糖精中遗传链接调控时间寿命的抑制 器屏幕

摘要

这里是一个协议，通过增加的拷贝数抑制器屏幕在 糖精中识别遗传相互作用。这种方法允许研究人员识别、克隆和测试短寿命酵母突变体中的抑制器。我们测试S SIR2拷贝数 增加对自 噬空突变体寿命的影响。

摘要

衰老是生物体正常生物过程的由时间依赖性恶化，增加了死亡的概率。许多遗传因素导致正常老化过程的改变。这些因素以复杂的方式相交，许多生物体中发现并保存的大量有据可查的联系就证明了这一点。这些研究大多数集中在功能丧失，空突变体，允许快速筛选许多基因同时。有少得多的工作，专注于描述在这个过程中，基因过度表达的作用。在目前的工作中，我们提出了一种直接的方法，用于识别和克隆萌 芽酵母中的基因，用于抑制许多遗传背景中见的短期寿命表型的研究。该协议旨在为来自各种背景和不同学术阶段的研究人员提供访问。 SIR2 基因编码为组蛋白去乙酰酶，在pRS315载体中被选为克隆基因，因为关于它对时间寿命的影响有相互矛盾的报道。 SIR2 在自噬中也起着一定的作用，当通过删除多个基因（包括转录因子 ATG1）来破坏时，这种作用会中断。作为原理证明，我们克隆 SROR2基因， 对自噬缺陷 atg1+ 突变体的缩短寿命表型特征进行抑制器筛查，并将其与异源野生型遗传背景进行比较。

引言

衰老是无数生物过程中依赖时间的完整性丧失，最终增加了机体死亡的概率。衰老对于所有物种来说几乎是不可避免的。在细胞水平上，有几个与衰老相关的特征特征，包括:基因组不稳定、表观遗传改变、蛋白质组功能丧失、线粒体功能障碍、去调节的营养感应、细胞衰老和端粒减员1^,，2。1在单细胞生物，如酵母，这导致复制潜力和时间寿命的寿命^{,3，4的减少}。这些细胞变化表现在更复杂的生物体，如人类，包括癌症，心力衰竭，神经退化，糖尿病和骨质疏松症^{5，6，76,的病理学}。⁵尽管衰老过程有许多复杂性，但在这一过程的不同生物体^8、9、10之间^，9,这些分子特征是^保存的。识别这些通路在老化期间的变化导致意识到，他们可以通过生活方式的改变操纵 - 饮食限制显示，大大延长了许多生物体^11的寿命。这些路径以复杂的方式相互融合和相交，并相互相交。这些相互作用的阐明和表征为延长寿命和健康跨度^{12、13、14,13的治疗干预提供了潜力}。

通过使用更简单的模型生物体（包括萌芽酵母、糖精^{糖15、16）,}等，保护衰老的分子基础，可以对过程背后的遗传相互作用进行^功能解剖。有两种既定的老化类型，以萌芽酵母为模型:按时间顺序测量（按时间顺序排列的寿命，CLS）和复制老化（复制寿命^{，RLS）17。}按时间顺序排列的老化度量是细胞在非分裂状态下生存的时间量。这类似于在G₀中度过大部分生命的细胞中的衰老，如神经元^4。或者，复制寿命是单元格在耗尽前可以划分的次数，并且是线状活性细胞类型（例如，单元格可以具有的子细胞数）^{的模型 18}。

这种方法的总体目标是提出一个协议，允许使用 S.cerevisiae对衰老的遗传学进行功能解剖。虽然许多研究人员进行了许多优秀的研究，这些研究导致了我们目前的理解，但初露头角的研究人员在学术生涯的早期就为老龄化领域做出了贡献。我们提出了一个明确的方法，使研究人员能够进一步推进老龄化领域。该协议旨在通过提供制定和测试自己新颖假设的必要工具，为所有研究人员提供访问，无论其学术生涯的阶段如何。我们的方法的优点是，这是一种具有成本效益的方法，无论机构如何，所有研究人员都很容易获得这种方法，而且不需要某些协议¹⁹所需的昂贵、专门的设备。有几种不同的方法来设计这种类型的屏幕，在这项工作中概述的方法是特别适合筛选非基本基因的空突变体，显示时间寿命严重缩短相比，同源野生型酵母菌株。

