Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Resumo

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Resumo

A coioamnionite é um precipitante comum do nascimento prematuro e está associada a muitas das morbidades da prematuridade, incluindo enterocolite necrosante (NEC). No entanto, ainda não foi descoberto um elo mecanicista entre essas duas condições. Adotamos um modelo murino de coioamnionite envolvendo lipopolisacarídeo (LPS) induzido exposição fetal à inflamação materna (FEMI). Este modelo de FEMI induz uma cascata inflamatória materna, placentária e fetal estéril, que também está presente em muitos casos de coioamnionite clínica. Embora existam modelos que utilizem bactérias vivas e imitem com mais precisão a fisiopatologia de uma infecção ascendente que resulta em coioamnionite, esses métodos podem causar efeitos indiretos no desenvolvimento do insorudo do trato intestinal imaturo e do microbioma em desenvolvimento associado. Usando este protocolo, demonstramos que o FEMI induzido pelo LPS resulta em um aumento dependente de dose na perda de gravidez e nascimento prematuro, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal na prole. Além disso, demonstramos que o FEMI aumenta significativamente a lesão intestinal e citocinas séricas na prole, ao mesmo tempo em que diminui as células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. Embora um modelo semelhante de FEMI induzido pelo LPS tenha sido usado para modelar a associação entre corioamnionite e anormalidades subsequentes do sistema nervoso central, pelo que sabemos, este protocolo é o primeiro a tentar elucidar um elo mecanicista entre a coioamnionite e posterior perturbações no desenvolvimento intestinal como um potencial elo entre a coioamnionite e a NEC.

Introdução

As membranas coriônicas desempenham um papel integral na gravidez dos mamíferos. Eles incluem o acorde e amnion, que servem múltiplas funções. Cercam e protegem o feto, facilitam a sinalização paracrina entre os compartimentos materno e fetal¹, e criam laços de feedback locais dentro das membranas coriônicas, que podem estar envolvidas no início da parturição¹. A compreensão atual das membranas indica que o amnion fornece função de barreira estrutural, e o acorde fornece um tampão imunológico principalmente para proteger o feto em desenvolvimento do sistema imunológico materno². A inflamação dessas membranas é conhecida como coioamnionite. Historicamente, o diagnóstico de coioamnionite clínica foi feito após a presença de febre materna mais um ou mais achados clínicos fetais ou maternos^3,4. No entanto, embora essa definição seja clinicamente útil, sua falta de precisão tornou a pesquisa de coioamnionite desafiadora. Em 2015, na tentativa de esclarecer o diagnóstico, uma oficina de painéis de especialistas do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver definiu a coioamnionite como inflamação intrauterina, ou infecção, ou ambos (triplo I)³. Esse esclarecimento é importante porque, embora a infecção induzida por microbiano seja uma importante causa de inflamação uterina/amniótica, ocorre menos comumente do que a inflamação uterina/amniótica estéril^5,6,7. No geral, a coioamnionite continua sendo um problema significativo de saúde pública, como é visto em 2\u20124% dos partos a termo e 25\u201230% das entregas pré-termo^8,9.

A coioamnionite pode ter efeitos significativos no feto e no recém-nascido. Tem sido bem documentado na literatura que a coioamnionite está associada ao aumento do risco de muitas das morbidades da prematuridade, incluindo displasia broncopulmonar¹⁰, lesão de matéria branca cerebral^11,hemorragia intraventricular¹², retinopatia da prematuridade¹³, e tanto suspeita e confirmada início precoce da sepse neonatal^14,15. Como estamos interessados em mecanismos de lesão e reparação do trato intestinal imaturo, é importante notar que a coioamnionite também está associada ao desenvolvimento posterior da enterocolite necrosante (NEC)^15,16. A NEC é uma doença gastrointestinal devastadora de bebês prematuros que resulta em uma resposta desregulada do hospedeiro à inflamação e necrose intestinal subsequente¹⁷. A cada ano, a NEC afeta mais de 4.000 bebês nos Estados Unidos, e até um terço desses bebês morrem pela doença¹⁸. A patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana^19,culminando em uma via comum final de necrose intestinal. É importante ressaltar que o início da NEC ocorre muitas vezes semanas após o nascimento e exposição potencial à coioamnionite, tornando incerto o vínculo mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC²⁰. Um mecanismo potencial pelo qual a coioamnionite pode contribuir para a fisiopatologia da NEC é através da regulação do sistema imunológico materno, produzindo posteriormente uma forte resposta inflamatória fetal que pode interromper os padrões normais de desenvolvimento fetal^21,22,23.

