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Résumé

La capacité d’évaluer l’engagement cible par les inhibiteurs candidats dans les cellules intactes est cruciale pour la découverte de médicaments. Ce protocole décrit un test de décalage thermique cellulaire de format 384 qui détecte de façon fiable l’engagement cellulaire des inhibiteurs ciblant soit le SHP2 de type sauvage, soit ses variantes oncogènes.

Résumé

Le domaine src-homologie 2 (SH2) contenant de la phosphatase 2 (SHP2), codé par le proto-oncogène PTPN11, est un médiateur clé de la signalisation cellulaire axée sur la tyrosine des récepteurs (RTK), favorisant la survie et la prolifération cellulaires. En outre, SHP2 est recruté par les récepteurs de point de contrôle immunitaire pour inhiber l’activation des cellules B et T. La fonction Aberrante de SHP2 a été impliquée dans le développement, la progression, et la métastase de beaucoup de cancers. En effet, de petits inhibiteurs de la molécule SHP2 ont récemment participé à des essais cliniques pour le traitement de tumeurs solides avec activation de la voie Ras/Raf/ERK, y compris des tumeurs avec quelques mutations oncogènes de Ras. Cependant, la classe actuelle des inhibiteurs de SHP2 n’est pas efficace contre les variantes oncogènes de SHP2 qui se produisent fréquemment dans les leucémies, et le développement de petites molécules spécifiques qui ciblent le SHP2 oncogène fait l’objet de recherches actuelles. Un problème commun avec la plupart des campagnes de découverte de drogue impliquant des protéines cytosoliques comme SHP2 est que les analyses primaires qui conduisent à la découverte chimique sont souvent des analyses in vitro qui ne signalent pas l’engagement cible cellulaire des composés candidats. Pour fournir une plate-forme pour mesurer l’engagement cellulaire de la cible, nous avons développé des analyses thermiques cellulaires SHP2 de type sauvage et mutantes. Ces analyses détectent de manière fiable l’engagement cible des inhibiteurs du SHP2 dans les cellules. Ici, nous fournissons un protocole complet de cet essai, qui fournit un outil précieux pour l’évaluation et la caractérisation des inhibiteurs du SHP2.

Introduction

La phosphorylation de la tyrosine joue un rôle important dans la transduction du signal dansles cellules 1,2. Cette modification post-translationnelle est catalysée par des kinases de tyrosine protéique (PTKs) et inversée par des phosphatases de tyrosine protéique (PPR). Par conséquent, la fonction aberrante de PTK ou de PTP mène à beaucoup de maladies humaineshéritées ou acquises 3,,4,,5,,6. Le Src-homology 2 (SH2) contenant du domaine phosphatase 2 (SHP2) est un PTP de type non récepteur largement exprimé codé par le PTPN117 proto-oncogène et est un régulateur clé de nombreux processusphysiologiquesqui impliquent la transduction du signal par activation des voies de signalisation Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt ou JAK/STAT. Normalement, l’activité SHP2 est étroitement réglementée afin d’éviter la signalisation aberrante. Dans des conditions basales, SHP2 est autoinhibited par son domaine SH2 N-terminal, qui bloque l’accès au site actif dans le domaine catalytique de phosphatase (Figure 1A)9,10. Lors de l’activation cellulaire, les protéines liant la tyrosine phosphorylatées recrutent le SHP2, ce qui lui fait adopter sa conformation active, dans laquelle le site actif est désormais accessible à ses substrats. Dans de nombreux cancers, l’activité SHP2 est élevée. Des mutations somatiques de gain de fonction (GOF) dans PTPN11 ont été identifiées principalement dans les leucémies et empêchent la liaison du domaine de N-SH2 au domaine de phosphatase, ayant pour résultat le SHP2 constitutif actif (figure 1B)11. Germline GOF mutations dans PTPN11 sont responsables d’environ 50% des cas de syndrome de Noonan, un trouble du développement avec un risque accru de malignité12. Dans les tumeurs solides, où les mutations PTPN11 sont rares, des niveaux plus élevés de protéines liantes phosphorylatées conduisent à une activité SHP2 améliorée (Figure 1C). SHP2 est également important pour la signalisation de point de contrôle immunitaire, car les récepteurs de point de contrôle tels que BTLA ou PD-1 recrutent SHP2 pour déphosphorylate molécules de signalisation clés, empêchant l’activation des cellulesimmunitaires 13,14,15.