作为我们的原则证明，我们克隆了SR2，一种被报告为在过度表达时同时表现出扩展和缩短的CLS的奈氨酸二乙酰酶。SIR2过度表达最近被发现增加了酿酒酵母中的CLS;然而，几个团体报告说，SIR2和CLS扩展之间没有联系，其作用在^{20，21，22,21,的特征下}。由于文献中的这些相互矛盾的报告，我们选择这个基因来添加独立的研究，以帮助澄清SR2在时间老化中的作用，如果有任何。此外，增加SER2同源的拷贝数延长了线虫模型系统^23的寿命。

自噬是一种细胞内降解系统，向叶酸体²⁴提供细胞细胞因子，如蛋白质和细胞器。自噬通过它的作用，在降解受损的蛋白质和细胞器，以保持细胞平衡^25，与长寿紧密相连。自噬的诱导取决于协调许多基因的表达，而 ATG1基因的删除导致萌芽酵母²⁶中的异常短的CLS。ATG1代码为蛋白质丝氨酸/链氨酸激酶，在自噬和细胞质到囊肿（真菌体体等效物）路径^{27，28中，}囊泡形成^是必需的。在这里，我们提出增加复制数字屏幕的方法，测试增加的 SIR2拷贝对野生类型和atg1-null 背景的 CLS效果。这种方法特别适用于主要为本科院校的初级研究人员和研究小组，其中许多为在科学领域代表性不足、资源有限的社区服务。

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研究方案

1. 确定用于筛查的潜在遗传相互作用

1. 确定表征的遗传背景，利用糖精基因组Saccharomyces数据库（SGD，https://www.yeastgenome.org^{29，30），,}为这个Saccharomyces cerevisiae生物体汇编已知的表型信息，在糖精中产生异常短的时间寿命（CLS）。³⁰
   1. 从 网页 顶部的选项中选择"功能"选项卡。
   2. 选择 表型， 然后选择 浏览所有表型。
   3. 从 酵母表型本体 选项滚动 到开发 副标题并选择 时间线寿命，在"寿命 "副 标题下找到。
   4. 选择"减少 "的限定符，这允许识别显示表型的基因，该表型在删除时会导致时间寿命表型减少。对于此方法证明 atg1+ 被选中，这导致一个短暂的 CLS 表型，并中断自噬²⁶。
2. 确定目标基因，以筛选可能抑制表型的基因相互作用，基于报告或预测的本体属性，在第1.2部分识别的突变体。重复上述步骤1.1.1-1.1.4中的表型搜索，查询在野生类型背景中过度表达时导致较长CLS的基因。SIR2是根据报告的CLS表型和报告与自噬^{31，32,的相互作用选择的}。

2. 准备试剂

注:除非另有说明，否则在121°C下将每个溶液灭菌20分钟，在使用前进行消毒。

1. YPAD液体介质:每升双蒸馏水加入1%酵母提取物、2%Pepton、2%德克斯特罗斯（葡萄糖）和40毫克腺氨酸（作为硫酸腺氨酸脱水）。与磁力搅拌器混合良好。
2. LB液体介质:每升双蒸馏水加入 Trypton （10 g）、酵母提取物 （5 g） 和氯化钠 （10 g）。与磁力搅拌器混合良好。
3. 在双蒸馏水中准备1000x（100毫克/千升）安西林库存。混合好，过滤消毒。
4. 合成完整 – Leucine （SC-LEU） 液体介质:加入 1.7 g 酵母氮基，不含氨基酸，2% 葡萄糖，1.92 g SC-LEU 滴口混合物，每升双蒸馏水 5 克硫酸铵。与磁力搅拌器混合良好。
5. TE 缓冲液:将 Tris（10 mM 最终浓度）、EDTA（1 mM 最终浓度）与双蒸馏水混合在溶液中。与磁力搅拌器混合良好。
6. 用双蒸馏水在溶液中准备 50% PEG 3350 溶液。与磁力搅拌器混合良好。
7. 使用双蒸馏水准备 1 M 和 100 mM 醋酸锂溶液。与磁力搅拌器混合良好。
   注:要使固体加糖板在高压灭之前在2.1和2.2以上准备的介质中加入20克的加糖（每升加水加20克，加20克加糖）。如果制备安西林板在冷却至约60°C后，在2.2以上介质中加入1mL的安西林。倒入无菌板，使用前可设定为48~72小时。将板存放在 4 °C，以延长存储时间。

