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要約

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。

要約

PTPN11プロトオンコジーンによってコードされるSrc相同症2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)駆動細胞シグナル伝達の主要なメディエーターであり、細胞の生存および増殖を促進する。また、SHP2は、BおよびT細胞活性化を阻害する免疫チェックポイント受容体によってリクルートされる。異常なSHP2機能は、多くの癌の発達、進行、転移に関与している。実際、低分子SHP2阻害剤は最近、いくつかの発癌性Ras突然変異を有する腫瘍を含むRas/Raf/ERK経路活性化を伴う固形腫瘍の治療のための臨床試験に入った。しかし、現在のクラスのSHP2阻害剤は、白血病で頻繁に発生するSHP2発がん型変異体に対して有効ではなく、発癌性SHP2を標的とする特定の低分子の開発が現在の研究の対象となっている。SHP2のような細胞質タンパク質を含むほとんどの創薬キャンペーンの共通の問題は、化学発見を促進する主要なアッセイは、多くの場合、候補化合物の細胞標的関与を報告しないインビトロアッセイであるということです。細胞ターゲットエンゲージメントを測定するためのプラットフォームを提供するために、野生型と変異型の両方のSHP2細胞熱シフトアッセイを開発しました。これらのアッセイは、細胞内のSHP2阻害剤の標的関与を確実に検出する。ここでは、SHP2阻害剤の評価と特性評価のための貴重なツールを提供するこのアッセイの包括的なプロトコルを提供します。

概要

チロシンリン酸化は、細胞11,2におけるシグナル伝達において重要な役割を果たす。この翻訳後修飾は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)によって触媒され、タンパク質チロシンホスファターゼ(Ptps)によって逆転されます。したがって、異常PTKまたはPTP機能は、多くの遺伝または獲得したヒト疾患33、4、5、64,5,6につながる。Src相モロジー2(SH2)ドメイン含有ホスファターゼ2(SHP2)は、プロトオンコジーンPTPN117によってコードされる広く発現された非受容体型PTPであり、Ras/Raf/ERK、PI3K/Akt、またはJAK/STATシグナル伝達経路の活性化によるシグナル伝達を伴う多数の生理学的プロセスの主要な調節因子である。通常、SHP2活性は異常なシグナル伝達を防ぐために厳しく調節される。基礎条件下ではSHP2はそのN末端SH2ドメインによって自動抑制され、触媒ホスファターゼドメイン内の活性部位へのアクセスをブロックする(図1A)9、10。9,10Figure 1A細胞活性化の際、チロシンリン酸化結合タンパク質はSHP2をリクルートし、活性な立体構造を採用し、活性部位がその基質にアクセスできるようになりました。多くの癌においてSHP2活性が上昇している。PTPN11における体細胞機能利得(GOF)突然変異は、主に白血病において同定されており、N-SH2ドメインのホスファターゼドメインへの結合を防止し、構成的に活性なSHP2(図1B)11を生じる。11PTPN11における生殖細胞系GOF突然変異は、ヌーナン症候群の症例の50%を担い、悪性腫瘍のリスクが高い発達障害である12。PTPN11変異がまれである固形腫瘍では、リン酸化結合タンパク質のレベルが高いほどSHP2活性が増強される(図1C)。SHP2は免疫チェックポイントシグナル伝達にも重要であり、BTLAやPD−1などのチェックポイント受容体は主要なシグナル伝達分子を脱リン酸化してSHP2をリクルートし、免疫細胞活性化13、14、1514,15を予防する。13

低分子のPtPsを標的にすることは、PtPsの活性部位が高度に保存され、高い荷電性を有するため、困難でした。活性部位を標的とする阻害剤は、しばしば強力であるが、不十分な選択性および経口バイオアベイラビリティ1616、17、18、19、20、21、22を示す。,17,18,19,20,21,22実際、報告された多くのSHP2阻害剤は、細胞23における選択性の低下と有効性の欠如に苦しんでいる。最近、優れた効力と優れた選択性を有するSHP2のアロステリック阻害剤(例えば、SHP09924およびRMC-455025)が報告され、SHP2阻害剤への新たな関心を引き起こしている。SHP099およびRMC-4550に基づく化合物は、現在、第I相臨床試験中に、受容体チロシンキナーゼ(RTK)経路活性化26,27,27で固形腫瘍を治療する。画期的な一方で、これらの化合物は、血液癌患者28、29、30,29,30のかなりの数の血液癌患者で白血病を駆動するSHP2発癌性変異体の多くに対して効果がない。SHP2発癌性変異体に対するSHP099様化合物の効力の欠如は、SHP2変異体で破壊される不活性で閉じた立体構造を結合して安定化させることによってSHP2活性を阻害するため、そのユニークなアロステリック機構に由来する。また、最近の報告31に基づいて、SHP099様阻害剤で治療された患者における適応抵抗機構は、かなり考えられる。その結果、その活性、開放状態を標的とする次世代SHP2阻害剤の開発は、激しい研究の対象となっている。

