Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных

Резюме

Мы разработали модель хориоамнионит для имитации воздействия плода на воспаление матери (ФЕМИ) без осложнений живых организмов для изучения влияния ФЕМИ на развитие желудочно-кишечного тракта потомства. Это позволяет изучать механистические причины развития кишечной травмы после хориоамнионит.

Аннотация

Хориоамнионит является распространенным осадком преждевременных родов и связан со многими из заболеваний недоношенных, в том числе некротизирующий энтероколит (NEC). Однако механистическая связь между этими двумя условиями еще предстоит выяснить. Мы приняли мурин модель хориоамнионит с участием липополисахарид (LPS)-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (FEMI). Эта модель FEMI вызывает стерильный материнский, плацентарный и плода воспалительный каскад, который также присутствует во многих случаях клинического хориоамнионит. Хотя существуют модели, которые используют живые бактерии и более точно имитируют патофизиологию восходящей инфекции, приводящей к хориоамниониту, эти методы могут вызвать косвенное воздействие на развитие незрелого желудочно-кишечного тракта и связанного с ним развивающегося микробиома. Используя этот протокол, мы продемонстрировали, что ИНДУЦ, вызванный LPS FEMI, приводит к дозозависимым увеличению потери беременности и преждевременных родов, а также нарушению нормального развития кишечника у потомства. Кроме того, мы показали, что FEMI значительно увеличивает кишечные травмы и цитокины сыворотки у потомства, одновременно уменьшая кубок и клетки Панета, которые обеспечивают первую линию врожденного иммунитета против воспаления кишечника. Хотя аналогичная модель LPS-индуцированной FEMI была использована для моделирования связи между хориоамнионитом и последующими аномалиями центральной нервной системы, насколько нам известно, этот протокол является первой попыткой прояснить механистическую связь между хориоамнионитом и более поздними возмущениями в развитии кишечника в качестве потенциальной связи между хориоамнионитом и NEC.

Введение

Хорионные мембраны играют неотъемлемую роль в беременности млекопитающих. Они включают в себя хорион и амнион, которые служат нескольким функциям. Они окружают и защищают плод, облегчают сигнализацию паракрина между материнским и фетальным^{отсеками 1}и создают локальные петли обратной связи в хорионных мембранах, которые могут быть вовлечены в инициирование партуриции^1. Текущее понимание мембран указывает на то, что амнион обеспечивает структурную барьерную функцию, а хорион обеспечивает иммунологический буфер в первую очередь для защиты развивающегося плода от материнской иммунной^{системы 2.} Воспаление этих мембран известно как хориоамнионит. Исторически, диагноз клинического хориоамнионит был сделан после наличия материнской лихорадки плюс один или несколько фетальных или материнских^{клинических выводов 3,4}. Однако, хотя это определение является клинически полезным, его отсутствие точности сделало исследования хориоамнионит сложной задачей. В 2015 году, в попытке прояснить диагноз, семинар экспертной группы Поник Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека определены chorioamnionitis как внутриматочное воспаление, или инфекции, или как (тройной I)³. Это разъяснение важно, потому что в то время как микробные индуцированной инфекции является важной причиной воспаления матки / амниотических, это происходит реже, чем стерильные матки / амниотические^{воспаления 5,6,7}. В целом, хориоамнионит остается значительной проблемой общественного здравоохранения, как это видно в 2'u20124% от сроков родов и 25'u201230% преждевременных^{родов 8,9}.

Хориоамнионит может иметь значительное влияние на плод и новорожденных. Это было хорошо задокументировано в литературе, что хориоамнионит связан с повышенным риском многих заболеваний недоношенности, в том числе бронхолегочных^{дисплазии 10}, повреждение головного^{мозга белого вещества 11}, внутрижелудочковое^{кровоизлияние 12}, ретинопатия^{недоношенности 13}, и как подозреваемых и подтвержденных раннего начала неонатального^{сепсиса 14,15}. Поскольку мы заинтересованы в травмах и механизмах восстановления незрелого желудочно-кишечного тракта, важно отметить, что хориоамнионит также связан с более поздним развитием некротизирующего энтероколита (NEC)^15,16. NEC является разрушительным желудочно-кишечным заболеванием недоношенных детей, что приводит к дисрегулируемой реакции хозяина на воспаление и последующий кишечный^{некроз 17}. Каждый год, NEC затрагивает более 4000 младенцев в Соединенных Штатах, и до одной трети этих младенцев умирают от болезни¹⁸. Патогенез NEC, вероятно, включает в себя сочетание кишечной незрелости, дисрегуляции незрелой иммунной системы, воспаление кишечника, и бактериальная^{транслокация 19}, кульминацией в окончательный общий путь кишечного некроза. Важно отметить, что начало NEC часто происходит через несколько недель после рождения и потенциального воздействия хориоамнионит, что делает механистическую связь между хориоамнионит и последующее развитие NEC неясно²⁰. Один потенциальный механизм, с помощью которого хориоамнионит может способствовать патофизиологии NEC через upregulation материнской иммунной системы, впоследствии производя сильный воспалительный ответ плода, которые могут нарушить нормальные модели развития плода^21,22,23.