Cibler les PNP avec de petites molécules a été un défi, parce que le site actif des PNP est fortement conservé et très chargé; les inhibiteurs qui ciblent le site actif sont souvent puissants, mais présentent une faible sélectivité et biodisponibilité orale16,17,18,19,20,21,22. En effet, beaucoup d’inhibiteurs rapportés de SHP2 souffrent de la sélectivité pauvre et du manque d’efficacité dans lescellules 23. Récemment, des inhibiteurs allosteriques de SHP2 avec la bonne puissance et l’excellente sélectivité ont été rapportés (par exemple, SHP09924 et RMC-455025)et ont suscité l’intérêt renouvelé pour des inhibiteurs de SHP2. Les composés basés sur SHP099 et RMC-4550 sont actuellement en phase I essais cliniques pour traiter les tumeurs solides avec récepteur tyrosine kinase (RTK) activation de la voie26,27. Bien que révolutionnaires, ces composés sont inefficaces contre de nombreux mutants oncogènes SHP2 qui conduisent la leukemogenèse chez un nombre important de patients atteints d’un cancer dusang 28,29,30. Ce manque de puissance des composés de type SHP099 vers les variantes oncogènes SHP2 provient de leur mécanisme allosterique unique, car ils inhibent l’activité SHP2 en liant et en stabilisant la conformation inactive et fermée, qui est perturbée chez les mutants SHP2. En outre, basé sur un rapport récent31, les mécanismes adaptatifs de résistance dans les patients traités avec des inhibiteurs SHP099-like sont tout à fait concevables. Par conséquent, le développement d’inhibiteurs SHP2 de prochaine génération qui ciblent son état actif et ouvert fait l’objet d’intenses recherches.

La caractérisation de nouveaux inhibiteurs du SHP2 dans les cellules est un aspect essentiel du processus d’optimisation du plomb. L’engagement cible éprouvé de l’inhibiteur dans des conditions physiologiques fournit un niveau supplémentaire de confiance que les ressources pour la chimie médicinale sont efficacement déployées sur des composés avec l’efficacité cellulaire prometteuse. Dans le passé, plusieurs méthodes pour évaluer la liaison des inhibiteurs de petites molécules à leurs cibles ont été développées, principalement pour les kinases protéiques32. Pour développer un essai cellulaire d’engagement de cible de SHP2, nous avons utilisé un essai cellulaire de décalage thermique33. Cet essai, semblable à l’analyse in vitro de décalage thermique (PTS) pour les protéines34,surveille la stabilité thermique cible de protéine, qui est typiquement modifiée par la liaison des petites molécules. L’analyse originale est un test de faible débit qui utilise des anticorps pour quantifier les niveaux de protéines cibles. Alternativement, nous avons choisi une variante récemment rapportée de l’essai de décalage thermique qui utilise un essai de complémentation de fragment d’enzyme de β-galactosidase (EFC) essai (figure 2)35. Pour ces expériences, la protéine d’intérêt est exprimée dans les cellules comme une protéine de fusion N- ou C-terminal portant une étiquette prolabel améliorée (ePL, un fragment d’acide aminé de 42 β-galactosidase). Les cellules sont ensuite transférées dans des plaques compatibles PCR de 384 puits et incubées avec des composés d’intérêt. Un thermocycleur est utilisé pour appliquer un gradient de température sur les cellules, dont les protéines dénoaturent et s’agrègent à mesure que la température augmente en fonction de leur stabilité thermique. La capacité d’un composé candidat de lier et de stabiliser la protéine d’intérêt se traduira par une stabilité thermique accrue de cette protéine. Par conséquent, à la suite de la lyse des cellules, les protéines étiquetées qui ont été stabilisées par un composé candidat resteront en solution à des températures plus élevées que les protéines étiquetées des cellules incubées avec le contrôle du véhicule. L’accepteur d’enzymes reporter (EA) est capable de compléter les protéines solubles étiquetées ePL, ce qui entraîne une activité détectable de β-galactosidase à l’aide d’un substrat de luminescence.

