胎儿接触产妇炎症的穆林模型，研究急性胆管炎对新生儿肠道发育的影响

摘要

我们开发了一个胆管炎模型，以模拟胎儿接触产妇炎症（FEMI），而不会引起活体并发症，以检查FEMI对后代肠道发育的影响。这允许研究胆管炎后肠道损伤发展的机械原因。

摘要

胆管炎是早产的常见诱发剂，与早产的许多发病率有关，包括坏死性肠结肠炎（NEC）。然而，这两种情况之间的机械联系仍有待发现。我们采用了胆囊炎的穆林模型，该模型涉及脂糖（LPS）诱导胎儿接触母体炎症（FEMI）。FEMI的这种模型诱导无菌产妇、胎盘和胎儿炎症级联，这在许多临床胆管炎病例中也存在。虽然存在利用活细菌并更准确地模拟上升感染导致胆管炎的病理生理学的模型，但这些方法可能会对不成熟的肠道发育和相关发育的微生物群产生间接影响。使用此协议，我们已经证明，LPS 诱发的 FEMI 导致妊娠损失和早产的剂量依赖性增加，以及后代正常肠道发育的中断。此外，我们已经证明，FEMI显著增加后代的肠道损伤和血清细胞因子，同时减少杯状细胞和Paneth细胞，这两者都提供了肠道炎症的第一线先天免疫力。虽然类似的LPS诱导FEMI模型已经被用来模拟胆管炎和中枢神经系统随后的异常之间的关联，据我们所知，这个协议是第一个试图阐明胆管炎和后来肠道发育的扰动之间的机械联系，作为胆管炎和NEC之间的潜在联系。

引言

胆汁膜在哺乳动物怀孕中起着不可或缺的作用。它们包括具有多种功能的巧克力和氨骨。它们包围和保护胎儿，促进母体和胎儿隔间¹之间的对羟基苯甲烷信号，并在胆汁膜内创建局部反馈回路，这可能参与启动隔膜^1。目前对膜的了解表明，氨基安尼翁提供结构屏障功能，而胆汁提供免疫缓冲，主要保护发育中的胎儿免受母体免疫系统^2。这些膜的炎症被称为胆囊炎。从历史上看，临床胆管炎的诊断是在孕产妇发烧加上一个或多个胎儿或产妇临床发现^3，4后作出的。然而，虽然这个定义在临床上是有用的，但它缺乏精确性使得胆管炎的研究具有挑战性。2015年，为了澄清诊断结果，尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所的专家小组研讨会将胆管炎定义为宫内炎症或感染，或两者兼有（三^I）3。这一澄清是重要的，因为虽然微生物诱发感染是子宫/羊水炎症的一个重要原因，它发生的频率低于无菌子宫/羊水炎症^5，6，7。总的来说，胆管炎仍然是一个严重的公共卫生问题，正如在2\u20124%的定期分娩和25\u201230%的早产^8，9。

胆管炎对胎儿和新生儿有显著影响。文献记载，胆管炎与早产症许多发病率增加有关，包括支气管肺发育不良^10、脑白质损伤^11、心室出血^12、早产视网膜病变^13，以及疑似和确诊的早期新生儿败血症14、15。由于我们对不成熟的肠道的损伤和修复机制感兴趣，因此必须注意，胆管炎也与后来的坏死性肠球炎^{（NEC）15、16}的发展有关。NEC是一种毁灭性的胃肠道疾病的早产儿，导致一个不良的调节主机反应炎症和随后的肠道坏死^17。在美国，NEC每年影响超过4000名婴儿，其中多达三分之一的婴儿死于这种疾病^18。NEC的发病机制可能涉及肠道不成熟、不成熟免疫系统调节不良、肠道炎症和细菌转移¹⁹的组合，最终导致肠道坏死的最后一条常见途径。重要的是，NEC的发病通常发生在出生后几周，并可能暴露于胆管炎，使得胆管炎与NEC随后的发展之间的机械^{联系变得模糊}不清。胆管炎可能有助于NEC病理生理学的一个潜在机制是通过对母体免疫系统的调节，随后产生强烈的胎儿炎症反应，可能破坏正常的胎儿发育模式21，22，23。

