JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Özet

Yaşlanma, bir organizmanın normal biyolojik süreçlerinin ölüm olasılığını artıran zamana bağlı bozulmasıdır. Birçok genetik faktör normal yaşlanma sürecinde değişikliklere katkıda bulunur. Bu faktörler karmaşık şekillerde kesişiyor, belgelenmiş bağlantıların zenginliği ile kanıtlanan ve birçok organizmada tanımlanan ve korunan. Bu çalışmaların çoğu aynı anda birçok genin hızlı bir şekilde taranmasıiçin izin fonksiyon kaybı, null mutantlar üzerinde duruluyor. Bu süreçte bir genin aşırı ekspresyonu rolünü karakterize etmek üzerinde odaklanan çok daha az iş vardır. Bu çalışmada, biz tanımlamak ve tomurcuklanan maya genleri klonlamak için basit bir metodoloji salıyoruz, Saccharomyces cerevisiae, birçok genetik arka planda görülen kısa ömürlü kronolojik yaşam süresi fenotip bastırma çalışma için. Bu protokol, çok çeşitli geçmişlere ve çeşitli akademik aşamalardan araştırmacıların erişimine açık olacak şekilde tasarlanmıştır. Kronojen yaşam süresi üzerindeki etkisi hakkında çelişkili raporlar olduğu için, histon deasetilaz kodlayan SIR2 geni pRS315 vektöründe klonlama için seçilmiştir. SIR2 aynı zamanda otofaji de bir rol oynar, hangi sonuçları çeşitli genlerin silinmesi yoluyla bozuldu, transkripsiyon faktörü ATG1dahil. Prensip kanıtı olarak, sir2 genini, otofaji eksikliği olan atg1Δ mutantın kısaltılmış kullanım ömrü fenotip karakteristiği üzerinde bir bastırıcı ekran yapmak için klonluyorum ve bunu başka bir izojenik, vahşi tip genetik arka planla karşılaştırıyoruz.

Giriş

Yaşlanma, sayısız biyolojik süreçlerde zamana bağlı bütünlük kaybıdır ve bu da organizmasal ölüm olasılığını arttırır. Yaşlanma tüm türler için neredeyse kaçınılmazdır. Hücresel düzeyde yaşlanma ile ilişkili birkaç iyi karakterize işaretleri vardır, dahil: genomik instabilite, epigenetik değişiklikler, proteostaz kaybı, mitokondriyal disfonksiyon, deregüle besin algılama, hücresel senescence, ve telomer yıpranma1,2. Mayalar gibi tek hücreli organizmalarda, bu çoğaltıcı potansiyel ve kronolojik yaşam süresi bir azalmaya yol açar3,4. Bu hücresel değişiklikler daha karmaşık organizmalarda tezahür, insanlar gibi, kanserler içeren patolojiler olarak, kalp yetmezliği, nörodejenerasyon, diyabet, ve osteoporoz5,6,7. Yaşlanma sürecini karakterize eden birçok karmaşıklığa rağmen, yaygın olarak farklı organizmalar arasında bu sürecin altında yatan bu moleküler işaretlerin korunması vardır8,9,10. Yaşlanma sırasında bu yollara yapılan değişikliklerin tanımlanması, yaşam tarzı değişiklikleri yoluyla manipüle edilebilenlerin farkına varılmasına yol açmıştır – diyet kısıtlamasının birçok organizmada yaşam süresini önemli ölçüde uzattığı gösterilmiştir11. Bu yollar birbiriyle ve diğer birçok patikayla karmaşık yollarla birleşir ve kesişer. Bu etkileşimlerin açıklanması ve karakterizasyonu yaşam süresini uzatmak için terapötik müdahaleler için potansiyel sunuyor12,13,14.

Yaşlanmamoleküler temellerinin korunması daha basit model organizmaların kullanımı yoluyla sürecin altında yatan genetik etkileşimlerin fonksiyonel diseksiyon sağlar - tomurcuklanan maya dahil, Saccharomyces cerevisiae15,16. Tomurcuklanan maya tarafından modellenen yaşlanma nın iki yerleşik türü vardır: kronolojik yaşlanma (kronolojik yaşam süresi, CLS) ve çoğaltıcı yaşlanma (çoğaltıcı yaşam süresi, RLS)17. Kronolojik yaşlanma, bir hücrenin bölünmeyen bir durumda hayatta kalabilmesi nin miktarını ölçer. Bu g0hayatlarının çoğunluğu harcamak hücrelerde görülen yaşlanma benzer , nöronlar gibi4. Alternatif olarak, çoğaltıcı kullanım ömrü, bir hücrenin tükenmeden önce bölünebildiği ve mitotik olarak etkin hücre türleri için bir model olduğu (örn. bir hücrenin sahip olabileceği küçük hücre sayısı)18'dir.