3. 设计克隆策略，将 SIR2 克隆 到 pRS315 向量中

1. 设计PCR底基因，将 SR2 基因放大到pRS315载体中。
   1. 手动设计底源器，使SR2的上下游的致癌区域具有21~22个核苷酸互补性。确保通过从可用数据集^33、34映射这些特征来克隆整个基因以及 mRNA^{的未翻译区域}。
   2. 确保 PCR 底转设计产生熔化温度 （Tm） 高于 53 °C 且低于 60°C 的前进和反向底转。
      注:理想情况下，两个引水应具有与序列允许的彼此接近的 Tm，其近似 GC 含量介于 40~50%之间，确保避免二核苷酸重复并平衡 GC 和 AT 在整个序列中的分布。
   3. 在设计出能生成用于克隆的安培的PCR底像后，将限制性酶消化（R.E.D.）靶点添加到与质粒克隆载体兼容的每个底基因的5'端。在此方法中，将 HindIII 限制性酶消化位点（5'-AAGCTT-3'）添加到上游，向前底转和 SacII 限制性酶消化位点（5'-CCGCGG-3'）添加到下游反向底源。
      注:使用SacII和HinsIII位点要求目标基因中不存在每个内核糖核酸的一致切割位点。如果目标基因中的任一酶靶点，应选择替代限制酶。有许多与 pRS315 矢量上的多链接区域兼容。
   4. 最后，将四核苷酸（5'-NNN-3'）序列悬垂到每个底剂的5'端，让约束酶结合并消化扩增。一旦底片被设计完成，就将寡核苷酸用于克隆 SR2基因进行商业合成 。
   5. PCR 底转器的重新安装:使用桌面微模糊器以最大速度将 PCR 底转离离，持续 4 分钟。加入TE溶液，使库存浓度为100μM。将库存浓度储存在-20°C，稀释1/10，用于PCR应用。
      注:要制作 100 μM 库存，请使用 TE 微升将底流液溶解在无菌 TE 缓冲液体积中，该缓冲液量是底材管中 nmoles 量的 10 倍。例如，如果管内含有 15.6 nmoles 的底材，则添加 156 μL 的 TE 缓冲液。
2. 分离野生型酵母gDNA，用于 SR2克隆结构的PCR 扩增。
   注:几种高品质的选择是商业上可用于隔离酵母gDNA。利用一个套件，包括消化真菌细胞壁与酶，导致更好的质量gDNA（更高的产量，更少的杂质）。以下协议始终返回高浓度和纯度。我们推荐的套件的详细信息见材料表。
   1. 在富集介质（如YPAD）中，种植野生型酵母5mL培养48-72小时至后日志阶段。在室温下以 >800 x g 将酵 母细胞在 >800 x g 下取出 3 分钟，去除生长介质，并在 120 μL 的酶消化缓冲液中重新释放，并辅以 5 μL 的酶酶（2 单位酶/μL）。在37°C下通过涡流混合样品，孵育40分钟。
   2. 加入120μL的超热带解液缓冲液（例如氯化钙），250μL的氯仿，并涡流样品60 s。
   3. 在 >8，000 x g 下离心 2 分钟，将上看液转移到无菌收集管中的纯化柱中。
   4. 以 >8，000 x g 的 60 s 离心，然后丢弃流经。gDNA 将绑定到列矩阵。
   5. 用 300 μL 的乙醇洗涤缓冲液洗两次柱，从上面重复离心步骤 （3.2.4）。每次旋转后丢弃流。将柱转移到1.5 mL微混管中，加入60μL的TE缓冲液，并在室温下孵育60秒。闪光旋转样品30 s，以脱氧核糖核酸。
      注:确定样品中DNA的浓度（260nm的吸收度）和质量（吸收度260nm/280nm）。典型产量为 100~200 ng/μL 的 gDNA，吸收比为 260nm/280nm，尽可能接近 1.8。
3. 放大和分离pRS315质粒载体进行克隆。
   注:几种高质量选项可用于质粒载体的纯化。此步骤建议使用硅基柱化学。下面指出的变化导致了最高的浓度和纯度。详情见材料 表。
   1. 在 LB+ 安皮林 （80 μg/mL） 介质中一夜之间种植含有 pRS315 载体的大肠杆菌培养 5 mL。在RT（15~25°C）下，以+gt;8，000 x g 的离心法将培养成2分钟。
   2. 使用 RNase A （100 μg/mL） 将 250 μL 的 TE 缓冲液中颗粒细菌细胞重新悬浮，并转移到微离心管。确保没有细胞团块保留。
