SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

요약

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

초록

PTPN11 프로토 온코진에 의해 인코딩된 Src-homology 2(SH2) 도메인 함유 인산체 2(SHP2)는 수용체 티로신 키나아제(RTK)구동 세포 신호의 핵심 중재자이며 세포 생존 및 증식을 촉진한다. 또한, SHP2는 B 및 T 세포 활성화를 저해하기 위해 면역 체크포인트 수용체에 의해 모집된다. Aberrant SHP2 기능은 많은 암의 발달, 진행 및 전이에 연루되었습니다. 실제로, 소분자 SHP2 억제제는 최근에 Ras/Raf/ERK 통로 활성화를 가진 고형 종양의 처리를 위한 임상 시험을 입력했습니다, 몇몇 종양성 Ras 돌연변이를 가진 종양을 포함하여. 그러나, SHP2 억제제의 현재 클래스는 백혈병에서 빈번히 발생하는 SHP2 온코겐이체에 대하여 효과적이지 않으며, 온코겐성 SHP2를 표적으로 하는 특정 소분자의 개발은 현재 연구의 대상이다. SHP2 와 같은 세포질 단백질을 관련시키는 대부분의 약 발견 캠페인의 일반적인 문제점은 화학 발견을 유도하는 1 차적인 약이 수시로 후보 화합물의 세포 표적 참여를 보고하지 않는 시험관 내 분석을 한다는 것입니다. 셀룰러 표적 참여측정 플랫폼을 제공하기 위해 야생형 및 돌연변이 SHP2 세포열 시프트 분석을 모두 개발했습니다. 이러한 소심은 세포내 SHP2 억제제의 표적 참여를 안정적으로 검출한다. 여기서 는 SHP2 억제제의 평가 및 특성화를 위한 귀중한 도구를 제공하는 이 분석법의 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

서문

티로신 인산화는 세포^1,,2에서신호 변환에 중요한 역할을 한다. 이 번역 후 변형은 단백질 티로신 키나아제 (PTKs)에 의해 촉매되고 단백질 티로신 인스파타제 (PTP)에 의해 반전됩니다. 따라서, 비정상적인 PTK 또는 PTP 기능은 많은 상속 또는 획득된 인간^{질환3,4,4,,5,6로}이어집니다. Src-homology 2 (SH2) 도메인 함유 인산염 2 (SHP2)는 프로토 온코진 PTPN11^7에 의해 인코딩된 널리 발현된 비수용체 형 PTP이며 Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt의 활성화에 의한 신호^변환을포함하는 수많은 생리적 과정의 주요 레귤레이터이며, 8. 일반적으로 SHP2 활동은 비정상적인 신호를 방지하기 위해 엄격하게 조절됩니다. 기저 조건하에서 SHP2는 촉매 인광파아제 도메인 내의 활성 부위에 대한 액세스를 차단하는 N 단말 SH2 도메인에 의해 자동 억제된다(그림1A)^9,,10. 세포 활성화 시, 티로신 인스포이드 결합 단백질은 SHP2를 모집하여 활성 부위가 기판에 접근할 수 있는 활성 형성을 채택하게 됩니다. 많은 암에서 SHP2 활동이 상승합니다. PTPN11의 체세포 게인(GOF) 돌연변이는 주로 백혈병에서 확인되었으며 N-SH2 도메인의 결합을 포스파타제 도메인으로 방지하여 구성활성 SHP2(도1B)^11을초래한다. PTPN11의 생식선 GOF 돌연변이는 누난 증후군의 경우 ~50%,악성^종양12의위험이 증가하는 발달 장애에 대한 책임이 있다. PTPN11 돌연변이가 드문 고형 종양에서는 인광결합 단백질의 수치가 더 높으며, 이는 향상된 SHP2활성(도 1C)으로이어진다. SHP2는 또한 면역 체크포인트 신호에 중요하며, BTLA 또는 PD-1과 같은 체크포인트 수용체는 SHP2를 모집하여 주요 신호 분자를 탈포하여 면역 세포^{활성화를방지13,14,,15.}

