C).
  2. Ausgleichsrückgewinnungsschritt: 3 min 20 °C mit Rampengeschwindigkeit = 1 °C/s
    1. Für isotherme Experimente wird das Protokoll wie folgt eingerichtet:
    2. Wärmeimpuls: 3 min 55 °C. Ausgleichsrückgewinnungsschritt: 3 min 20 °C mit Rampengeschwindigkeit = 1°C/s
      HINWEIS: Für eine erhöhte Reproduzierbarkeit, da es schwierig sein kann, die Platte genau zu dem Zeitpunkt zu platzieren, wenn der Thermocycler die gewünschte Temperatur erreicht, richten Sie das Programm ein, um 15 s herunterzuzählen, bevor Sie den 3 min Puls beginnen. Für den Thermocycler, der in diesem Experiment verwendet wird, siehe Tabelle der Materialien,wird der Deckel während des Wärmeimpulses hochgehalten.

10. Lyse-Erkennung und -Messung

  1. Ergänzungs-Assayplatten mit Lyse-Erkennungs-Master-Mix durch Addition gleicher Volumina (5 l) zu jedem Bohrwert, der mit einer Mehrkanalpipette analysiert werden soll.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte 42 x g für 30 s. Bei 23 °C in Dunkelheit 30-60 min lagern.
  3. Messen Sie die Chemilumineszenz mit einem Mikroplattenleser, der in der Lage ist, Lumineszenz im 384-Well-Format zu erkennen. Durchführen der Lumineszenzmessung mit dem optimierten Plattentyp und der Integrationszeit (Integrationszeit 1000 ms, Abrechnungszeit 0 s). Messen Sie Werte als Anzahl/s und Ausgabe für die weitere Analyse.

11. Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die Lumineszenzdaten mit einer wissenschaftlichen 2D-Grafik- und Statistiksoftware.
  2. Generieren Sie thermische Profile, indem Sie die normalisierten Lumineszenzdaten (normalisiert zur Fahrzeugsteuerung) mit hilfe einer nichtlinearen Regression und einem Boltzmann-Sigmoidalmodell analysieren.
    HINWEIS: In thermischen Profilexperimenten definiert die berechnete V50, die Temperatur, die der Halbpunkt zwischen dem unteren und oberen Rand der Kurve ist, die Schmelztemperatur von SHP2. In isothermen Experimenten definiert EC50 die Konzentration des Inhibitors, der eine halbmaximale Reaktion gibt.

Ergebnisse

Das thermische Gradientenexperiment für SHP2-WT führte zu einem sigmoidalen zellulären thermischen Profil mit einem schmalen Schmelzübergang, der typisch und konsistent für ein gefaltetes Protein ist (Abbildung 4A). SHP2 besteht aus drei unabhängigen Domänen: zwei SH2-Domänen und der katalytischen Domäne (Abbildung 1). In der automatisch hemmenden geschlossenen Konformation werden diese Domänen selbst assoziiert; der schmelzübergang, der im thermische...

Diskussion

Wir haben einen Ziel-Engagement-Assay vorgestellt, der die direkte Bindung kleiner Moleküle an die SHP2-Phosphatase in Zellen bestätigen kann. Der Test kann zwischen niedrigen und hohen Affinitätshemmern unterscheiden und, was wichtig ist, einen Mangel an Wirksamkeit durch die allosterischen Inhibitoren des SHP099-Typs für die GOF onkogene SHP2-E76K Mutant bestätigen. Eine Stärke dieses miniaturisierten Assays ist seine Fähigkeit, in eine SHP2-Hemmer-Screening-Kampagne integriert zu werden. Die Fähigkeit des Assa...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von National Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (an L. T.), Epstein Family Foundation Award (an N. D. P.C.) und NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. Darüber hinaus wurde dieses Projekt ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Chemical Biology Consortium Contract No finanziert. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well gradient equipped thermocyclerEppendorf AGX50h
384-well low dead volume microplate Echo qualifiedBeckman Coulter, Inc.LP-0200
6-well cell culture platesGreiner Bio-One657 160Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Cell counterThermo Fisher ScientificCountess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo acoustic liquid handlerBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Electronic multichannel pipetteThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES bufferThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse starter kitEurofins DiscoverX Corp.94-4007Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate readerTecan Trading AGSpark
Single channel solution troughThermo Fisher ScientificS253012005
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Thermal microplate sealerAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Transfection reagentsPolyplus TransfectionjetPRIME
Trypan blueThermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express reagentThermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR platesEppendorf AG30132734

Referenzen

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