   3. 加入250μL的解液缓冲液，通过反转管6~8次混合。在室温下孵育5分钟。不要让解解继续超过5分钟 - 少一点是可取的。
   4. 加入350μL的中和缓冲液，通过反转管10次，立即彻底混合。在 +gt;8，000 x g的离心机 10 分钟。
   5. 小心地通过移液将上一液从上面转移到硅旋柱。离心 30 s 并丢弃流经。
   6. 加入 500 μL 的高盐洗液缓冲液和离心机，如步骤 3.3.5。丢弃流式。通过加入750μL乙醇洗涤缓冲液来清洗DNA结合旋转柱，以去除残留的盐，并像步骤3.3.5一样离心。
   7. 在 >8，000 x g 下丢弃流经和离心机 2 分钟，以清除残留的洗涤缓冲液。将旋转柱放在一个清洁的、标有 1.5 mL 的微离心管中。要提取DNA，请将20μL的TE缓冲液加入旋转柱的中心，在室温下孵育1分钟，在>8，000 x g下离心1分钟。
   8. 使用分光光度计确定DNA的数量（260nm的吸收度）和质量（吸收260nm/280nm）。典型产量为 1~2 μg/μL。
4. 候选基因SR扩增 ，SIR2， 来自野生型基因组DNA
   1. 要产生适合克隆的安培，请利用高保真 （HF） PCR 聚合酶避免无意间生成突变到被放大的序列中。
      注:许多不同的高保真PCR选项都可用于商业。为了便于优化PCR反应条件，请使用双缓冲组合:一种是标准高频缓冲器，一种针对高GC和复杂安普利安子进行优化。详情见材料 表。
   2. PCR 放大 了用于克隆的 SIR2 构造，如表 1 中所述。
      注:为了在克隆步骤中实现最大成功，可以通过 PCR 列清理步骤设置和集中多个相同的 50 μL。一定要设置一个无gDNA模板控制反应（阴性控制）。
   3. 设置 PCR 循环条件，如表 2 中所述。
      注:不同的底转对因退火温度而异，不同的聚合酶在不同速度下发挥作用。确保根据所选酶和所设计的底像组合的规格优化放大条件。
   4. 通过可视化 PCR 反应来验证 PCR 反应是否成功，该反应将在 1.0% TAE-agarose 凝胶（用 0.5 μg/mL 溴化乙基进行可视化）上产生大约 2.5 kb 的 DNA 片段。
5. 候选基因S SIR2的消化和连接进入pRS315质粒载体。
   1. 对载体和插入物进行限制性消化:625 ng DNA（载体或插入），q.s.水，使最终反应体积达到50μL，5μL缓冲液，1μL SacII和1μL HindIII。在37°C下孵育限制消化3小时，然后孵育80°C20分钟，加热灭活酶。文摘可以储存在4°C，然后再进入下一步。
   2. 建立15μL结扎反应，产生所需的质粒:6μL无菌水，2μL消化载体（50ng DNA），4μL消化插入（100ng DNA），2μL T4反应缓冲液，和1μL的T4 DNA利加塞。在16°C下孵育结扎反应过夜，然后以80°C孵育20分钟，加热灭活酶。
      注:设置无插入控制，替代插入的另外 4 μL 无菌水（共 10 μL）。
   3. 将结扎 反应转化为大肠杆菌。
      注: 有许多选项可用于主管单元格。该协议使用化学能力细胞，在使用前储存在-80°C。
      1. 将50μL的冷冻、称职的 大肠杆菌 细胞在冰上解冻，直到解冻，并立即加入15μL的结扎反应。轻拂管子几次。立即将管子返回冰中并孵育30分钟。
      2. 在42°C的水浴中加热细胞20秒，并立即将管子回冰中孵育2分钟。将 450 μL 的室温恢复介质（例如 SOC 或 LB）添加到每个转化反应中，并在 37°C 下孵育 60 分钟，并摇动。
      3. 对于每个转化反应，对细胞进行1:10的稀释。使用无菌技术，板 150 μL 的未稀释细胞和 1:10 稀释到 LB = （80 μg/mL） 安西林板³⁵。在37°C下孵育板过夜。
6. 筛选过度表达矢量的预期变换剂。
   1. 使用无菌技术，接种生长成5 mL LB + （80 μg/mL） 安西林并一夜之间生长的潜在转化剂。按照上文第3.3.1~3.3.7节所述的程序，将质粒与每一个潜在的转化剂和屏幕分离，通过限制消化成功整合刀片，然后在1.0%的TAE-agarose凝胶上进行凝胶电泳（用于可视化的0.5 μg/mL乙酰溴化物）。