Bu yöntemin genel amacı S. cerevisiaekullanarak yaşlanma genetiğinin fonksiyonel diseksiyon sağlayan bir protokol sunmaktır. Birçok araştırmacı tarafından yapılan ve şu anki anlayışımıza yol açan pek çok mükemmel çalışma olsa da, tomurcuklanan araştırmacıların akademik kariyerlerinin başlarından itibaren yaşlanma alanına katkıda bulunmaları için pek çok fırsat mevcuttur. Araştırmacıların yaşlanma alanını daha da ilerletmelerine olanak sağlayacak açık bir metodoloji salıyoruz. Bu protokol, akademik kariyerlerinin aşamasından bağımsız olarak, kendi yeni hipotezlerini formüle etmek ve test etmek için gerekli araçları sağlayarak tüm araştırmacılar için erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. Yaklaşımımızın avantajı, bu uygun maliyetli bir yöntem kolayca tüm araştırmacılar için erişilebilir ne olursa olsun kurum - ve bazı protokoller için gerekli pahalı, özel ekipman gerektirmez19. Bu tür bir ekran tasarlamanın birkaç farklı yolu vardır, bu çalışmada özetlenen yaklaşım, özellikle, kronolojik kullanım ömründe, iyotlu yabani tip mayaya kıyasla ciddi bir azalma gösteren gerekli olmayan genlerin null mutantlarının taranması için uygundur.

İlke kanıtı olarak, biz SIR2klon , bir lizin deasetilaz hem genişletilmiş ve kısaltılmış CLS sergileyen olarak bildirilen zaman aşırı ifade. SIR2 aşırı ekspresyonu son zamanlarda şarap mayaları CLS artırmak bulundu; ancak, çeşitli gruplar SIR2 ve CLS uzantısı arasında hiçbir bağlantı bildirdin, karakterize altında rolünü bırakarak20,21,22. Literatürdeki bu çelişkili raporlar nedeniyle, sir2'nin kronolojik yaşlanmadaki rolünü açıklığa kavuşturmak için bağımsız araştırmalar eklemek için bu geni seçtik. Ayrıca, sir2 homolog kopya sayısını artırmak bir nematod solucan modeli sistemi23ömrünü uzatır.

Otofaji, proteinler ve organeller gibi sitozolik ürünleri lizozom24'eulaştırmak için hücre içi bir bozulma sistemidir. Otofaji yakından hücresel homeostaz korumak için hasarlı proteinler ve organeller aşağılayıcı rolü ile uzun ömürlü bağlantılıdır25. Otofaji indüksiyonbirçok genlerin ekspresyonu düzenleyen bağlıdır, ve tomurcuklanan maya bir anormal kısa CLS ATG1 gen sonuçlarının silinmesi26. Otofaji ve sitoplazma-to-vacuol (mantar lısozomal eşdeğeri) yolu27,,28vezikül oluşumu için gerekli olan bir protein serine / treonin kinaz için ATG1 kodları . Burada, artırılmış bir kopya numarası ekranı için metodumuzu sıyoruz, artırılmış SIR2 kopyasının CLS üzerindeki etkisini vahşi bir tipte ve atg1-null arka planda test ediyoruz. Bu yöntem özellikle, birçoğu bilimlerde yeterince temsil edilmeyen ve sınırlı kaynaklara sahip olan, öncelikle lisans kurumlarında bulunan genç araştırmacılar ve araştırma grupları için uygun durmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Tarama için potansiyel genetik etkileşimleri belirlemek