PTP의 활성 부위가 매우 보존되고 고도로 충전되어 있기 때문에 작은 분자로 PTP를 타겟팅하는 것은 어려운 일이었습니다. 활성 부위를 표적으로 하는 억제제는 종종 강력하지만, 선택도 및 경구 생체 이용률이 떨어지는^{16,,17,,18,,19,,20,,21,,22를}나타낸다. 실제로, 많은 보고 된 SHP2 억제제 가난한 선택성 및 세포에 효능의 부족에서 고통⁽²³⁾. 최근에는 SHP2의 알로스테릭 억제제와 우수한 선택성을 가진 알로스터리 억제제(예를 들어, SHP099²⁴ 및 RMC-4550^25)가보고되었으며 SHP2 억제제에 대한 관심을 새롭게 촉발시켰습니다. SHP099 및 RMC-4550에 기초한 화합물은 현재 수용체 티로신 키나아제(RTK) 경로^{활성화(26,27)로}고형 종양을 치료하는 I상 임상^시험에서현재 이다. 획기적인 동안, 이러한 화합물은 혈액암 환자의 상당수에서 백혈구 발생을 구동 하는 SHP2 종양 발생 돌연변이의 많은에 대 한 효과적 이다^28,,29,,30. SHP2 온코겐성 변이체를 향한 SHP099와 같은 화합물의 효능부족은 SHP2 돌연변이체에서 중단되는 비활성 폐쇄 된 변형을 결합하고 안정화하여 SHP2 활동을 억제하기 때문에 독특한 알로스터 메커니즘에서 비롯됩니다. 또한, 최근^{보고서(31)에}기초하여, SHP099와 같은 억제제로 치료받은 환자에서 적응성 내성 메커니즘은 매우 생각할 수 있다. 따라서, 활성을 대상으로 차세대 SHP2 억제제의 개발, 개방 상태는 강렬한 연구의 대상이다.

세포내의 새로운 SHP2 억제제의 특성화는 납 최적화 과정의 필수적인 측면이다. 비판적으로, 생리 조건 하에서 억제제의 입증 된 대상 참여는 약화학에 대 한 자원이 효율적으로 유망한 세포 효능화합물에 배포 되는 신뢰의 추가 수준을 제공. 과거에는, 그들의 표적에 작은 분자 억제제의 결합을 평가하는 몇몇 방법은 주로 단백질 키나아제^(32)를위해 개발되었습니다. SHP2 셀룰러 표적 참여 분석기를 개발하기 위해 셀룰러 열 변화^분석33을활용했습니다. 이러한 분석법은,^{단백질(34)에}대한 체외 열 시프트(PTS) 분석과 유사하게, 표적 단백질 열 안정성을 모니터링하며, 이는 전형적으로 소분자의 결합에 의해 변화된다. 본래 분석은 표적 단백질 수준을 정량화하기 위해 항체를 활용하는 낮은 처리량 분석입니다. 대안적으로, 최근에 보고된 열시프트 분석법의 이체를 선택하여 β-갈라토시다아제 효소 단편 상보화(EFC)분석(도 2)^35를이용한다. 이러한 실험의 경우, 관심 있는 단백질은 향상된 ProLabel 태그를 운반하는 N-또는 C 단말 융합 단백질로서 세포에서 발현된다(ePL, β 갈라토시다제의 42아미노산 단편). 세포는 384웰 PCR 호환 플레이트로 옮겨지고 관심 있는 화합물로 배양됩니다. 열사이클러는 열 안정성에 따라 온도가 증가함에 따라 단백질이 변성되고 집계되는 세포에 온도 그라데이션을 적용하는 데 사용됩니다. 관심 있는 단백질을 결합하고 안정화시키는 후보 화합물의 능력은 그 단백질의 열 안정성증가를 초래할 것이다. 따라서, 세포의 용액에 따라, 후보 화합물에 의해 안정화된 태그된 단백질은 차량 제어로 배양된 세포의 태그된 단백질보다 더 높은 온도에서 용액에 남아 있을 것이다. 리포터 효소 수용자(EA)는 용해성 ePL 태그 단백질을 보완할 수 있어 발광 기판을 사용하여 검출 가능한 β-갈라코시다제 활성을 생성한다.

