신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

요약

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

초록

Chorioamnionitis는 조산의 일반적인 침전물이고 괴사 장염 (NEC)을 포함하여 미숙아의 이환의 많은 것과 연관됩니다. 그러나, 이 두 조건 사이 기계적인 링크는 아직 발견되지 않았습니다. 우리는 모성 염증 (FEMI)에 리포 폴리삭차라이드 (LPS)유도 태아 노출을 포함하는 chorioamnionitis의 뮤린 모델을 채택했습니다. FEMI의 이 모형은 또한 임상 chorioamnionitis의 많은 경우에 존재하는 멸균 모계, 태반 및 태아 선동적인 폭포를 유도합니다. 살아있는 박테리아를 이용하고 더 정확하게 chorioamnionitis의 결과로 상승 감염의 병리 생리학을 모방하는 모형이 존재하더라도, 이 방법은 미숙한 창자 및 관련 개발 microbiome의 발달에 간접적인 효력을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 LPS 유도 FEMI가 임신 손실및 조산에 있는 복용량 의존적인 증가, 뿐만 아니라 자손에 있는 일반적인 장 발달의 중단에 초래한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 우리는 FEMI가 자손에 있는 장 상해 및 혈청 사이토카인을 현저하게 증가시키는 것을 보여주었습니다, 동시에 진보와 Paneth 세포를 감소시키면서, 둘 다 장 염증에 대하여 선천적인 면역의 첫번째 줄을 제공하는. LPS 유도 FEMI의 유사한 모형은 chorioamnionitis와 중추 신경계의 후속 이상 사이 협회를 모델링하기 위하여 이용되었지만, 우리의 지식에, 이 프로토콜은 chorioamnionitis와 NEC 사이 잠재적인 링크로 chorioamnionitis 및 NEC 사이 기계적인 링크를 해명하기 위하여 시도하는 첫번째입니다.

서문

융경막은 포유류 임신에 필수적인 역할을 합니다. 그들은 여러 기능을 제공하는 초리온과 양상을 포함한다. 그들은 태아를 둘러싸고 보호하고, 모계와 태아 구획¹사이의 파라크리니 신호를 용이하게하고, 파리오닉 멤브레인 내에서 로컬 피드백 루프를 생성하여 parturition^1을시동하는 데 관여할 수 있다. 멤브레인의 현재 이해는 양막이 구조적 장벽 기능을 제공한다는 것을 나타내며, 초리온은 주로 모계 면역 계통^2로부터발전하는 태아를 보호하기 위해 면역학적 완충제를 제공한다. 이 막의 염증은 chorioamnionitis로 알려져 있습니다. 역사적으로, 임상 초리오암니온염의 진단은 모계 열플러스 하나 이상의 태아 또는 모계 임상^발견의존재에 따라 만들어졌으며^3,4. 그러나, 이 정의는 임상적으로 유용하지만, 정밀도의 부족은 chorioamnionitis 연구를 도전하게 했습니다. 2015년, 진단을 명확히 하기 위해 유니스 케네디 슈리버 국립아동보건연구원의 전문가 패널 워크숍은 충야염염을 자궁내 염증 또는 감염 또는 둘 다(트리플 I)^3로정의했다. 이러한 설명은 미생물 유도 감염이 자궁/양수 염증의 중요한 원인이지만 멸균 자궁/양수 염증^5,6,7보다덜 일반적으로 발생하기 때문에 중요하다. 전반적으로, chorioamnionitis는 기간 납품의 2\u20124%와 조산 납품의 25\u201230%에서 볼 수 있듯이 중요한 공중 위생 문제점 남아 있습니다^8,9.