  1. Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD,https://www.yeastgenome.org 29,30),bu organizma için bilinen henotypic bilgileri derleyen kullanarak Saccharomyces cerevisiae bir anormal kısa kronolojik yaşam süresi (CLS) ile sonuçlanır, karakterizasyonu için genetik arka plan (lar) tanımlayın. Saccharomyces
    1. Web sayfasının üst kısmındaki seçeneklerden İşlev sekmesini seçin.
    2. Tüm Fenotipleri seçin ve ardından tüm Fenotiplere Gözat'ıseçin.
    3. Maya Fenotip Ontoloji seçeneklerinden Geliştirme alt başlığına gidin ve Lifespan alt başlığı altında bulunan Kronolojik Yaşam Süresi'niseçin.
    4. Azalmışiçin niteleyici seçin , silindiğinde azalmış kronolojik yaşam süresi fenotip sonuçları bir fenotip sergileyen genlerin belirlenmesiiçin izin verir. Bu proof-of-method atg1Δ için seçildi, hangi kısa ömürlü CLS fenotip sonuçları ve otofaji için bozulur26.
  2. Bölüm 1.2'de tanımlanan mutantın bildirilen veya öngörülen ontoloji özelliklerine göre fenotipi baskıleyebilecek genetik etkileşimleri taramak için hedef gen(ler)i belirleyin. Yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarında bulunan fenotip aramasını tekrarlayın, vahşi bir arka planda aşırı ifade edildiğinde daha uzun bir CLS ile sonuçlanan genleri sorgulayın. SIR2 bildirilen CLS fenotip dayalı seçildi ve otofaji ile bildirilen etkileşimleri31,32.

2. Reaktifler hazırlayın

NOT: Aksi belirtilmedikçe her çözelti 121 °C'de 20 dk olarak kullanılmadan önce sterilize edin.

  1. YPAD sıvı ortam: Çift distile su litre başına% 1 Maya Özü, % 2 Peptone, % 2 Dekstroz (glikoz) ve 40 mg adenin (adenin sülfat dehidrat olarak) ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
  2. LB sıvı ortam: Tryptone (10 g), Maya ekstresi (5 g) ve Sodyum Klorür (10 g) çift distile su litre başına ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
  3. 1000x (100 mg/mL) ampisilin stoku, çift distile suda hazırlayın. İyi bir şekilde karıştırın ve sterilize süzün.
  4. Sentetik komple - Leucine (SC-LEU) sıvı ortam: Maya azot baz w / o amino asitler, 2% Glikoz, SC-LEU Bırakma karışımı 1,92 g, çift distile su litre başına Amonyum sülfat 5 g 1.7 g ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
  5. TE tamponu: Çift distile su ile çözeltide Tris (10 mM son konsantrasyon), EDTA (1 mM son konsantrasyon) karıştırın. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
  6. Çift distile su ile çözelti içinde% 50 PEG 3350 hazırlayın. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
  7. 1 M ve 100 mM Lityum Asetat çözeltisi çift distile su ile hazırlayın. Bir manyetik karıştırıcı ile iyice karıştırın.
    NOT: Katı agar plakaları yapmak için 2.1 ve 2.2 yukarıda otoklavlama önce hazırlanan ortama agar (çift distile su ile litre başına) ekleyin. Ampisilin plakaları hazırlanırken, yaklaşık 60 °C'ye soğuduktan sonra 2,2'de ortama 1mL ampisilin ekleyin. Steril plakalara dökün ve kullanımdan önce 48-72 saat için ayarlamak için izin verin. Plakaları daha uzun depolama için 4 °C'de saklayın.

