Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né

Résumé

Nous avons développé un modèle de chorioamnionite pour simuler l’exposition foetale à l’inflammation maternelle (FEMI) sans complications des organismes vivants pour examiner les effets de FEMI sur le développement du tractus intestinal de la progéniture. Ceci permet l’étude des causes mécanistes pour le développement des dommages intestinaux suivant chorioamnionitis.

Résumé

Chorioamnionitis est un précipité commun de la naissance prématurée et est associé à beaucoup des morbidités de la prématurité, y compris l’entérocolite nécrosante (NEC). Cependant, un lien mécaniste entre ces deux conditions reste à découvrir. Nous avons adopté un modèle murin de chorioamnionitis impliquant l’exposition foetale lipopolysaccharide (LPS)-induite à l’inflammation maternelle (FEMI). Ce modèle de FEMI induit une cascade inflammatoire maternelle, placentaire, et foetale stérile, qui est également présente dans beaucoup de cas de chorioamnionitis clinique. Bien qu’il existe des modèles qui utilisent des bactéries vivantes et imitent plus précisément la pathophysiologie d’une infection ascendante entraînant une chorioamnionite, ces méthodes peuvent causer des effets indirects sur le développement du tractus intestinal immature et du microbiome en développement associé. En utilisant ce protocole, nous avons démontré que l’IGF induite par le SLS entraîne une augmentation dépendante de la dose de la perte de grossesse et de la naissance prématurée, ainsi que la perturbation du développement intestinal normal chez la progéniture. En outre, nous avons démontré que FEMI augmente de manière significative les dommages intestinaux et les cytokines sériques chez la progéniture, tout en diminuant simultanément les cellules de gobelet et de Paneth, qui fournissent toutes deux une première ligne d’immunité innée contre l’inflammation intestinale. Bien qu’un modèle semblable de FEMI LPS-induit ait été employé pour modéliser l’association entre chorioamnionitis et anomalies suivantes du système nerveux central, à notre connaissance, ce protocole est le premier à essayer d’élucider un lien mécaniste entre chorioamnionitis et perturbations plus tard dans le développement intestinal comme lien potentiel entre chorioamnionitis et NEC.

Introduction

Les membranes chorioniques jouent un rôle essentiel dans la grossesse chez les mammifères. Ils comprennent le chorion et l’amnion, qui servent de multiples fonctions. Ils entourent et protègent le foetus, facilitent la signalisation paracrine entre les compartiments maternel et fœtal^1,et créent des boucles de rétroaction locales dans les membranes chorioniques, qui peuvent être impliquées dans l’initiation de la parturition¹. La compréhension actuelle des membranes indique que l’amnion fournit la fonction structurale de barrière, et le chorion fournit un tampon immunologique principalement pour protéger le foetus en développement du système immunitaire maternel^2. L’inflammation de ces membranes est connue sous le nom de chorioamnionite. Historiquement, le diagnostic de chorioamnionitis clinique a été fait suivant la présence de la fièvre maternelle plus un ou plusieurs résultats cliniques foetaux ou^{maternels 3,4.} Cependant, bien que cette définition soit cliniquement utile, son manque de précision a rendu la recherche sur la chorioamnionite difficile. En 2015, dans le but de clarifier le diagnostic, un atelier d’experts de l’Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development a défini la chorioamnionite comme une inflammation intra-utérine, ou une infection, ou les deux (triple I)³. Cette clarification est importante parce que tandis que l’infection induite microbienne est une cause importante de l’inflammation utérine/amniotique, elle se produit moins généralement que l’inflammation utérine/amniotique^{stérile 5,6,7.} Dans l’ensemble, la chorioamnionite reste un problème de santé publique important, comme on le voit dans 2\u20124% des accouchements à terme et 25\u201230% des accouchements prématurés^8,9.