Chorioamnionitis 태아와 신천에 중요 한 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 잘 충진성 측량 이형성증을 포함하여 미숙아의 많은 이환의 증가 리스크와 연관된다는 것을 문헌에서 잘 문서화되었습니다^10,뇌백색 물질 상해^11,정맥 내 출혈^12,미숙아 출혈^13의망막 출혈, 및 모두 의외및 신생아^{14, 14의}초기^확인. 미숙한 장내 부상 및 수리 메커니즘에 관심이 있기 때문에, 초리오암니온염은 또한 괴사장염(NEC)^15,16의나중에 개발과 연관된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. NEC는 염증 및 후속 장 괴사^(17)에대한 난독증 숙주 반응을 초래하는 조산 유아의 치명적인 위장 질환이다. NEC는 매년 미국에서 4,000명 이상의 유아에게 영향을 미치고 있으며, 이들 유아의 3분의 1은^18세질병으로 사망합니다. NEC의 발병기는 아마도 장 미성숙의 조합을 포함, 미성숙 면역 체계의 dysregulation, 장 염증, 세균성 전좌^19,장 괴사의 최종 일반적인 경로에 절정. 중요한 것은, NEC의 개시는 수시로 출생 후에 주 및 chorioamnionitis에 잠재적인 노출을, chorioamnionitis와 NEC의 후속 발달 사이 기계론링크를 불분명하게^{만듭니다.} chorioamnionitis가 NEC의 병리 생리학에 기여할 수 있는 1개의 잠재적인 기계장치는 모계 면역 계통의 강화 조절을 통해서, 그 후에 정상 태아 발달 패턴을 방해할 수 있는 강한 태아 선동반응을^{생성합니다(21,22,23).}

초리오암니온염의 다중 포유류 모델은 설치류 및 양^{24,25,26,27,28,29,30,31,32에}존재한다. 그러나, 모성 염증에 대한 초암니염 유도 태아 노출(FEMI)에 이어 초기 신생아 기간을 넘어 장내 발병에 관한 몇 가지 데이터가 존재한다. FEMI와 미숙한 장의 부상의 후속 개발 사이의 관계를 탐구하기 위해, 우리는 리포 폴리사카라이드 (LPS)유도 FEMI 모델을 적응했다. 리포폴리사카라이드는 그람 음성 박테리아에 세포 외 표면의 주요 구성 요소이며 인간을 포함한 다중 진핵종의 타고난 면역 계통의 강력한^{자극제(33)이다.} 모계 LPS 주사는 살아있는 박테리아의 혼동 효과 없이 멸균 염증 폭포를 초래하고, 조산^34의유도를 위한 잘 확립된 모델일 뿐만 아니라 급성 초리암니온염 및 태아 염증 반응 증후군(FIRS)의 모델, 이는 가장 심한 형태의 초리오암니온염(24,^35)이다. 또한 양모델(36)과 뮤린^{모델(37, 38,39,40)에서}대뇌 백색 및 회색 물질 상해를 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 우리의 지식에, 우리는 chorioamnionitis와 FEMI의이 모델을 사용하여 출생 과거 위장의 발달에 미치는 영향을 조사하고, chorioamnionitis및 NEC^41의나중에 개발 사이의 가능한 기계론적 링크를 조사하기^위해.

프로토콜

모든 동물 절차는 아이오와 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 #8041401)에 의해 승인되었다. 모든 동물은 아이오와 대학에서 승인 된 실험실 동물 관리 (AALAC)의 평가 및 인증 협회에 보관되었습니다. 모든 마우스는 야생 형 균주 C57Bl/6J였다.

1. 임신 한 쥐에 FEMI의 설립

1. LPS 준비
   1. 에샤리치아 대장균 O55:B5(재고 농도 2 mg/mL)에서 파생된 LPS를 사용하십시오.
   2. 20 μg/mL의 작동 농도에 대한 멸균 식염수로 LPS 재고 농도 1:100을 희석합니다.
2. 모계 LPS 주입
   1. 임신 일 e15에 임신 한 댐을 주입하십시오. 이 시점은 뮤린 임신을 통해 약 75%이며, 이 모델은 초리암니온염으로 인한 조산의 대부분이 발생하는 인간 임신의 초기 세 번째 삼보격과 발달적으로 유사합니다.
   2. 적절한 LPS 주입을 결정하기 위해 주사 직전에 임신 한 마우스를 무게.
   3. 다음 공식을 사용하여 작업 농도의 용량을 계산합니다: 5 μL x 그램 체중(gbw), 100 μg/kg의 LPS의 총 용량. 제어 동물의 경우, 주사에 대한 일반 식염수의 동등한 볼륨을 사용합니다.
   4. 소용돌이 LPS 용액은 각 주입 전에 높은 15 초 동안 세 번.
   5. LPS 볼륨을 1mL 주사기로 그립니다.
   6. 스크러핑 기술로 임신 한 마우스를 억제하십시오. 등대 반수 위치에 잡고 주사를 수행합니다.
      1. 30\u201240° 각도에서 복부의 오른쪽 아래 사분면(방광 및 복부 혈관을 피하기 위해)을 위에 30 게이지 8mm 바늘 벨을 삽입합니다. 바늘의 길이를 약 1/4 ~ 1/2로 삽입합니다.
      2. 주사기 플런저에 다시 당겨 주입하기 전에 부정적인 압력을 보장합니다. 음압이 존재하는 경우 주사를 진행합니다.
      3. 주사 후, 약 30 분 동안 마우스를 모니터링 한 다음 임신의 나머지 부분에 대한 케이지로 돌아갑니다.