최근 야생형 SHP2(SHP2-WT)에 대한 견고한 세포열 변속 분석과 소형 384웰 포맷^36에서빈번한 SHP2 온코겐성 변종(SHP2-E76K)을 개발했다. 여기서, 우리는 안정적으로 세포에 있는 SHP2 억제제에 의한 표적 참여를 검출하고 억제제 힘 및 세포 열 이동 데이터 사이 상관관계의 높은 수준을 보여주는 이 분석의 상세한 프로토콜을 보고합니다. 일반적인 분석 워크플로우는 그림 3에나와 있습니다. 우리의 플랫폼은 N 단말 태그 전체 길이 ePL-SHP2 융합 단백질을 사용합니다. 해당 pICP-ePL-N-SHP2-WT 및 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 발현 플라스미드의 생성을 위해, 최근 간행물^36을참조하십시오. 이러한 분석은 열 그라데이션을 사용하여 SHP2 열 프로파일을 설정하고 억제제의 존재 또는 부재 시 SHP2 용융 온도를 결정할 수 있다. 열 프로파일이 확립되면, 그것은 또한 억제제 용량 반응 평가를 허용, 비등 조건하에서 수행 될 수있다. 두 가지 유형의 실험은 다음과 같습니다.

프로토콜

1. 세포 배양 및 시약 준비

1. 500mL 의 성장 매체를 10% 태아 소 혈청, 항생제/항미코틱 1배, 20mM HEPES, 1mM 나트륨 피루바테로 제조합니다. 4 °C에 보관하십시오.
2. 냉동 원래 재고 병에서 세포 열 이동 시약 (EA 시약, 리시스 버퍼 및 기판)을 해동하십시오.
3. 시약과 버퍼를 2mL 알리쿼트로 분배하고 -20°C에 저장합니다.
   참고: 재현성을 위해 동결/해동을 피하고 분석 절차에 필요한 시약의 부피만 사용하십시오.

2. HEK293T 셀의 성장 및 유지 보수

1. 저통로 부착 HEK293T 세포를 극저온 저장으로부터 구하십시오.
2. 성장 매체에서 HEK293T 세포를 37°C, 5%_CO2로유지한다.
3. 1:14 비율로 4 일마다 셀을 분할합니다.
   참고: 최상의 성능을 위해 HEK293T 셀은 25배 이상 통과할 수 없습니다.

3. 일시적인 과도 성 전적을 위한 HEK293T 셀 준비

1. 세포 분리 시약의 3mL를 사용하여 16mL 플레이트로부터 HEK293T 세포를 분리한다.
2. 성장 매체의 12mL로 희석하십시오. 4 분 동안 1,400 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
3. 10 mL 성장 매체에서 펠릿을 다시 중단합니다. 트라이판 블루와 셀 카운터를 사용하여 세포의 농도와 생존가능성을 측정합니다.
4. 플레이트 7.0 x 10⁵ 기하급수적으로 성장 HEK293T 세포 6 잘 세포 배양 플레이트에서 잘 당 약 24 회 전 형질 전.
   참고: 각 플라스미드가 전감염될 수 있도록 잘 예약하십시오.
5. 37 °C에서 24 시간, 5 % CO_2에대한 인큐베이션.

4. HEK293T 세포의 트랜스페트

1. pICP-ePL-N-SHP2-WT 또는 pICP-ePL-N-SHP2-E76K(~200 ng/μL)의 정제된 플라스미드 스톡에서 2μg의 플라스미드 DNA를 200 μL의 트랜스페션 버퍼로 희석시켰다.
2. 10s 및 원심분리기의 소용돌이가 1,400 x g에서 4분 동안.
3. 희석된 DNA에 4 μL의 형질 전환 시약을 추가합니다. 10s 및 원심분리기의 소용돌이가 1,400 x g에서 4분 동안.
4. 10 분 동안 23 °C에서 인큐베이션하십시오.
5. 인큐베이터에서 성장하는 HEK293T 세포를 함유한 6개의 웰 플레이트를 제거합니다. 6웰 플레이트의 부착된 셀에 투명 혼합물을 추가합니다. 37°C에서 24시간, 5% CO_{2의 배양.}

5. 분석 판 준비

1. 테스트할 화합물의 DMSO에 10mM 스톡 솔루션을 준비합니다.
2. 즉시 사용하기 위해 384웰의 낮은 죽은 볼륨 소스 플레이트에 억제제 용액을 분배합니다.
3. 액체 처리기를 사용하여 원하는 양의 억제제 또는 차량(DMSO)을 0.5% 미만의 DMSO(v/v)의 목표 최종 부피에서 384웰 의 실시간 PCR 플레이트로 반점한다. 불활성 가스 정화판 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다.
   참고: 억제제 용량 반응 측정제의 경우, DMSO의 동일한 양이 각 억제제 농도에 사용되도록 그에 따라 DMSO를 백필해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 23°C에서 플레이트를 저장하고 24시간 이내에 플레이트를 사용하십시오.