Chorioamnionitis peut avoir des effets significatifs sur le foetus et le nouveau-né. Il a été bien documenté dans la littérature que chorioamnionitis est associé au risque accru de beaucoup des morbidités de la prématurité, y compris la dysplasie bronchopulmonaire^10,dommages cérébraux de matière blanche^11,hémorragie intraventriculaire^12,rétinopathie de la prématurité¹³, et à la fois suspecté et confirmé sepsis néonatal de début^{tôt 14,15}. Comme nous nous intéressons aux mécanismes de blessure et de réparation du tractus intestinal immature, il est important de noter que la chorioamnionite est également associée au développement ultérieur de l’entérocolite nécrosante (NEC)^15,16. Nec est une maladie gastro-intestinale dévastatrice des enfants en bas âge prématurés qui a comme conséquence une réponse dysregulated d’hôte à l’inflammation et à la nécrose intestinale^{suivante 17.} Chaque année, nec affecte plus de 4000 nourrissons aux États-Unis, et jusqu’à un tiers de ces nourrissons meurent de la maladie¹⁸. La pathogénie de NEC implique probablement une combinaison de l’immaturité intestinale, de la dysrégulation du système immunitaire immature, de l’inflammation intestinale, et de la translocation^{bactérienne 19,}culminant dans une voie commune finale de nécrose intestinale. Fait important, le début du NEC se produit souvent des semaines après la naissance et l’exposition potentielle à la chorioamnionitis, rendant le lien mécaniste entre chorioamnionitis et développement suivant de NEC^{peu clair 20.} Un mécanisme potentiel par lequel la chorioamnionite peut contribuer à la pathophysiologie de NEC est par la déréglementation du système immunitaire maternel, produisant plus tard une réponse inflammatoire foetale forte qui peut perturber les modèles développementaux foetaux^{normaux 21,22,23.}

Plusieurs modèles mammifères de chorioamnionite existent chez les rongeurs et les moutons^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Cependant, peu de données existent concernant le développement du tractus intestinal au-delà de la période initiale du nouveau-né suivant l’exposition foetale induite par chorioamnionitis à l’inflammation maternelle (FEMI). Afin d’explorer la relation entre FEMI et le développement ultérieur des dommages du tractus intestinal immature, nous avons adapté le modèle fEMI lipopolysaccharide (LPS) induit. Les lipopolysaccharides sont un composant majeur de la surface extracellulaire sur les bactéries gram négatives et sont un puissant stimulant du système immunitaire inné de multiples espèces eucaryotes, y compris les^{humains 33}. L’injection maternelle de LPS a comme conséquence une cascade inflammatoire stérile sans les effets confusionnels des bactéries vivantes, et c’est un modèle bien établi pour l’induction de la naissance prématurée^34,aussi bien qu’un modèle de chorioamnionitis aiguë et du syndrome foetal de réponse inflammatoire (FIRS), qui est la forme la plus grave de chorioamnionitis^24,35. Il a également été démontré qu’il induit à la fois des lésions cérébrales de matière blanche et grise dans un modèle^{de mouton 36} et un modèle murin^37,38,39,40. Cependant, à notre connaissance, nous sommes les premiers à utiliser ce modèle de chorioamnionitis et FEMI pour étudier ses effets sur le développement du tractus gastro-intestinal après la naissance, ainsi que pour étudier un lien mécaniste possible entre chorioamnionitis et développement ultérieur de NEC^41,42.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa (Protocole #8041401). Tous les animaux étaient logés dans un vivarium approuvé par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) à l’Université de l’Iowa. Toutes les souris étaient souches sauvages C57Bl/6J.