Múltiplos modelos mamíferos de coioamnionite existem em roedores e ovelhas^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. No entanto, existem poucos dados relativos ao desenvolvimento do trato intestinal além do período inicial do recém-nascido após a exposição fetal induzida pela coioamnionite à inflamação materna (FEMI). A fim de explorar a relação entre FEMI e o desenvolvimento subsequente da lesão do trato intestinal imaturo, adaptamos o modelo FEMI induzido por lipopolissacarídeo (LPS). Lipopolisacarídeos são um componente importante da superfície extracelular em bactérias gram negativas e são um potente estimulante do sistema imunológico inato de múltiplas espécies eucarióticas, incluindo humanos³³. A injeção de LPS materno resulta em uma cascata inflamatória estéril sem os efeitos confusos das bactérias vivas, sendo um modelo bem estabelecido para a indução do nascimento pré-parto³⁴, bem como um modelo de corioamnionite aguda e a síndrome de resposta inflamatória fetal (FIRS), que é a forma mais grave de coioamnionite^24,35. Também foi demonstrado induzir tanto a lesão de matéria branca e cinza cerebral em um modelo de ovelha³⁶ como um modelo murino^37,38,39,40. No entanto, pelo que sabemos, somos os primeiros a utilizar esse modelo de coioamnionite e FEMI para investigar seus efeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal após o nascimento, bem como para investigar uma possível ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC^41,42.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (Protocol #8041401). Todos os animais foram alojados em uma Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados De Animais laboratoriais (AALAC) aprovada na Universidade de Iowa. Todos os ratos eram do tipo selvagem C57Bl/6J.

1. Estabelecimento de FEMI em camundongos gestantes

1. Preparação do LPS
   1. Use LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentração de estoque 2 mg/mL).
   2. Concentração de estoque de LPS diluída 1:100 com soro fisiológico estéril para uma concentração de trabalho de 20 μg/mL.
2. Injeção de LPS materno
   1. Injete barragens grávidas no dia da gestação e15. Esse ponto de tempo é de aproximadamente 75% durante a gestação murina, tornando esse modelo de desenvolvimento semelhante ao terceiro trimestre precoce de gestações humanas, que é quando ocorre a maioria dos nascimentos prematuros devido à cooamnionite.
   2. Pese camundongos gestantes imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem LPS apropriada.
   3. Calcule a dose de concentração de trabalho utilizando a seguinte fórmula: 5 μL x grama de peso corporal (gbw), para uma dose total de LPS de 100 μg/kg. Para animais de controle, use um volume equivalente de soro fisiológico normal para injeção.
   4. Solução LPS vortex três vezes por 15 segundos em alta antes de cada injeção.
   5. Desenhe o volume LPS em uma seringa de 1 mL.
   6. Contenha o rato grávida com técnica de escroffing. Segure na posição de recumbência dorsal e realize a injeção.
      1. Insira uma agulha de 30 mm de 8 mm sobreo painel do quadrante inferior direito do abdômen (para evitar bexiga e vasos abdominais) em um ângulo de 30\u201240°. Insira cerca de 1/4 a 1/2 o comprimento da agulha.
      2. Puxe para trás o êmbolo da seringa para garantir a pressão negativa antes da injeção. Proceda com a injeção se houver pressão negativa.
      3. Após a injeção, monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e depois retorne às gaiolas pelo resto da gravidez.

2. Parto e cuidado de descendentes, e colheita intestinal

1. Entregue filhotes normalmente através do parto vaginal no e20.
   NOTA: Este modelo tem uma taxa de perda fetal dependente de dose esperada que pode ser observada na Figura 1 e é discutida nos resultados abaixo.
2. Permita que os filhotes permaneçam com as mães e recebam rações ad libitum.
3. No dia da colheita, tipicamente no dia 14 (P14), os filhotes de eutanásia via deslocamento cervical em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
4. Usando tesouras e fórceps, faça uma incisão vertical pela linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, durante toda a extensão do abdômen. Extirpe o intestino delgado do estômago até o ceco com uma tesoura e remova a mesenteria com fórceps.
5. Isole e mantenha o distal 1/3 do intestino delgado (seção representativa do íleo humano), descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon.
6. Divida a porção de íleo ao meio usando uma tesoura.
7. Coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação posterior do RNA.
8. Coloque a metade distal em formalina tamponada 10% neutra para a preparação do slide.