Nous avons récemment développé un essai cellulaire robuste de décalage thermique pour le SHP2 sauvage-type (SHP2-WT) et une variante oncogène fréquente de SHP2 (SHP2-E76K) dans un format miniaturisé de 384 puits36. Ici, nous rapportons un protocole détaillé de cet essai, qui détecte de manière fiable l’engagement cible par les inhibiteurs de SHP2 dans les cellules et démontre un degré élevé de corrélation entre la puissance d’inhibiteur et les données cellulaires de décalage thermique. Le flux de travail général d’analyse est illustré à la figure 3. Notre plate-forme utilise des protéines de fusion ePL-SHP2 en phase terminale N. Pour la génération des plasmides d’expression pICP-ePL-N-SHP2-WT et pICP-ePL-N-SHP2-E76K, veuillez consulter notre récente publication36. Cet essai peut être effectué à l’aide d’un gradient thermique pour établir des profils thermiques SHP2 et déterminer les températures de fusion du SHP2 en présence ou en l’absence d’inhibiteur. Une fois que les profils thermiques ont été établis, il peut également être effectué dans des conditions isothermales, permettant l’évaluation de dose-réponse d’inhibiteur. Les deux types d’expériences sont décrits ci-dessous.

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Protocole

1. Préparation de la culture cellulaire et des reagents

  1. Formuler une bouteille de 500 mL de supports de croissance avec 10 % de sérum bovin fœtal, 1x antibiotique/antimicotique, 20 mM HEPES et 1 mM de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C.
  2. Décongeler les reagents cellulaires de décalage thermique (réageni EA, tampon de lyse et substrat) à partir de bouteilles de bouillon d’origine congelées.
  3. Distribuez les reagents et tampons sous forme d’aliquots de 2 mL et stockez-les à -20 °C.
    REMARQUE : Évitez le gel/dégel pour la reproductibilité et n’utilisez que le volume de réaccente requis pour la procédure d’analyse.

2. Croissance et entretien des cellules HEK293T

  1. Obtenez des cellules HEK293T adhérentes à faible passage à partir du stockage cryo.
  2. Maintenir les cellules HEK293T dans les supports de croissance à 37 °C, 5 % de CO2.
  3. Divisez les cellules tous les 4 jours dans un rapport de 1:14.
    REMARQUE : Pour de meilleures performances, les cellules HEK293T ne sont pas autorisées à passer plus de 25 fois.

3. Préparation de cellules HEK293T pour la passation transitoire

  1. Détachez les cellules HEK293T des plaques de 16 mL à l’aide de 3 mL du réagentinement du détachement cellulaire.
  2. Diluer avec 12 mL de supports de croissance. Recueillir les cellules par centrifugation à 1 400 x g pendant 4 min.
  3. Resuspendez la pastille dans un média de croissance de 10 mL. Mesurer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide du bleu trypan et d’un compteur cellulaire.
  4. Plaque 7.0 x 105 cellules HEK293T croissance exponentielle par puits dans une plaque de culture cellulaire de 6 puits environ 24 h avant transfection.
    REMARQUE : Réservez un puits pour que chaque plasmide soit transfecté.
  5. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.

4. Transfection des cellules HEK293T

  1. À partir d’un stock de plasmides purifiés de pICP-ePL-N-SHP2-WT ou pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~200 ng/μL) diluer 2 μg d’ADN plasmide en 200 μL de tampon de transfection.
  2. Vortex pour 10 s et centrifugeuse à 1400 x g pendant 4 min.
  3. Ajouter 4 μL de réagencé de transfection à l’ADN dilué. Vortex pour 10 s et centrifugeuse à 1400 x g pendant 4 min.
  4. Incuber à 23 °C pendant 10 min.
  5. Retirez la plaque de 6 puits contenant des cellules HEK293T en croissance de l’incubateur. Ajouter le mélange de transfection aux cellules attachées dans la plaque de 6 puits. Incuber pendant 24 h à 37 °C, 5 % de CO2.

5. Préparation des plaques d’essai

  1. Préparez des solutions de stock de 10 mM en DMSO de composés à tester.
  2. Distribuez des solutions d’inhibiteur dans une plaque source à faible volume mort de 384 puits pour une utilisation immédiate.
  3. Placez le volume désiré d’inhibiteurs ou de véhicule (DMSO) à l’aide d’un gestionnaire liquide dans des plaques PCR en temps réel de 384 puits à un volume final cible inférieur à 0,5 % DMSO (v/v). Sceller la plaque à l’aide d’un scellant à plaque avec une purge inerte au gaz.
    REMARQUE : Pour les analyses dose-réponse des inhibiteurs, assurez-vous de remblayer le DMSO en conséquence afin que des quantités égales de DMSO soient utilisées pour chaque concentration d’inhibiteurs. Pour de meilleurs résultats, conservez les assiettes à 23 °C et utilisez des assiettes à moins de 24 h.