1. Établissement de femi chez les souris enceintes

1. Préparation LPS
   1. Utilisez le LPS dérivé d’Escherichia coli O55:B5 (concentration de stock 2 mg/mL).
   2. Diluer la concentration de stock de LPS 1:100 avec la solution saline stérile pour une concentration de travail de 20 μg/mL.
2. Injection maternelle de LPS
   1. Injecter des mères enceintes au jour de gestation e15. Ce point de temps est d’environ 75% par la grossesse murine, ce qui rend ce modèle développementairement similaire au début du troisième trimestre des grossesses humaines, qui est quand la majorité des naissances prématurées dues à la chorioamnionite se produisent.
   2. Pesez les souris enceintes immédiatement avant l’injection pour déterminer le dosage approprié du SLSP.
   3. Calculez la dose de concentration de travail en utilisant la formule suivante : 5 μL x gramme de poids corporel (gbw), pour une dose totale de LPS de 100 μg/kg. Pour les animaux de contrôle, utilisez un volume équivalent de solution saline normale pour l’injection.
   4. Vortex LPS solution trois fois pendant 15 secondes sur le haut avant chaque injection.
   5. Dessinez le volume LPS dans une seringue de 1 mL.
   6. Retenir la souris enceinte avec la technique de scruffing. Maintenez la position dorsale de la couchée et effectuez l’injection.
      1. Insérez une aiguille de calibre 30 de 8 mm qui se dénabère au-dessus du quadrant inférieur droit de l’abdomen (pour éviter les vaisseaux vésicaux et abdominaux) à un angle de 30\u201240°. Insérer environ 1/4 à 1/2 de la longueur de l’aiguille.
      2. Reculez sur le piston de seringue pour assurer une pression négative avant l’injection. Procéder à l’injection si une pression négative est présente.
      3. Après l’injection, surveiller les souris pendant environ 30 minutes, puis retourner dans des cages pour le reste de la grossesse.

2. Livraison et soin de la progéniture, et récolte intestinale

1. Livrer les chiots normalement par voie vaginale à e20.
   REMARQUE : Ce modèle a un taux de perte fœtale dépendant de la dose qui peut être vu à la figure 1 et qui est discuté dans les résultats ci-dessous.
2. Permettre aux chiots de rester avec les mères et de recevoir des aliments ad libitum.
3. Le jour de la récolte, généralement après le jour 14 (P14), euthanasier les petits par dislocation cervicale conformément aux protocoles du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
4. À l’aide de ciseaux et de forceps, faire une incision verticale sur la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, sur toute la longueur de l’abdomen. Exciser l’intestin grêle de l’estomac au cécu avec des ciseaux et enlever la mesenterie avec des forceps.
5. Isoler et garder le distal 1/3 de l’intestin grêle (section représentative de l’iléum humain), en jetant l’intestin grêle proximal, le cécu, et le côlon.
6. Diviser la portion d’iléum en deux à l’aide de ciseaux.
7. Placez la moitié proximale dans une solution de stabilisation de l’ARN pour une quantification ultérieure de l’ARN.
8. Placer la moitié distale dans une formaline tamponnée neutre à 10 % pour la préparation des diapositives.

3. Notation intestinale de blessure

1. Sectionz le tissu incorporé paraffine en tranches de 5 μm d’épaisseur et montez sur des glissières en verre.
   
   REMARQUE : Nous envoyons les spécimens à un noyau d’histologie pour l’intégration, la sectionne et le montage de paraffine sur des toboggans.
2. Déparaffiniser les diapositives selon les procédures standard.
3. Sections de tache avec l’hématoxyline et l’éosine selon les procédures standard.
4. Marquer des sections sur une échelle de 3 points pour les blessures intestinales comme décrit^{précédemment 42,43}.
   1. À l’aide d’une microscopie légère, évaluer les lésions intestinales généralisées par deux chercheurs aveugles distincts sur une échelle de 3 points évaluant l’intégrité et la séparation villus de la membrane^{du sous-sol 43} (Figure supplémentaire 1). Les dommages intestinaux sont mieux évalués au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.50.
   2. Attribuez un score de 0 pour décrire la muqueuse normale.
   3. Assignez une note de 1 décrire les blessures légères qui englobent le développement de l’espace subepithelial Gruenhagen, la vacuolisation ou le levage subepithelial limité à la propria lamina ou des pointes de villi.
   4. Attribuez une note de 2 pour décrire les blessures graves, indiquées par le levage épithélial et la vacuolisation supérieures à la moitié des villosités, la distorsion des villosités ou l’ulcération muqueuse et la désintégration des propria lamina.