6. 전염성 세포 분리 및 준비

1. 37°C 수조에서 성장 용지 및 세포 분리 시약을 preincubate. 인큐베이터에서 감염된 세포를 제거합니다. 접시의 우물에서 부드럽게 미디어를 흡인.
   참고: 다른 감염된 플라스미드가 포함된 모든 웰에 새 흡인대를 사용하십시오.
2. 세포 분리 시약의 0.3 mL를 추가합니다. 플레이트 를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 플레이트 바닥의 표면을 철저히 덮습니다. 2분 동안 23°C에서 배양합니다.
3. 각 웰에 성장 미디어 1mL을 추가합니다. 웰의 부드럽게 파이펫 미디어와 셀을 피펫하고 15mL 팔콘 원심분리기 튜브로 이송합니다. 4 분 동안 1,400 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.
4. 부드럽고 철저하게 미디어에서 흡인.
   참고: 세포 분리 시약의 잔류 페놀 레드는 분석에 방해가 될 수 있다.
5. 조심스럽게 성장 매체의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단. 트라이판 블루와 셀 카운터를 사용하여 세포의 농도와 생존가능성을 측정합니다.
   참고: 셀 생존가능성은 > 90%여야 최상의 결과를 낳을 수 있습니다.
6. 세포를 125세포/μL 농도로 희석시다. 예를 들어, 5 μL 분석의 경우 이것은 ~625세포/μL이다. 최적의 생존을 위해 세포를 2시간 이하로 정지 상태로 유지합니다.

7. SHP2 억제제와 세포의 배양

1. 멸균 단일 채널 용액 트로프에 세포를 분배합니다.
2. 23°C에서 5분 동안 2,500 x g에서 SHP2 억제제 증착에 의해 미리 제조된 원심분리기 384-웰 실시간 PCR 플레이트.
3. 복합 플레이트에서 씰을 제거합니다. 125 μL 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석된 셀의 5μL을 원하는 우물에 추가합니다.
4. 플레이트에 뚜껑이 없는 30초 동안 42 x g의 플레이트원심분리기. 플레이트가 회전한 후 플레이트에 뚜껑 씰을 부착하고 분석 플레이트를 37°C, 5%_CO2에서 1h로 배양한다.

8. 화학 발광 시약 마스터 믹스의 준비

1. 도금 세포 후 -20°C 저장에서 필요한 수량의 검출 시약(EA 시약, 용해 완충및 기판)을 제거한다. 23 °C에서 시약을 해동하십시오.
   참고: 이송의 편의를 위해 플레이트에 증착된 셀의 총 부피의 1.5배인 부피를 준비한다. 사용 후 시약을 재사용하지 마십시오.
2. 다음과 같이 구성 요소 및 부피 분획으로 구성된 조건 EA-10을 사용하여 시약의 마스터 믹스를 준비하십시오: EA 시약(0.17), 리시스 버퍼(0.17), 기판(0.67).
   참고: 시약 비율은 공급업체 매뉴얼에 명시된 대로 수행된 최적화 실험을 기반으로 합니다.