啮齿动物和绵羊^{24、25、26、27、28、29、30、31、32}等多种哺乳动物模型存在。然而，在胆管炎引起的胎儿接触产妇炎症（FEMI）之后，很少有关于肠道发育的数据。为了探讨FEMI与不成熟肠道损伤的后续发展之间的关系，我们采用了脂糖（LPS）诱导的FEMI模型。脂糖是克阴性细菌细胞外表面的主要成分，是多种真核物种（包括人类^33）与生俱来的免疫系统的有力刺激剂。产妇LPS注射导致无菌炎症级联，没有活细菌的混淆作用，它是一个成熟的模式诱导早产^34，以及急性胆管炎和胎儿炎症反应综合征（FIRS）的模型，这是最严重的形式的胆囊炎24，35。它也已被证明诱导大脑白质和灰质损伤的绵羊模型³⁶和穆林模型37，38，39，40。然而，据我们所知，我们是第一个使用这种模型的胆管炎和FEMI来调查它对胃肠道发育的影响，过去出生，以及调查胆管炎和NEC^41，42的后期发展之间的可能机械性联系。

研究方案

所有动物程序均由爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（协议#8041401）批准。所有动物都安置在爱荷华大学批准的实验室动物护理评估和认证协会（AALAC）中。所有小鼠都是野生型菌株C57Bl/6J。

1. 在怀孕小鼠中建立FEMI

1. LPS 准备
   1. 使用从 大肠杆菌 O55:B5（库存浓度 2 毫克/毫升）提取的 LPS。
   2. 稀释 LPS 库存浓度 1:100 与无菌盐水的工作浓度为 20μg/mL。
2. 母体 LPS 注射
   1. 在妊娠日e15注入怀孕的水坝。这个时间点是大约75%，通过阴郁的怀孕，使这个模型发展类似于人类怀孕的早期三个月，这是当大多数早产时，由于胆囊炎发生。
   2. 注射前立即称量怀孕小鼠，以确定适当的LPS配给。
   3. 使用以下公式计算工作浓度的剂量:5 μL x 克体重 （gbw），总剂量 LPS 为 100 μg/kg。对于对照动物，使用等量的正常盐水注射。
   4. 每次注射前，涡流 LPS 解决方案在高位 15 秒内三次。
   5. 将LPS音量绘制成1毫升注射器。
   6. 用擦伤技术约束怀孕的老鼠。保持在后部重新任职的位置，并执行注射。
      1. 插入一个30米8毫米针斜面在腹部的右下象限（以避免膀胱和腹部血管）在30\u201240°的角度。插入约1/4至1/2的针的长度。
      2. 在注射前拉回注射器柱塞以确保负压。如果存在负压，则继续注射。
      3. 注射后，监测小鼠约30分钟，然后返回笼子，在怀孕的剩余时间。

2. 分娩和照顾后代，以及肠道收获

1. 通常通过e20阴道分娩交付幼崽。
   注意:此模型确实具有预期的剂量依赖胎儿损失率，可在 图 1 中看到，并在以下结果中讨论。
2. 允许幼崽与母亲呆在一起，并接受脂肪饲料。
3. 在收获日，通常是产后第14天（P14），按照机构动物护理和使用委员会的议定书，通过子宫颈脱位对幼崽实施安乐死。
4. 使用剪刀和钳子，通过皮肤和腹膜，在腹部的中线下做一个垂直切口，整个腹部长度。用剪刀将小肠从胃切除到粪便，用钳子切除肠子。
5. 分离并保留小肠的1/3（人类肠的分节代表），丢弃近端小肠、粪便和结肠。
6. 用剪刀将氦部分分成两半。
7. 将近半部分放在RNA稳定解决方案中，以供以后的RNA定量。
8. 将解剖剂的一半放在 10% 中性缓冲形式中，用于幻灯片准备。