細胞内の新規SHP2阻害剤の特性評価は、リード最適化プロセスの不可欠な側面である。重要なことに、生理学的条件下での阻害剤の実証された標的関与は、薬用化学のリソースが有望な細胞有効性を有する化合物に効率的に展開されるというさらなる信頼を提供する。過去には、その標的に対する低分子阻害剤の結合を評価するいくつかの方法が開発されてきたが、主にプロテインキナーゼ32に対して。SHP2細胞標的エンゲージメントアッセイを開発するために、セルラー熱シフトアッセイ33を利用した。このアッセイは、タンパク質34に対するインビトロ熱シフト(PTS)アッセイと同様に、標的タンパク質の熱安定性を監視し、これは典型的には小分子の結合によって変化する。元のアッセイは、抗体を利用して標的タンパク質レベルを定量化する低スループットアッセイです。あるいは、β-ガラクトシダーゼ酵素フラグメント相補(EFC)アッセイを利用した熱シフトアッセイの最近報告された変異体を選択した(図2)35。35これらの実験では、目的のタンパク質は、増強されたProLabelタグ(ePL、βガラクトシダーゼの42アミノ酸断片)を運ぶN-またはC末端融合タンパク質として細胞内で発現される。細胞は384ウェルPCR適合プレートに移され、目的の化合物と共にインキュベートされます。サーモサイクラーは、細胞に温度勾配を適用するために利用され、そのタンパク質は熱安定性に基づいて温度が上昇するにつれて変性し、凝集する。候補化合物が目的のタンパク質に結合し安定化する能力は、そのタンパク質の熱安定性の向上をもたらす。したがって、細胞の溶解に続いて、候補化合物によって安定化されたタグ付きタンパク質は、車両制御でインキュベートされた細胞のタグ付きタンパク質よりも高い温度で溶液中に残る。レポーター酵素アクセプタ(EA)は、可溶性ePLタグ付きタンパク質を補体することができ、発光基質を用いた検出可能なβガラクトシダーゼ活性をもたらす。

我々は最近、384ウェル形式36で野生型SHP2(SHP2-WT)および頻繁なSHP2発癌変種(SHP2-E76K)用の堅牢なセルラー熱シフトアッセイを開発した。ここでは、細胞内のSHP2阻害剤による標的関与を確実に検出し、阻害力と細胞熱シフトデータとの間の高い相関を示すこのアッセイの詳細なプロトコルを報告する。一般的なアッセイのワークフローを 図 3に示します。当社のプラットフォームは、N末端タグ付きフルレングスePL-SHP2融合タンパク質を使用しています。対応する pICP-ePL-N-SHP2-WT および pICP-ePL-N-SHP2-E76K 発現プラスミドの生成については、当社の最近の出版物36を参照してください。このアッセイは、熱勾配を使用してSHP2熱プロファイルを確立し、阻害剤の存在下または不存在下でのSHP2融解温度を決定するために行うことができる。いったん熱プロファイルが確立されると、等温条件下でも実施でき、阻害剤の線量応答評価が可能になります。両方のタイプの実験を以下に説明する。

プロトコル

1. 細胞培養・試薬の製造

  1. 10%の牛血清、1x抗生物質/抗ミコティック、20 mM HEPES、および1 mMのナトリウムピルビン酸を用いて500mLの成長培地を処方する。4 °Cで保管。
  2. 凍結したオリジナルストックボトルから、セルラー熱シフト試薬(EA試薬、溶汁バッファー、基材)を解凍します。
  3. 試薬と緩衝液を2 mLアリコートとして分配し、-20°Cで保管する。
    注:再現性のために凍結/解凍を避け、アッセイ手順に必要な試薬の量のみを使用してください。

2. HEK293T細胞の増殖と維持

  1. クライオ貯蔵から低い通路付着HEK293T細胞を得る。
  2. 37 °C、5%CO2で成長培地中のHEK293T細胞を維持する。
  3. 1:14の比率で4日ごとに細胞を分割します。
    注: 最適なパフォーマンスを得るために、HEK293T セルは 25 回を超える通過を許可されていません。