Несколько млекопитающих модели хориоамнионит существуют у^{грызунов и овец 24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Тем не менее, существует мало данных, касающихся развития желудочно-кишечного тракта после первоначального периода новорожденных после хориоамнионит-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (ФЕМИ). Для того, чтобы изучить взаимосвязь между FEMI и последующего развития травмы незрелого желудочно-кишечного тракта, мы адаптировали липополисахарид (LPS) индуцированной модели FEMI. Липополисахариды являются основным компонентом внеклеточной поверхности на грамотрицательных бактерий и являются мощным стимулятором врожденной иммунной системы нескольких эукариотических видов, в том числе^{людей 33}. Материнская инъекция LPS приводит к стерильному воспалительному каскаду без путевого воздействия живых бактерий, и это устоявшаяся модель индукции преждевременных^{родов 34}, а также модель острого хориоамнионита и фетального синдрома воспалительной реакции (FIRS), который является наиболее тяжелой формой хориоамнионит^24,35. Было также показано, чтобы вызвать как церебральный белый и серый травмы^{вещества в овец модель 36} и мурин модели^37,38,39,40. Однако, насколько нам известно, мы первыми используем эту модель хориоамнионит и ФЕМИ для исследования его влияния на развитие желудочно-кишечного тракта при рождении, а также для изучения возможной механистической связи между хориоамнионитом и более поздним развитием NEC^41,42.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Айовы (Протокол #8041401). Все животные были размещены в Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AALAC), утвержденной виварием в Университете Айовы. Все мыши были дикого типа штамма C57Bl/6J.

1. Создание FEMI у беременных мышей

1. Подготовка LPS
   1. Используйте LPS, полученные из Escherichia coli O55:B5 (концентрация запасов 2 мг/мл).
   2. Разбавить концентрацию запасов LPS 1:100 стерильным солевым раствором для рабочей концентрации 20 мкг/мл.
2. Материнская инъекция LPS
   1. Инъекции беременных плотин в день беременности e15. Эта точка времени составляет примерно 75% через беременность мурина, что делает эту модель в развитии похож на начале третьего триместра беременности человека, который, когда большинство преждевременных родов из-за хориоамнионит происходят.
   2. Взвешивание беременных мышей непосредственно перед инъекцией, чтобы определить соответствующие LPS досирования.
   3. Рассчитайте дозу рабочей концентрации с помощью следующей формулы: 5 мкл х грамм массы тела (gbw), для общей дозы LPS 100 мкг/кг. Для контроля животных используйте эквивалентный объем нормального солевого раствора для инъекций.
   4. Vortex LPS решение три раза в течение 15 секунд на высоком до каждой инъекции.
   5. Нарисуйте объем LPS в шприц объемом 1 мл.
   6. Сдерживайте беременную мышь с помощью техники scruffing. Держите в спинной позиции лежа и выполнить инъекцию.
      1. Вставьте 30 калибровочных 8 мм иглы скошенной вверх по правому нижнему квадранту живота (чтобы избежать мочевого пузыря и брюшных сосудов) под углом 30 'u201240 ". Вставьте около 1/4 до 1/2 длины иглы.
      2. Потяните обратно на поршень шприца, чтобы обеспечить отрицательное давление до введения. Продолжить с инъекцией, если отрицательное давление присутствует.
      3. После инъекции, контролировать мышей в течение примерно 30 минут, а затем вернуться в клетки на оставшуюся часть беременности.

2. Доставка и уход за потомством, а также сбор урожая кишечника

1. Доставка щенков, как правило, через вагинальные роды на e20.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель имеет ожидаемый доза зависит плода потери, которые можно увидеть на рисунке 1 и обсуждается в результатах ниже.
2. Разрешить щенков оставаться с матерями и получать ad libitum каналы.
3. В день сбора урожая, обычно послеродовой день 14 (P14), усыпляют щенков через вывих шейки матки в соответствии с протоколами Комитета по уходу за животными и использованию.
4. Используя ножницы и типсы, сделайте вертикальный разрез по средней линии живота, через кожу и брюшной полости, по всей длине живота. Акциз тонкой кишки из желудка в cecum с ножницами и удалить мезентерии с миппами.
5. Изолировать и сохранить дистальный 1/3 тонкой кишки (раздел представитель человеческой илеи), отбрасывая проксимальной тонкой кишки, cecum, и толстой кишки.
6. Разделите часть илеума пополам с помощью ножниц.
7. Поместите проксимальную половину в раствор стабилизации РНК для более поздней количественной оценки РНК.
8. Поместите дисттальную половину в 10% нейтральный буферный формалин для подготовки слайда.