4. 将载体转化为 atg1+ 和野生型酵母菌株

注:这是使用修改的醋酸锂转化协议^36执行。

1. 野生型和 atg1-null酵母细胞的颗粒 15 mL 在 YPAD 介质中一夜之间生长到早期至中原相（O.D. 600nm = 0.4-0.9），在室温下生长 3 分钟，在 > 800 x g 下。
2. 去功能更上一提，在1 mL无菌ddH₂O中重新悬浮细胞颗粒，将内分物转移到1.7 mL微混管中。在室温下，在 +gt; 800 x g 下 将细胞取出 3 分钟。
3. 通过温和的移液，取出上清液，在 250 μL 的 100 mM 醋酸锂中重新悬浮电池。将细胞拆分成单独的微模糊管，用于执行每个转换。每个转化使用50μL的电池-醋酸锂混合物。
4. 设置转换组合。在每个转化添加:240μL的50%PEG3350，36μL的1.0M醋酸锂，和5μL的三文鱼精子（或其他载体）DNA，煮5分钟，在冰上。
   注:PEG非常粘稠。移液和仔细测量。在继续移动之前，通过添加每个组件后通过移液混合。
5. 为每次变换添加 5 μL 的适当质粒。漩涡每个管充分混合。在30°C下孵育样品45分钟。42°C 的热冲击样品 10 分钟。
6. 在室温下在 > 800 x g 下进行 3 分钟的颗粒细胞，小心去除转化混合物，通过重复上述旋转、小心去除水，在 200 μL 无菌 ddH₂O 中重新悬浮样品。₂
7. 为每种转化酵母菌株设置 1/10 和 1/100 稀释。
8. 使用无菌技术板 150 μL 从每个样品到 SC-leucine 板选择质粒。均匀地均匀地分布细胞，让板干燥，然后以30°C的温度下倒置和孵育，生长48~72小时。
   注:一旦产生适当的菌株，它可以长期储存在25%甘油在-80°C。 现有拷贝数的量化可以通过多种方法确定，包括 qPCR、RNA-FISH 或其他适当的措施^37、38,38。

5. 确定按时间顺序显示的寿命，以测试缩短的 CLS 表型抑制

1. 通过确定保持时间³⁹函数的菌落形成单位 （CFU） 数量，测试在短寿命酵母中对CLS（atg1+突变体）过度表达的效果。
   注意:有必要使用适当的控件设置实验的这一部分。典型的实验将比较野生型（WT）菌株酵母与空向量，WT与抑制器向量，删除突变与空向量，删除突变与抑制器向量。
   1. 采取单个菌株群体来研究并接种到SC-LEU介质中。在30°C下生长72小时，摇动。
   2. 使用血细胞计，确定培养物⁴⁰中的细胞浓度。
   3. 稀释培养的等分，使结果在150μL的无菌水中产生一致的细胞数量。使用无菌技术将培养培养板镀到SC-LEU板上，并在30°C下生长72小时。这些板块是第三天的时间点，实验将正常化到这个时间点为100%的可行性^39。
      注:单元格数应为 200–500，足够大，可用于分析，并可管理的数字进行计数。在这项研究中，我们使用200个细胞进行电镀。
   4. 继续在30°C孵育酵母培养物，采取定期等分和电镀，如5.1.3所述。继续此过程，直到菌株不再可行，然后编译和分析结果。
      注:本研究中使用的菌株的完整列表见表3。

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结果

由于有关SR2在衰老过程中作用的报告相互矛盾，我们选择此基因作为atg1+突变体缩短CLS表型^{26的潜在抑制剂进行研究}。SIR2的作用是有点争议，与相互矛盾的报告，它的作用，扩大CLS，但它已经清楚地链接到增加CLS在至少一个酵母背景，在自噬和食细胞22，31，32，41^22,31,32,

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讨论

揭开衰老的遗传学是一个困难的挑战，有许多进一步研究的机会，有可能产生对存在的复杂相互作用的重要见解。有许多方法，允许迅速生成功能丧失突变体的研究酵母^{45，46的空菌株}。这种方法提供了一种直接的方法，用于识别和克隆基因到pRS315载体上，用于过度表达抑制器的研究。这种方法的一个优点是，这允许从稳定的载体适度过度表达，这可以?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S