3. SIR2'yi pRS315 vektörüne klonlamak için klonlama stratejisini tasarla

  1. PRS315 vektörüne klonlamak için SIR2 genini yükseltmek için PCR astarları tasarla.
    1. Sir2'ninyukarı ve aşağı akışlı intergenik bölgelerine 21-22 nükleotit tamamlayıcılığına sahip olacak astarları manuel olarak tasarla. Tüm genin, mRNA'nın çevrilmemiş bölgeleriyle birlikte mevcut veri kümelerinden bu özelliklerin eşlenemesiyle klonlandığından emin olun33,34.
    2. PCR astar tasarımının erime sıcaklığı 53 °C'nin üzerinde ve 60 °C'nin altında olan ileri ve geri astarlar ile sonuçlandığından emin olun.
      NOT: İdeal olarak, her iki astarda da yaklaşık GC içeriği %40-50 arasında olan bir TM'nin, dinükleotid tekrarlarından kaçınılması ve dizi boyunca GC ve AT dağılımının dengelenmesi önlenmelidir.
    3. Klonlama için amplicon üretimi için izin verecek PCR astar tasarımından sonra, plazmid klonlama vektörü ile uyumlu her astar 5 'sonuna restriksiyon enzim sindirim (R.E.D.) hedef siteleri ekleyin. Bu yöntemde, bir HindIII restriksiyon enzim sindirim sitesi (5'-AAGCTT-3') upstream eklenir, ileri astar ve SacII restriksiyon enzim sindirim sitesi (5'-CCGCGG-3') downstream eklenir, ters astar.
      NOT: SacII ve HindIII sitelerinin kullanımı, hedef gende her endonükleaz için konsensüs kesme alanının bulunmamasını gerektirir. Eğer her iki enzim de hedef gen içinde hedef alıyorsa, alternatif restriksiyon enzimleri seçilmelidir. pRS315 vektöründeki polibağlayıcı bölgeyle uyumlu birçok kişi vardır.
    4. Son olarak, kısıtlama enziminin amplikonbozu bağlamak ve sindirmek için izin vermek için her astar 5 ' sonuna dört nükleotit (5'-NNNN-3') sıra çıkıntıekleyin. Astarlar tasarlandıktan sonra, sir2 geninin klonlanması nda kullanılmak üzere ticari olarak sentezlenen oligonükleotidler vardır.
    5. PCR astarlarının yeniden süspansiyonu: PCR astarlarını 4 dakika boyunca maksimum hızda bir masa üstü mikrofuge kullanarak santrifüj edin. 100 μM'lik bir stok konsantrasyonu yapmak için TE çözeltisi ekleyin.
      NOT: 100 μM'lik bir stok yapmak için, TE'nin mikrolitrelerini kullanarak astar tüpteki nmol miktarının 10 katını oluşturan steril TE tampon hacminde astarları çözün. Örneğin, tüp 15,6 nmola astar içeriyorsa, 156 μL TE arabelleği ekleyin.
  2. SIR2 klonlama yapısının PCR amplifikasyonu için yabani tip maya gDNA'sını izole edin.
    NOT: Maya gDNA'sını izole etmek için ticari olarak çeşitli yüksek kaliteli seçenekler mevcuttur. Zimolyaz ile mantar hücre duvarının sindirimini içeren bir kitin kullanımı daha kaliteli gDNA (daha yüksek verim, daha az yabancı lık) ile sonuçlanır. Aşağıdaki protokol sürekli olarak yüksek konsantrasyon ve saflık sağlar. Tavsiye ettiğimiz bir kitin ayrıntılarını Malzeme Tablosu'nda bulabilirsiniz.
    1. YPAD gibi zenginleştirilmiş medyada günlük sonrası faza 48-72 saat için yabani tip maya 5 mL kültür büyütün. Pellet maya hücreleri >800 x g oda sıcaklığında 3 dakika, büyüme ortamı kaldırmak ve zimolyaz sindirim tampon 120 μL 5 μL zymolyaz (2 adet enzim / μL) ile takviye resuspend. 40 dakika boyunca 37 °C'de girdap ve kuluçka ile numuneyi karıştırın.
    2. Bir chaotropic lysis tampon (örneğin, guanidinium klorür), 250 μL kloroform ve girdap 60 s için örnek 120 μL ekleyin.
    3. 2 dk için >8.000 x g'de santrifüj ve supernatant'ı steril bir toplama tüpünde bir arınma sütununa aktarın.
    4. 60 s için >8.000 x g de santrifüj ve üzerinden akışı atın. GDNA sütun matrisine bağlı olacaktır.
    5. Sütunu 300 μL'lik etanol bazlı yıkama tamponuyla iki kez yıkayın ve santrifüj adımını yukarıdan tekrarlayın (3.2.4). Her spinden sonra akışı atın. Kolonu 1,5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın, 60 μL TE tamponu ekleyin ve 60 s oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Dna'yı yok etmek için örneği 30'lar için çevirin.
      NOT: Örnekteki DNA konsantrasyonunu (Absorbance at 260nm) ve kalitesini (Absorbance 260nm/280nm) belirleyin. Tipik bir verim 100-200 ng / μL gDNA 260nm/280nm olarak 1.8 mümkün olduğunca absorbans oranı ile olacaktır.
  3. Klonlama için pRS315 plazmid vektörü yükseltin ve izole edin.
    NOT: Plazmid vektörlerinin saflaştırılması için ticari olarak çeşitli yüksek kaliteli seçenekler mevcuttur. Bu adım için silika bazlı kolon kimyası önerilir. Aşağıda belirtilen değişiklikler en yüksek konsantrasyon ve saflık yol açmıştır. Ayrıntılar Malzeme Tablosu'ndabulunmaktadır.
    1. LB+ ampisilin (80 g/mL) ortamlarda bir gecede pRS315 vektörü içeren 5 mL E. coli kültürünü büyütün. Rt 'de (15-25 °C) 2 dk için >8.000 x g'de santrifüj ile kültür pelet.
    2. RNase A (100 μg/mL) ile 250 μL TE tamponundaki peletli bakteri hücrelerini yeniden askıya alın ve mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre kümelerinin kalmadığından emin olun.