3. Кишечные травмы забил

1. Раздел парафин встроенных тканей в 5 мкм толщиной ломтиками и монтировать на стеклянных слайдах.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы отправляем образцы в гистологическое ядро для встраивания парафина, секции и монтажа на слайдах.
2. Депараффинизируйте слайды в соответствии со стандартными процедурами.
3. Пятна разделов с гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными процедурами.
4. Оценка разделов по 3-очковой шкале для кишечной травмы, как описано^{ранее 42,43}.
   1. Используя световую микроскопию, оцените обобщенные повреждения кишечника двумя отдельными ослепленными следователями по 3-той шкале, оценивая целостность виллусов и отделение^{от мембраны подвала 43} (Дополнительная цифра 1). Травмы кишечника лучше всего оценивать при 20-м увеличении и численной диафрагме 0,50.
   2. Назначьте оценку 0 для описания нормальной слизистой оболочки.
   3. Назначить оценку 1 описать легкую травму, которая включает в себя развитие пространства подпопителе гюнхагена, вакуолизации или подполепиальной подъема ограничивается ламина проприя или кончики вилли.
   4. Назначить оценку 2 для описания тяжелой травмы, указанной эпителиальной подъема и вакуолизации более половины вилли, villi искажения, или слизистой язвы и распада ламина проприии.

4. Количественная оценка клеток Панета и кубков

1. После депараффинизации, пятно слайды тканей разделов от шага 2.8 с Alcian Blue / Периодические кислоты Шифф пятно для обозначения как кубок и Панет клеток, как описано^{ранее 44,45 в соответствии} со следующими шагами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя Alcian Blue / Периодические кислоты Шифф пятно не является специфическим для Панет или кубок клетки, по нашему опыту, ослепленные опытные исследователи имеют эквивалент клеточной количественной оценки с использованием этого пятна по сравнению с клеточной целевых антител, со значительно меньшим фоном^{окрашивания 46}.
2. Депараффинизировать, пятно, и обезвоживать слайды следующим образом.
   1. Погрузим горки в ксилен в течение 10 минут дважды.
      ВНИМАНИЕ: Ксилен следует использовать в дымовой капот.
   2. Промыть 100% EtOH.
   3. Погрузить слайды в 100% EtOH в течение 3 минут, затем в 90% EtOH в течение 3 минут, а затем 70% EtOH в течение 3 минут, и, наконец, погрузить слайды в 50% EtOH в течение 3 минут.
   4. Вымойте под проточной водопроводной водой в течение 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Навечьте секцию подальше от проточной воды, чтобы предотвратить потерю образца ткани.
   5. Фильтр Alcian синий пятно решение со стандартным фильтром кофе.
   6. Пятно слайды в Alcian синее пятно в течение 15 минут, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 2 мин.
   7. Разбавить 1 мг периодической кислоты в 200 мл двойной дистиллированной воды. Погрузим слайды в этот раствор на 5 мин. Затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 1 мин.
   8. Пятно с реагентом Шиффа в течение 10 минут. Вымойте под проточной водопроводной водой в течение 5 минут.
   9. Пятно слайды с гематоксилин в течение 1 мин, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 2 мин.
   10. Погрузить их в кислотный спирт (1 мл соляной кислоты, смешанной в 99 мл 70% EtOH) в течение 1 мин.
   11. Погрузитесь в водопроводную воду Скотта (0,1% концентрации NaHCO_{3 в} водопроводной воде) в течение 1 мин, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 1 мин.
   12. Обезвоживать слайды.
       1. Опустите каждый слайд 10 раз в 70% EtOH, затем окунитесь 10 раз в 90% EtOH, и 10 раз в 100% EtOH.
       2. Погрузим горки в 100% EtOH в течение 10 минут, а затем дважды погружаясь в свежий ксилен в течение 3 минут каждый.
   13. Поместите каплю монтажных средств массовой информации на образец и поместите на него крышку.
3. Подсчет клеток Кубок
   1. Используя световую микроскопию, подсчитайте клетки кубков(дополнительный рисунок 2). Для каждой части кишечной ткани, подсчитайте количество клеток кубок и 500 эпителиальных клеток и выразить соотношение клеток кубок как соотношение на 100 эпителиальных клеток. Клетки кубков лучше всего рассчитывать на 20x увеличение и численное отверстие 0,5.
4. Подсчет клеток Панет
   1. Используя световую микроскопию, подсчитайте клеткиПанета (дополнительный рисунок 2). Для каждого куска кишечной ткани, выразить как соотношение клеток Панет на кишечный склеп. Подсчитайте 100 кишечных склепов на каждый кусок кишечной ткани. Клетки Панета лучше всего учитывать при увеличении в 20х-60x и численной диафрагме 0,50-1,30.

Результаты

Воздействие FEMI на эмбриональный день 15 приводит к дозозависимых потери беременности и доза зависит от скорости преждевременных родов (Рисунок 1)⁴². Для экспериментов, мы решили использовать дозу LPS 100 мкг/кг, чтобы свести к минимуму потерю беременности и недо?...

Обсуждение

Хориоамнионит влияет на 2'u20124% срока и 25'u201230% преждевременных^{родов 8,9}. Тем не менее, влияние хориоамнионит может продлить давно^{рождения,}как было показано, оказывают значительное влияние на плод^{и новорожденных 10,11,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056