2. 자손의 납품 및 관리, 장 수확

1. e20에서 질 전달을 통해 일반적으로 새끼를 전달합니다.
   참고: 이 모델은 그림 1에서 볼 수 있는 예상 복용량 의존 태아 손실 률을 가지고 있으며 아래 결과에서 논의 됩니다.
2. 새끼가 어머니와 함께 남아 광고 리비툼 피드를받을 수 있습니다.
3. 수확당일, 일반적으로 산후 14일(P14)은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜에 따라 자궁 경부 탈구를 통해 새끼를 안락사시합니다.
4. 가위와 집게를 사용하여 복부의 중간선 아래로 수직 절개를 하고, 피부와 복막을 통해 복부의 전체 길이를 만듭니다. 가위로 소장을 위장에서 cecum에 게 이 음 하 고 집게와 장간을 제거 합니다.
5. 소장의 1/3(인간 일루를 대표하는 부분)를 분리하고 유지하여 근위 소장, cecum 및 결장을 폐기한다.
6. 가위를 사용하여 일레움 부분을 반으로 나눕니다.
7. 이후 RNA 정량화를 위해 RNA 안정화 용액에 근위 절반을 놓는다.
8. 슬라이드 준비를 위해 10% 중립 버퍼링 포름틴에 탈반 절반을 배치합니다.

3. 장 부상 득점

1. 섹션 파라핀 은 5 μm 두께의 슬라이스에 조직을 내장하고 유리 슬라이드에 마운트.
   
   참고: 우리는 파라핀 포함, 단면 및 슬라이드에 장착을 위한 히스토로지 코어로 표본을 보냅니다.
2. 표준 절차에 따라 슬라이드를 분리합니다.
3. 표준 절차에 따라 헤마톡슬린과 에신을 가진 얼룩 섹션.
4. 앞서 설명한 바와 같이 장 내 부상에 대한 3점 척도의 점수^{섹션은 42,43.}
   1. 경현미경검사를 사용하여, 지하^{멤브레인(43)으로부터의} 고루 무결성 및 분리를 평가하는 3점 척도에서 2명의 별도 맹목적인 수사관에 의한 일반화된 장 손상을 평가한다(보충도1). 장 내 부상은 20배율 및 수치 조리개 0.50에서 가장 잘 평가됩니다.
   2. 일반 점막을 설명하기 위해 점수0을 할당합니다.
   3. 1의 점수를 할당하는 것은 부피 그루엔하겐의 공간, vacuolization 또는 빌리의 팁에 국한 된 피상적 인 리프팅의 개발을 포함하는 가벼운 부상을 설명합니다.
   4. 심한 부상을 설명하기 위해 2의 점수를 할당, 상피 리프팅 및 바이크 올무의 절반 이상 큰 vacuolization에 의해 표시, 빌리 왜곡, 또는 점막 궤양 및 라미나 프로프리아의 붕괴.