    3. Tüpü 6-8 kez ters çevirerek 250 μL lysis tampon ekleyin ve karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka. Lysis fazla 5 dakika devam etmesine izin verme – biraz daha az tercih edilir.
    4. 350 μL nötralizasyon tamponu ekleyin ve tüpü 10 kez ters çevirerek hemen ve iyice karıştırın. 10 dk için santrifüj >8,000 x g.
    5. Supernatant'ı yukarıdan borulama ile silika spin sütununa dikkatlice aktarın. 30 s için santrifüj ve akış atmak.
    6. Adım 3.3.5 gibi yüksek tuz yıkama tampon ve santrifüj 500 μL ekleyin. Akışı atın. Dna bağlayıcı spin sütununa 750 μL'lik etanol bazlı yıkama tamponu ekleyerek, artık tuzları ve 3.3.5 adımdaki santrifüjü temizleyerek yıkayın.
    7. Kalan yıkama tamponu kaldırmak için >8.000 x g ek bir 2 dakika için akışı ve santrifüj atın. Dönüş sütununa temiz, etiketli 1,5 mL mikrosantrifüj tüp yerleştirin. DNA'yı ejeketmek için, spin sütununun ortasına 20 μL TE tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika kuluçkaya yatırın ve 1 dk >8,000 x g.'desantrifüj .
    8. DNA'nın miktarını (Absorbance at 260nm) ve kalitesini (Absorbance 260 nm/280 nm) belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Tipik bir verim 1-2 μg/μL olacaktır.
  4. Aday gen SIR2'nin yabani tip genomik DNA'dan PCR amplifikasyonu
    1. Klonlamaya uygun bir amplicon üretmek için, yüksek sadakatli (HF) PCR polimeraz kullanarak diziye istenmeyen mutasyon oluşumunu önlemek için güçlendirilmektedir.
      NOT: Birçok farklı yüksek kaliteli PCR seçenekleri ticari olarak mevcuttur. PCR reaksiyon koşullarının optimizasyonunu kolaylaştırmak için, iki arabellek kombinasyonu kullanın: biri standart bir HF arabelleği, diğeri yüksek GC ve karmaşık ampliconlar için optimize edilebilen. Ayrıntılar Malzeme Tablosu'ndabulunabilir.
    2. PCR, Sir2 yapısını Tablo 1'de açıklandığı gibi klonlama için yükseltin.
      NOT: Klonlama adımlarında başarıyı en üst düzeye çıkarmak için, birden fazla aynı 50 μL ayarlanabilir ve bir PCR sütun temizleme adımı ile konsantre edilebilir. Bir gDNA şablon kontrol reaksiyonu (negatif kontrol) kurmak için emin olun.
    3. Tablo 2'de açıklandığı gibi PCR bisiklet koşullarını ayarlayın.
      NOT: Farklı astar çiftleri, anaaling sıcaklıklarına göre değişir ve farklı polimerazlar farklı hızlarda çalışır. Seçilen enzime ve tasarladığı gibi astar kombinasyonunun özelliklerine göre amplifikasyon koşullarını optimize etmeyi unutmayın.
    4. %1.0 TAE-agarose jel (görselleştirme için 0.5 g/mL ethidyum bromür ile) yaklaşık 2,5 kb DNA parçası üretecek OLAN PCR reaksiyonunu görselleştirerek PCR reaksiyonunun başarısını doğrulayın.
  5. Sindirimi ve aday gen ligasyon, SIR2, pRS315 plazmid vektöriçine.
    1. Vektör ve kesici uç kısıtlama sindirim gerçekleştirin: 625 ng DNA (vektör veya insert), qs. su 50 μL son reaksiyon hacmi getirmek için, tampon 5 μL, 1 μL SacII, ve 1 μL HindIII. 37 °C'de 3 saat boyunca restriksiyon sindirimini, ardından enzimleri ısıtmak için 20 dk boyunca 80 °C'de inküksiyon. Sindirim bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir.
    2. İstenilen plazmidi oluşturmak için 15°L ligasyon reaksiyonu ayarlayın: 6 μL steril su, 2 μL sindirilmiş vektör (50 ng DNA), 4 μL sindirilmiş kesici uç (100 ng DNA), 2 μL T4 reaksiyon tamponu ve 1 μL T4 DNA Ligaz. Ligasyon reaksiyonlarını bir gecede 16 °C'de kuluçkaya yatırın ve ardından enzimi ısıtmak için 20 dk boyunca 80 °C'ye inküleyin.
      NOT: Kesici uç yerine 4 μL daha steril su (10°L toplam) yerine hiçbir kesici uç kontrolü kurun.
    3. Ligasyon reaksiyonlarını E. coli'yedönüştürün.
      NOT: Yetkili hücreler için kullanılabilen birçok seçenek vardır. Bu protokol, kullanılmadan önce -80 °C'de saklanan kimyasal olarak yetkin hücreleri kullanır.
      1. 50 μL'lik donmuş, yetkin E. coli hücrelerini buz üzerinde eritin ve hemen 15 μL ligasyon reaksiyonu ekleyip ekleyin. Tüpü birkaç kez titretin. Hemen buz tüpleri dönmek ve 30 dakika kuluçka.
      2. Tam olarak 42 °C'de bir su banyosunda 20 s'lik hücreleri ısıtın ve tüpleri 2 dk kuluçka için hemen buza döndürün. Her dönüşüm reaksiyonuna 450 μL oda sıcaklığında geri kazanım ortamı (örneğin, SOC veya LB) ekleyin ve 37 °C'de 60 dakika boyunca sallayarak kuluçkaya yatırın.
      3. Her dönüşüm reaksiyonu için, hücrelerin 1:10 seyreltilmesi olun. Steril tekniği kullanarak, plaka 150 μL seyreltilmemiş hücrelerin ve 1:10 seyreltme ler üzerine LB + (80 g/mL) ampisilin plakaları35. Plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Aşırı ifade vektörü için potansiyel dönüştürücüleri ekran.
    1. Steril tekniği kullanarak, 5 mL LB + (80 μg/mL) ampisiline dönüşen ve bir gecede büyüyen potansiyel transformatanları aşılamak. Yukarıdaki bölüm 3.3.1-3.3.7'de belirtilen prosedürü izleyerek, plazmidleri her potansiyel transformanttan izole edin ve kesici uç sindiriminin başarılı bir şekilde entegrasyonu için %1.0 TAE-agarose jelüzerinde jel elektroforez (görselleştirme için 0.5 g/mL ethidum bromür ile) takip edin.