6. Détachement et préparation des cellules transfected

  1. Préincuber les supports de croissance et le réapprovisionnement en détachement cellulaire dans un bain d’eau de 37 °C. Retirer les cellules transfectées de l’incubateur. Aspirez doucement les supports des puits de la plaque.
    REMARQUE : Utilisez un nouvel aspirateur pour chaque puits qui contient un plasmide transfected différent.
  2. Ajouter 0,3 mL du réageni du détachement cellulaire. Bercer délicatement la plaque d’avant en arrière pour bien couvrir la surface du fond de la plaque. Incuber à 23 °C pendant 2 min.
  3. Ajouter 1 mL de supports de croissance à chaque puits. Pipette doucement les supports et les cellules du puits et transférer dans un tube de centrifugeuse Falcon de 15 mL. Recueillir les cellules par centrifugation à 1 400 x g pendant 4 min.
  4. Aspirez doucement mais soigneusement les médias.
    REMARQUE : Le rouge phénol résiduel dans le réaménageur de détachement cellulaire peut interférer avec l’essai.
  5. Resuspendez soigneusement la pastille cellulaire dans 2 mL de supports de croissance. Mesurer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide du bleu trypan et d’un compteur cellulaire.
    REMARQUE: La viabilité cellulaire devrait être > 90% pour les meilleurs résultats.
  6. Diluer les cellules à une concentration de 125 cellules/μL. Par exemple, pour un essai de 5 μL, il s’agit de ~625 cellules/μL. Pour une viabilité optimale, gardez les cellules en suspension pour une durée d’au plus 2 h.

7. Incubation de cellules avec inhibiteurs du SHP2

  1. Distribuez les cellules dans un creux stérile de solution à canal unique.
  2. Centrifugeuse 384-bien plaque PCR en temps réel qui a été pré-préparé par le dépôt inhibiteur SHP2 à 2500 x g pendant 5 min à 23 °C.
  3. Retirer le joint de la plaque composée. À l’aide d’une pipette multicanal de 125 μL, ajouter 5 μL des cellules diluées aux puits désirés.
  4. Centrifuger la plaque à 42 x g pendant 30 s sans couvercle sur la plaque. Fixez un joint de couvercle à la plaque après que la plaque est filée vers le bas et incuber la plaque d’essai à 37 °C, 5% de CO2 pendant 1 h.

8. Préparation du mélange maître de reagent chemiluminescent

  1. Retirez la quantité nécessaire de réagenants de détection (réageni EA, tampon de lyse et substrat) de -20 °C de stockage après le placage des cellules. Décongeler les reagents à 23 °C.
    REMARQUE : Pour plus de commodité dans le transfert, préparez un volume qui est 1,5 fois le volume total de cellules qui ont été déposées à la plaque. Ne réutilisez pas les réaménageurs après utilisation.
  2. Préparer un mélange maître des reagents à l’aide de l’état EA-10, qui se compose de composant et fraction de volume comme suit: réageni EA (0,17), tampon de lyse (0,17), substrat (0,67).
    REMARQUE : Les ratios de reagent sont basés sur des expériences d’optimisation effectuées comme spécifié dans le manuel du fournisseur.

9. Impulsion de chaleur de gradient de profil isothermal ou thermique

  1. Programmez le thermocycleur capable de gradient pour la livraison de l’impulsion thermique.
    1. Pour les expériences de gradient de profil thermique, préprogrammer le thermocycleur avec les spécifications d’exemple suivantes :
    2. Impulsion thermique : température de fusion souhaitée de 3 min (gradient vertical ou horizontal +/- 15 °C; exemple 38-68 °C répartis sur 24 puits donne des incréments de température de 1,25 °C).
  2. Étape de récupération de l’équilibrage : 3 min 20 °C avec vitesse de rampe = 1 °C/s
    1. Pour les expériences isothermales mis en place le protocole mis en place comme suit:
    2. Impulsion thermique : 3 min 55 °C. Étape de récupération de l’équilibrage : 3 min 20 °C avec vitesse de rampe = 1 °C/s
      REMARQUE: Pour une reproductibilité accrue, car il peut être difficile de placer la plaque précisément au moment où le thermocycleur atteint la température désirée, configurer le programme pour compter jusqu’à 15 s avant de commencer l’impulsion de 3 min. Pour le thermocycleur utilisé dans cette expérience voir Table of Materials, le couvercle est maintenu pendant l’impulsion thermique.