3. 一過性トランスフェクション用 HEK293T 細胞製剤

  1. 細胞脱離試薬の3 mLを使用して16 mLプレートからHEK293T細胞を取り外します。
  2. 12 mLの成長培地で希釈します。1,400 x g で4分間遠心分離して細胞を採取する。
  3. 10 mL成長培地でペレットを再懸濁します。トリパンブルーとセルカウンターを使用して細胞の濃度と生存率を測定します。
  4. プレート7.0 x 105 指数関数的に成長HEK293T細胞は、トランスフェクションの約24時間前に6ウェル細胞培養プレートでウェルあたり増殖する。
    注: プラスミドがトランスフェクションされるごとに 1 つの井戸を予約してください。
  5. 37°Cで24時間インキュベート、5%CO2.

4. HEK293T細胞のトランスフェクション

  1. pICP-ePL-N-SHP2-WTまたはpICP-ePL-N-SHP2-E76K(〜200 ng/μL)の精製プラスミドストックから、2μgのプラスミドDNAを200 μLのトランスフェクションバッファーに希釈しました。
  2. ボルテックスは10s、遠心分離機は1,400 x g で4分間です。
  3. 希釈したDNAに4μLのトランスフェクション試薬を加えます。ボルテックスは10s、遠心分離機は1,400 x g で4分間です。
  4. 23°Cで10分間インキュベートします。
  5. 培養器から成長するHEK293T細胞を含む6ウェルプレートを取り除きます。6ウェルプレートに取り付けられた細胞にトランスフェクションミックスを加えます。37°Cで24時間インキュベートし、5%CO2。

5. アッセイプレートの準備

  1. テストする化合物のDMSOで10 mMストックソリューションを準備してください。
  2. 阻害剤溶液を384ウェル低デッドボリュームソースプレートに分配し、すぐに使用します。
  3. 0.5%未満のDMSO(v/v)の目標最終容積で384ウェルリアルタイムPCRプレートに液体ハンドラを使用して、インヒビターまたは車両(DMSO)の所望の容積を見つけます。不活性ガスパージでプレートシーラーを使用してプレートを密封します。
    注: 阻害剤の用量応答アッセイの場合は、各阻害剤濃度に等量の DMSO が使用されるように、DMSO を適宜バックフィルするようにしてください。最良の結果を得るには、プレートを23°Cで保存し、24時間以内にプレートを使用してください。

6. トランスフェクトされた細胞の剥離と準備

  1. 37°Cの水浴中のプレインキュベート成長培地及び細胞剥離試薬。インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を除去します。プレートのウェルから優しく吸引するメディア。
    注:異なるトランスフェクトプラスミドを含むすべてのウェルに新しい吸引器を使用してください。
  2. 0.3 mLの細胞剥離試薬を加えます。プレートをゆっくりと前後に揺らし、プレート底面を完全に覆います。23°Cで2分間インキュベートします。
  3. 各ウェルに1mLの成長培地を加えます。ウェル内のピペットメディアと細胞を穏やかに、15 mLファルコン遠心分離管に移します。1,400 x g で4分間遠心分離して細胞を採取する。
  4. 穏やかに、しかし徹底的にメディアを吸引する。
    注:細胞剥離試薬中の残留フェノールレッドは、アッセイを妨げる可能性があります。
  5. 細胞ペレットを2 mLの成長培地に慎重に再懸濁させる。トリパンブルーとセルカウンターを使用して細胞の濃度と生存率を測定します。
    注: 最良の結果を得るには、セルの生存率を 90% 以上にする必要があります。
  6. 細胞を125個の細胞/μLの濃度に希釈します。例えば、5 μL のアッセイでは、これは~625 細胞/μL です。最適な生存率のために細胞は2時間以下の懸濁液に保つ。

7. SHP2阻害剤を用いる細胞のインキュベーション

  1. 細胞を無菌単一チャネル溶液トラフに分配する。
  2. 23°Cで5分間2,500xgでSHP2阻害剤沈着により予め調製された遠心分離機384x gウェルリアルタイムPCRプレート。
  3. コンパウンドプレートからシールを取り外します。125 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、希釈した細胞を 5 μL を所望のウェルに加えます。
  4. プレートに蓋をせずに30sの42 x gでプレートを遠心します。プレートをスピンダウンした後、プレートに蓋シールを取り付け、アッセイプレートを37°C、5%CO2で21時間インキュベートします。