4. Quantification des cellules de Paneth et de gobelet

1. Après la déparaffinisation, les glissements de tache des sections de tissu de l’étape 2.8 avec la tache bleue/périodique d’acide d’Alcian pour indiquer les cellules de gobelet et de Paneth comme^{précédemment décrit 44,45} selon les étapes suivantes.
   REMARQUE : Tandis que la tache bleue/périodique de Schiff d’acide d’Alcian n’est pas spécifique aux cellules de Paneth ou de gobelet, dans notre expérience, les investigateurs expérimentés aveuglés ont la quantification cellulaire équivalente utilisant cette tache comparée aux anticorps ciblés cellulaires, avec sensiblement moins de taches de fond^46.
2. Déparaffiner, tacher et déshydrater les diapositives comme suit.
   1. Submerger les toboggans en xylène pendant 10 min deux fois.
      AVERTISSEMENT : Xylene doit être employé dans un capot de fumée.
   2. Rincer à 100% EtOH.
   3. Submergez les glissières en 100 % EtOH pendant 3 min, puis en 90% EtOH pendant 3 min, suivies de 70% d’EtOH pendant 3 min, et enfin submergez les diapositives dans 50% EtOH pendant 3 min.
   4. Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
      MISE EN GARDE : Éloignez la section de l’eau courante pour éviter la perte d’échantillon de tissu.
   5. Filtrez la solution de tache bleue alcienne avec un filtre à café standard.
   6. Taches glissées dans la tache bleue alcienne pendant 15 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
   7. Diluer 1 mg d’acide périodique dans 200 mL d’eau distillée double. Submergez les glissières dans cette solution pendant 5 min. Ensuite, laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
   8. Tache avec le réaménagement de Schiff pendant 10 min. Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
   9. Tacher les toboggans avec de l’hématoxyline pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
   10. Submergez-les dans de l’alcool acide (1 mL d’acide chlorhydrique mélangé à 99 mL de 70% d’EtOH) pendant 1 min.
   11. Submerger dans l’eau du robinet de Scott (concentration de 0,1 % de NaHCO_{3 dans} l’eau du robinet) pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
   12. Déshydratez les diapositives.
       1. Plongez chaque diapositive 10 fois dans 70% EtOH, puis plongez 10 fois dans 90% EtOH, et 10 fois dans 100% EtOH.
       2. Submergez les glissières dans 100% EtOH pendant 10 min, puis submergez deux fois en xylène frais pendant 3 min chacune.
   13. Placez une goutte de supports de montage sur le spécimen et placez un coverslip sur elle.
3. Comptage des cellules de gobelet
   1. À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de gobelet(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, comptez le nombre de cellules gobelet et 500 cellules épithéliales et le rapport express de cellules de gobelet comme rapport par 100 cellules épithéliales. Les cellules de gobelet sont mieux comptées au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.5.
4. Comptage des cellules de Paneth
   1. À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de Paneth(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, exprimer comme un rapport de cellules Paneth par crypte intestinale. Comptez 100 cryptes intestinales par morceau de tissu intestinal. Les cellules de paneth sont mieux comptées au grossissement de 20x-60x et à l’ouverture numérique 0.50-1.30.

Résultats

L’exposition à l’IGF le jour embryonnaire 15 entraîne une perte de grossesse dépendante de la dose et un taux dépendant de la dose de travail prématuré (figure 1)⁴². Pour les expériences, nous avons choisi d’utiliser une dose de LPS de 100 μg/kg pour minimiser la perte de grossesse et la prématurité (perte de 50% entre la prématurité et la mort fœtale intra-utérine) tout en exposant les fœtus à une insulte inflammatoire significative.

Discussion

Chorioamnionitis impacts 2\u20124% de terme et 25\u201230% des accouchements prématurés^8,9. Cependant, l’impact de la chorioamnionite peut prolonger la naissance longue après car il a été montré pour avoir des effets significatifs sur le foetus et le^{nouveau-né 10,11,12,13,14,}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056