10. Détection et mesure de la lyse

  1. Compléter les plaques d’analyse avec le mélange maître de détection de lyse par l’ajout de volumes égaux (5 μL) à chaque puits à analyser à l’aide d’une pipette multicanal.
  2. Centrifugeuse de la plaque 42 x g pendant 30 s. Conserver à 23 °C dans l’obscurité pendant 30-60 min.
  3. Mesurer la chimioluminescence à l’aide d’un lecteur de microplaque capable de détecter la luminescence en format 384 puits. Effectuer la mesure de la luminescence avec le type de plaque et le temps d’intégration optimisé (temps d’intégration 1000 ms, temps de régler 0 s). Mesurez les valeurs en tant que nombres/s et extrayant pour une analyse plus approfondie.

11. Analyse des données

  1. Analyser les données de luminescence à l’aide d’un logiciel scientifique de graphique et de statistiques 2D.
  2. Générer des profils thermiques en analysant les données normalisées de luminescence (normalisées au contrôle du véhicule) à l’aide d’une régression non lignenelle et d’un modèle sigmoïde Boltzmann.
    REMARQUE : Dans les expériences de profil thermique, le V50calculé, la température qui est le point à mi-chemin entre le bas et le haut de la courbe, définit la température de fusion de SHP2. Dans les expériences isothermales, EC50 définit la concentration de l’inhibiteur qui donne une réponse demi-maximale.

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Résultats

L’expérience de gradient thermique pour SHP2-WT a donné lieu à un profil thermique cellulaire sigmoïdal avec une transition de fusion étroite qui est typique et cohérente pour une protéine pliée (Figure 4A). SHP2 se compose de trois domaines indépendants : deux domaines SH2 et le domaine catalytique (Figure 1). Dans la conformation fermée autoinhibited ces domaines s’associent eux-même ; la transition de fusion observée dans l’expérience de pr...

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Discussion

Nous avons présenté un test d’engagement cible qui peut confirmer la liaison directe de petites molécules à la phosphatase SHP2 dans les cellules. L’analyse peut faire la distinction entre les inhibiteurs de faible et de haute affinité et, surtout, confirmer un manque de puissance par les inhibiteurs allosteriques du type SHP099 pour le mutant oncogène SHP2-E76K gof. Une force de cet essai miniaturisé est sa capacité à être intégrée dans une campagne de dépistage des inhibiteurs du SHP2. La capacité de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par national Institutes of Health Grant 1R21CA195422 (à L. T.), Epstein Family Foundation Award (à N. D. P.C.), et NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199. En outre, ce projet a été financé en tout ou en partie avec des fonds fédéraux de l’Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no du Consortium de biologie chimique. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des Instituts nationaux de la santé.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
384-well gradient equipped thermocyclerEppendorf AGX50h
384-well low dead volume microplate Echo qualifiedBeckman Coulter, Inc.LP-0200
6-well cell culture platesGreiner Bio-One657 160Sterile with lid
Antibiotic-Antimycotic (Anti Anti) 100 XThermo Fisher Scientific15240-062
Cell counterThermo Fisher ScientificCountess II FL
Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566-016500 mL
Echo acoustic liquid handlerBeckman Coulter, Inc.Echo 550
Electronic multichannel pipetteThermo Fisher ScientificE1 ClipTip
Fetal bovine serumThermo Fisher Scientific26140-079500 mL
HEPES bufferThermo Fisher Scientific15630-680100 mL
InCell Pulse starter kitEurofins DiscoverX Corp.94-4007Components include EA buffer, lysis buffer, and substrate
Microplate readerTecan Trading AGSpark
Single channel solution troughThermo Fisher ScientificS253012005
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360-010100 mM
Thermal microplate sealerAgilent Technologies, Inc.PlateLoc
Transfection reagentsPolyplus TransfectionjetPRIME
Trypan blueThermo Fisher ScientificT10282
TrypLE Express reagentThermo Fisher Scientific12605-010
Twin.tec 384 real-time PCR platesEppendorf AG30132734

Références

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

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