4. 창과 잔 세포의 정량화

1. deparaffinization 다음, 알시안 블루/주기산 쉬프 얼룩을 가진 단계 2.8에서 조직 섹션의 얼룩 슬라이드는 이전에 설명된 바와 같이 잔과 창세포 모두를 나타내기 위하여^44,45 다음 단계에 따라.
   참고: 알시안 블루/주기성 산 쉬프 얼룩은 창이나 잔 세포에 만연하지 않지만, 우리의 경험에서, 맹목적인 숙련 된 조사자는 세포 표적 항체에 비해이 얼룩을 사용하여 동등한 세포 정량화를 가지고 있으며, 훨씬 적은 배경 염색^46.
2. 다음과 같이 탈수 슬라이드를 분리, 얼룩 및 탈수합니다.
   1. 자일렌에 있는 슬라이드를 10분 동안 두 번 잠급합니다.
      주의: 자일렌은 연기 후드에 사용해야합니다.
   2. 100% EtOH로 헹구는 다.
   3. 3분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 3분 동안 100% EtOH, 3분 동안 90% EtOH, 3분 동안 70% EtOH, 마지막으로 3분 동안 50%의 EtOH를 침수합니다.
   4. 흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오.
      주의: 티슈 샘플의 손실을 방지하기 위해 흐르는 물에서 멀리 부분을 가리킵니다.
   5. 표준 커피 필터로 알시안 블루 스테인 솔루션을 필터링합니다.
   6. 알시안 블루 스테인에서 15분 동안 스테인슬라이드를 한 다음 흐르는 수돗물 아래에서 2분 간 세척합니다.
   7. 이중 증류수 200mL에 1 mg의 주기산을 희석합니다. 이 솔루션의 슬라이드를 5분 동안 잠수합니다. 그런 다음 흐르는 수돗물 에서 1 분 동안 씻으릅니다.
   8. 10 분 동안 쉬프의 시약으로 얼룩. 흐르는 수돗물 에서 5 분 동안 씻으시면 하십시오.
   9. 헤마톡슬린으로 슬라이드를 1분 동안 묻은 다음 흐르는 수돗물 에서 2분 동안 세척합니다.
   10. 산성 알코올 (1 mL의 염산 혼합 99 mL에서 70 % EtOH)에 1 분 동안 담급니다.
   11. 스콧의 수돗물(수돗물에 NaHCO₃ 농도 0.1%)에 1분 동안 담근 다음 흐르는 수돗물 에서 1분 동안 세척합니다.
   12. 슬라이드를 탈수합니다.
       1. 각 슬라이드를 70% EtOH로 10회 찍어 90% EtOH에서 10회, EtOH100%로 10회 찍어 보세요.
       2. 10분 동안 100% EtOH로 슬라이드를 잠그고, 신선한 자일렌에 두 번 잠급하여 각각 3분 동안 잠급됩니다.
   13. 시편에 장착 용지 한 방울을 놓고 덮개 슬립을 위에 놓습니다.
3. 잔 세포 계산
   1. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 잔 세포를 계산합니다(보충 도 2). 장 조직의 각 조각에 대 한, 잔 세포의 수를 계산 하 고 500 상피 세포 와 표현 잔 세포 비율을 100 상피 세포 당 비율로. 잔 세포는 20배율 및 수치 조리개 0.5에서 가장 잘 계산됩니다.
4. 창세포 계수
   1. 가벼운 현미경 검사를 사용하여창세포(보충도 2)를계산합니다. 장 조직의 각 조각에 대 한, 창 자 지하실 당 창 세포의 비율로 표현. 장 조직의 각 조각당 100개의 장 내 지하실을 계산합니다. 창세포는 20x-60x 배율 및 수치 조리개 0.50-1.30으로 가장 잘 계산됩니다.

결과

배아 일째에 FEMI에 노출15 임신의 용량 의존손실과 조산 노동의 투여 의존율로 이어집니다(그림 1)^42. 실험을 위해, 우리는 중요한 선동적인 모욕에 태아를 드러내면서 임신 손실 및 미숙아 (미숙아와 자궁 내 태아 죽음 둘 다 사이 50% 손실)를 극소화하기 위하여 100 μg/kg의 LPS 복용량을 사용하기로 결정했습니다.

이 방법을 사용하여, 우리...

토론

Chorioamnionitis 영향 2\u20124% 기간의 및 25\u201230% preterm 납품의^8,9. 그러나, 초리오암니온염의 영향은 태아와신생아^{10,11,12,13,14,15,16에}중요한 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056