3. Pontuação de lesão intestinal

1. Seção parafina embutida tecido em fatias de 5 μm de espessura e montar em lâminas de vidro.
   
   NOTA: Enviamos os espécimes para um núcleo de histologia para incorporação, secção e montagem em slides.
2. Desparafinar slides de acordo com os procedimentos padrão.
3. Manchas com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.
4. Escore seções em uma escala de 3 pontos para lesão intestinal como descrito anteriormente^42,43.
   1. Utilizando microscopia leve, avalie a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de 3 pontos avaliando a integridade e separação de Villus da membrana do porão⁴³ (Figura Suplementar 1). A lesão intestinal é melhor avaliada em ampliação de 20x e abertura numérica 0,50.
   2. Atribua uma pontuação de 0 para descrever a mucosa normal.
   3. Atribuir uma pontuação de 1 descrever lesão leve que abrange o desenvolvimento do espaço subepiteliol gruenhagen, vacuolização ou elevação subepithelial limitada à lavímen propria ou pontas de villi.
   4. Atribua um escore de 2 para descrever lesões graves, indicadas por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade da vílli, distorção de villi ou ulceração mucosa e desintegração da órcia de lamina.

4. Quantificação de panése e células de cálice

1. Após a desparafinação, manchas deslizam de seções teciduais da Etapa 2.8 com a mancha de Ácido Azul/Periódico Alcian Schiff para denotar tanto as células de cálice quanto de Paneth como descrito anteriormente^44,45 de acordo com as etapas a seguir.
   NOTA: Embora a mancha de Alcian Blue/Periodic Acid Schiff não seja específica nem para células paneth ou cálices, em nossa experiência, investigadores experientes cegos têm quantificação celular equivalente usando esta mancha em comparação com anticorpos mirados celulares, com significativamente menos coloração de fundo⁴⁶.
2. Desparafinar, manchar e desidratar lâminas da seguinte forma.
   1. Submergir desliza em xileno por 10 minutos duas vezes.
      ATENÇÃO: O xileno deve ser usado em um capô de fumaça.
   2. Enxágüe com 100% etoh.
   3. Submergir slides em 100 % EtOH por 3 min, depois em 90% EtOH por 3 min, seguido por 70% EtOH por 3 min, e por último submergir slides em 50% EtOH por 3 min.
   4. Lave sob água da torneira por 5 minutos.
      ATENÇÃO: Aponte a seção para longe da água corrente para evitar a perda da amostra de tecido.
   5. Filtrar a solução de mancha azul alciana com um filtro de café padrão.
   6. A mancha desliza na mancha azul alciana por 15 minutos e depois lava sob água da torneira por 2 minutos.
   7. Diluir 1 mg de ácido periódico em 200 mL de água dupla destilada. Submergir slides nesta solução por 5 minutos. Em seguida, lave sob água da torneira por 1 min.
   8. Mancha com o reagente de Schiff por 10 minutos. Lave sob água da torneira por 5 minutos.
   9. Manche os slides com hematoxilina por 1 min e depois lave sob água da torneira por 2 minutos.
   10. Submergir-os em álcool ácido (1 mL de ácido clorídrico misturado em 99 mL de 70% EtOH) por 1 min.
   11. Submergir na água da torneira de Scott (0,1% de concentração de NaHCO₃ na água da torneira) por 1 min e depois lavar sob água da torneira por 1 min.
   12. Desidratar os slides.
       1. Mergulhe cada slide 10 vezes em 70% EtOH, depois diminua 10 vezes em 90% EtOH e 10 vezes em 100% EtOH.
       2. Submergir desliza em 100% EtOH por 10 minutos, seguido por submergir duas vezes em xileno fresco por 3 min cada.
   13. Coloque uma gota de mídia de montagem sobre o espécime e coloque uma mancha sobre ele.
3. Contagem de células de cálice
   1. Utilizando microscopia leve, conte células de cálice(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células de cálice e 500 células epiteliais e expresse a razão das células de cálice como uma razão por 100 células epiteliais. As células cálices são melhor contadas em ampliação de 20x e abertura numérica 0,5.
4. Contagem de células de Paneth
   1. Utilizando microscopia leve, conte células paneth(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, expresse como uma razão de células paneth por cripta intestinal. Conte 100 criptas intestinais por cada pedaço de tecido intestinal. As células paneth são melhor contadas em 20x-60x de ampliação e abertura numérica 0,50-1,30.

Resultados

A exposição ao FEMI no dia 15 embrionário leva a uma perda dependente de dose da gravidez e uma taxa dependente de dose de trabalho de parto prematuro(Figura 1)⁴². Para os experimentos, optou-se por usar uma dose de LPS de 100 μg/kg para minimizar a perda e a prematuridade da gravidez (perda de 50% entre prematuridade e morte fetal intrauterina) enquanto expunimos os fetos a um insulto inflamatório significativo.

Usando esta abordagem,...

Discussão

A coioamnionite impacta 2\u20124% do prazo e 25\u201230% das entregas pré-termo^8,9. No entanto, o impacto da coioamnionite pode se estender muito além do nascimento, pois tem se mostrado ter efeitos significativos sobre o feto e o recém-nascido^{10,11,12,13,14,15}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056