8. 化学発光試薬マスターミックスの調製

  1. メッキ細胞の後に-20°Cの保存から必要な量の検出試薬(EA試薬、リシスバッファー、および基質)を取り除きます。23°Cで試薬を解凍する。
    注:転送の便宜上、プレートに堆積したセルの総体積の1.5倍のボリュームを準備してください。使用後は試薬を再利用しないでください。
  2. EA-10の条件を使用して試薬のマスターミックスを準備します, 以下のように成分と体積分率で構成されています: EA試薬 (0.17), リシスバッファー (0.17), 基板 (0.67).
    注: 試薬比は、サプライヤーのマニュアルで指定された最適化実験に基づいています。

9. 等温または熱プロファイル勾配熱パルス

  1. 熱パルスの送達のための勾配対応サーモサイクラーをプログラムします。
    1. 熱プロファイル勾配実験では、サーモサイクラーを次の例の仕様で事前にプログラムします。
    2. 熱パルス:3分所望の融解温度(垂直または水平勾配+-15°C;例38-68°Cは24ウェルに広がり、1.25°Cの温度増分を生み出す)。
  2. 平衡回収ステップ:ランプ速度= 1 °C/sで3分20°C
    1. 等温実験では、プロトコルを次のように設定します。
    2. 熱パルス:3分55°C 平衡回収ステップ:ランプ速度= 1°C/sで3分20°C
      注:サーモサイクラーが希望する温度に達したときにプレートを正確に配置することは困難なため、再現性を高めるために、3分パルスを開始する前に15 sをカウントダウンするようにプログラムを設定します。この実験で使用されるサーモサイクラーについては、 材料表を参照してください、 蓋は熱パルスの間に維持されます。

10. ライシス検出と測定

  1. マルチチャンネルピペットを使用して分析する各ウェルに等量(5 μL)を添加して、リシス検出マスターミックス付きアッセイプレートを補います。
  2. プレート42 x g を30s用に遠心分離する。暗闇の中で23°Cで30〜60分間保管してください。
  3. 384ウェル形式で発光を検出できるマイクロプレートリーダーを用いて化学発光を測定します。プレートタイプと積分時間を最適化して発光測定を行います(積分時間1000ms、決済時間0s)。値をカウント/s として測定し、さらに分析するために出力します。

11. データ分析

  1. 2Dグラフと統計ソフトウェアを使用して発光データを分析します。
  2. 非線形回帰とボルツマンシグモイドモデルを使用して正規化された発光データ(車両制御に正規化)を分析して、熱プロファイルを生成します。
    注: 熱プロファイル実験では、計算された V50(曲線の底部と上端の中間点である温度) が SHP2 の融解温度を定義します。等温実験では、EC50 は、半最大応答を与える阻害剤の濃度を定義する。

結果

SHP2-WTの熱勾配実験は、折り畳まれたタンパク質に対して典型的かつ一貫した狭い融解遷移を有するシグモイド細胞熱プロファイルをもたらした(図4A)。SHP2 は、2 つの SH2 ドメインと触媒ドメインの 3 つの独立したドメインで構成されています (図 1)。自動抑制された閉じた立体構造では、これらのドメインは自己関連付け;熱プロファイル実験で観?...

ディスカッション

細胞内のSHP2ホスファターゼへの低分子の直接結合を確認できる標的関与アッセイを発表しました。このアッセイは、低親和性阻害剤と高親和性阻害剤を区別し、重要なことに、GOF発癌性SHP2-E76K変異体に対するSHP099型のアロステリック阻害剤による効力の欠如を確認することができる。この小型アッセイの強みは、SHP2阻害剤スクリーニングキャンペーンに統合される能力です。未知の化学物?...

開示事項

著者らは、この記事の内容と利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所補助金1R21CA195422(L.T.)、エプスタインファミリー財団賞(N.D.P.C.)、NCIがんセンターサポートグラントP30CA030199によって支援されました。さらに、このプロジェクトは、化学生物学コンソーシアム契約No.の下で、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部で資金提供されています。HHSN261200800001E.本書の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well gradient equipped thermocyclerEppendorf AGX50h
384-well low dead volume microplate Echo qualifiedBeckman Coulter, Inc.LP-0200
6-well cell culture platesGreiner Bio-One657 160Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Cell counterThermo Fisher ScientificCountess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo acoustic liquid handlerBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Electronic multichannel pipetteThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES bufferThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse starter kitEurofins DiscoverX Corp.94-4007Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate readerTecan Trading AGSpark
Single channel solution troughThermo Fisher ScientificS253012005
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Thermal microplate sealerAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Transfection reagentsPolyplus TransfectionjetPRIME
Trypan blueThermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express reagentThermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR platesEppendorf AG30132734

参考文献

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