9. 이소르말 또는 열 프로파일 그라데이션 열 펄스

1. 열 펄스의 전달을 위해 그라데이션 가능한 써모사이클러를 프로그래밍합니다.
   1. 열 프로파일 그라데이션 실험의 경우 다음과 같은 예제 사양으로 열순환기 사전 프로그래밍을 수행합니다.
   2. 열 펄스 : 3 분 원하는 용융 온도 (수직 또는 수평 그라데이션 +/- 15 °C; 24 우물에 걸쳐 38-68 °C 확산 1.25 °C의 온도 증가).
2. 평형 복구 단계 : 램프 속도 = 1 °C / s3 분 20 °C
   1. isothermal 실험의 경우 다음과 같이 프로토콜 설정이 설정됩니다.
   2. 열 펄스 : 3 분 55 ° C. 평형 복구 단계 : 램프 속도 = 1 ° C / s3 분 20 ° C
      참고: 재현성이 증가하려면 열순환기가 원하는 온도에 도달할 때 플레이트를 정확하게 배치하기가 어려울 수 있으므로 3분 펄스를 시작하기 전에 15초를 카운트다운하도록 프로그램을 설정합니다. 이 실험에 사용된 열순환기의 경우 재료 테이블을참조하면 열 펄스 중에 뚜껑이 유지됩니다.

10. 리시스 감지 및 측정

1. 다중 채널 파이펫을 사용하여 분석할 수 있는 각 웰에 동일한 볼륨(5 μL)을 첨가하여 용해 검출 마스터 믹스를 사용한 분석 플레이트를 보충합니다.
2. 30 s에 대 한 플레이트 42 x g 원심 분리 기. 어둠 속에서 23°C에 30-60분 간 보관하십시오.
3. 384웰 형식으로 발광을 감지할 수 있는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 화학 발광을 측정합니다. 플레이트 유형 및 통합 시간 최적화(통합 시간 1000 ms, 정착 시간 0 s)로 발광 측정을 수행합니다. 추가 분석을 위해 값을 카운트/s 및 출력으로 측정합니다.

11. 데이터 분석

1. 과학 적인 2D 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 발광 데이터를 분석합니다.
2. 비선형 회귀 및 Boltzmann 시그모이드 모델을 사용하여 정규화된 발광 데이터(차량 제어로 정규화)를 분석하여 열 프로파일을 생성합니다.
   참고: 열 프로파일 실험에서, 계산된 V_50,곡선의 바닥과 위쪽 사이의 중간 지점인 온도는 SHP2의 용융 온도를 정의합니다. 이더스말 실험에서 EC_50은 반 최대 응답을 제공하는 억제제의 농도를 정의합니다.

결과

SHP2-WT용 열그라데이션 실험결과 접힌단백질(도 4A)에대해 전형적이고 일관된 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포열 프로파일이 생성되었다. SHP2는 두 개의 SH2 도메인과 촉매도메인(그림 1)의세 가지 독립적인 도메인으로 구성됩니다. 자동 억제 폐쇄 형태에서 이러한 도메인은 자체 연결; 열 프로파일 실험에서 관찰된 용융 전이는 아마도 셀에서 이 ...

토론

우리는 세포에서 SHP2 인산염에 작은 분자의 직접적인 결합을 확인할 수 있는 표적 참여 분석서를 제출했습니다. 상기 분석체는 낮은 친화성 억제제를 구별할 수 있으며, 중요한 것은 GOF 온코겐성 SHP2-E76K 돌연변이체에 대한 SHP099형의 알로스테릭 억제제에 의한 효능의 부족을 확인할 수 있다. 이 소형 분석의 강점은 SHP2 억제제 스크리닝 캠페인에 통합될 수 있는 능력입니다. 알 수 없는 화학 물질에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well gradient equipped thermocycler	Eppendorf AG	X50h
384-well low dead volume microplate Echo qualified	Beckman Coulter, Inc.	LP-0200
6-well cell culture plates	Greiner Bio-One	657 160	Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 X	Thermo Fisher Scientific	15240-062
Cell counter	Thermo Fisher Scientific	Countess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566-016	500 mL
Echo acoustic liquid handler	Beckman Coulter, Inc.	Echo 550
Electronic multichannel pipette	Thermo Fisher Scientific	E1 ClipTip
Fetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	26140-079	500 mL
HEPES buffer	Thermo Fisher Scientific	15630-680	100 mL
InCell Pulse starter kit	Eurofins DiscoverX Corp.	94-4007	Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate reader	Tecan Trading AG	Spark
Single channel solution trough	Thermo Fisher Scientific	S253012005
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-010	100 mM
Thermal microplate sealer	Agilent Technologies, Inc.	PlateLoc
Transfection reagents	Polyplus Transfection	jetPRIME
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282
TrypLE Express reagent	Thermo Fisher Scientific	12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR plates	Eppendorf AG	30132734