3. 肠道损伤评分

1. 部分石蜡嵌入组织到5 μm厚片，并安装在玻璃滑梯上。
   
   注意:我们将标本发送到石蜡嵌入、分割和安装到幻灯片上的石蜡核心。
2. 根据标准程序去除幻灯片。
3. 根据标准程序，使用血氧林和异丙素的污渍部分。
4. 得分部分在3分尺度内肠损伤，如前所述^42，43。
   1. 使用光显微镜，评估两个单独的失明研究者在3点尺度上对全身肠道损伤进行评估，评估静脉的完整性和与地下室膜⁴³ 的分离（补充图1）。肠道损伤最好按放大20倍和数孔0.50进行评估。
   2. 分配 0 分来描述正常的粘膜。
   3. 分配一个分数1描述轻度损伤，其中包括亚皮鲁恩哈根的空间的发展，真空或副皮提升仅限于拉米纳丙丙或villi的提示。
   4. 分配一个2分来描述严重的伤害，表示上皮提升和蒸发大于一半的维利，维利失真，或粘膜溃疡和拉米纳丙酸的解体。

4. 帕内思和杯细胞的量化

1. 去亲和后，组织部分的污渍滑动从步骤2.8与阿尔西亚蓝/周期酸希夫污渍，以表示杯和帕内思细胞，如先前描述的^44，45根据以下步骤。
   注:虽然阿尔西亚蓝/周期酸希夫污渍不是特定于帕内思或杯状细胞，在我们的经验，失明经验丰富的研究者有等效的细胞定量使用这种污渍相比，细胞靶向抗体，与显着较少的背景染色^46。
2. 脱水、污渍和脱水滑梯如下。
   1. 两次在二甲苯中浸入滑梯 10 分钟。
      注意:二甲苯应用于烟气罩。
   2. 用100%埃托冲洗。
   3. 淹没幻灯片在100%EtOH 3分钟，然后在90%EtOH 3分钟，其次是70%EtOH 3分钟，最后淹没幻灯片在50%EtOH为3分钟。
   4. 在自来水下清洗5分钟。
      注意:将该部分远离自来水，以防止组织样本丢失。
   5. 使用标准咖啡滤镜过滤阿尔西恩蓝色污渍溶液。
   6. 污渍在阿尔西亚蓝色污渍中滑动 15 分钟，然后在自来水下清洗 2 分钟。
   7. 在200mL的双蒸馏水中稀释1毫克周期酸。在此解决方案中浸入幻灯片 5 分钟。然后在自来水下洗1分钟。
   8. 用希夫的试剂污渍 10 分钟。在自来水下清洗5分钟。
   9. 用血氧林将滑梯染色1分钟，然后在自来水下清洗2分钟。
   10. 将它们浸入酸醇（1 mL 盐酸混合在 99 mL 中，70% EtOH）中 1 分钟。
   11. 浸入斯科特的自来水（自来水中NaHCO₃ 浓度0.1%）1分钟，然后在自来水下清洗1分钟。
   12. 脱水滑梯。
       1. 在 70% EtOH 中浸入每个幻灯片 10 次，然后在 90% EtOH 中浸 10 次，在 100% EtOH 中浸 10 次。
       2. 在 100% EtOH 中浸入幻灯片 10 分钟，然后在新鲜的二甲苯中浸入两次，每次 3 分钟。
   13. 在标本上放置一滴安装的介质，并在标本上放置盖子。
3. 杯细胞计数
   1. 使用光显微镜，数数杯细胞（补充图2）。对于每一块肠道组织，计算杯细胞和500上皮细胞的数量，并表达杯细胞比作为每100个上皮细胞的比例。杯形细胞最好按放大20倍和数值光圈0.5计算。
4. 帕内思细胞计数
   1. 使用光显微镜，数数帕内思细胞（补充图2）。对于每一块肠道组织，表达为每个肠道密码的Paneth细胞的比例。每片肠道组织数100个肠道密码。Paneth 细胞最好按 20x-60 倍的放大倍数和数值光圈 0.50-1.30 计算。

结果

在胚胎第15天接触FEMI会导致妊娠依赖剂量的丧失和早产的剂量依赖率（图1）42。在实验中，我们选择使用 100μg/kg 的 LPS 剂量来尽量减少妊娠损失和早产（早产期和宫内胎儿死亡之间 50% 的损失），同时使胎儿受到严重的炎症性侮辱。

使用这种方法，我们接下来检查了FEMI对后代后续伤害的影响。使用3点组织学量表测量全身肠道损伤，我...

讨论

胆管炎影响2\u20124%的期限和25\201230%的早产^8，9。然而，胆管炎的影响可以延长很久的出生，因为它已被证明对胎儿和新生儿有显著的影响10，11，12，13，14，15，16。重要的是，胆...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056