4. Vektörü atg1Δ ve yabani tip maya suşlarına dönüştürün

NOT: Bu değiştirilmiş lityum asetat dönüşüm protokolü kullanılarak gerçekleştirilir36.

  1. Pelet 15 mL yabani tip ve atg1-null maya hücreleri ypad ortamda erken orta günlük faz (O.D. 600nm = 0.4-0.9) için büyüme 3 dakika için yetiştirilen > 800 x g oda sıcaklığında.
  2. Supernatant decant, steril ddH2O 1 mL hücre pelet yeniden askıya ve 1.7 mL mikrofuge tüp içeriğini aktarın. Oda sıcaklığında 3 dk; oda sıcaklığında 800 x g'lık hücrelere pelet.
  3. Süpernatant'ı çıkarın ve 100 mM lityum asetat ile 250 μL'lik hücreleri nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Gerçekleştireceğiniz dönüşümlerin her biri için hücreleri ayrı mikrofuge tüplere bölün. Dönüşüm başına hücre-lityum asetat karışımının 50 μL'sini kullanın.
  4. Bir dönüşüm karışımı ayarlayın. Dönüşümlerin her biri için eklemek: 240 μL 50% 50 PEG3350, 36 μL 1.0 M Lityum asetat, ve 5 μL Somon sperm (veya diğer taşıyıcı) DNA, 5 dakika ve buz üzerinde haşlanmış.
    NOT: PEG çok viskoz. Pipet ve dikkatle ölçün. Devam etmeden önce her bileşenin eklenmesinden sonra pipetleme ile karıştırın.
  5. Yapılan her dönüşüm için uygun plazmid5 μL ekleyin. Girdap her tüp iyice karıştırmak için. Numuneleri 30 °C'de 45 dk kuluçkaya yatırın. 10 dk için 42 °C'de ısı şoku örnekleri.
  6. Oda sıcaklığında 3 dk > 800 x g'lık pelet hücreleri, dönüşüm karışımını dikkatlice çıkarın ve yukarıdaki spini tekrarlayarak 300 μL steril ddH2O. Pelet hücrelerindeki numuneleri yeniden askıya alın, suyu dikkatlice çıkarın ve 200 μL steril ddH2O'da numunelerinizi yeniden askıya alın.
  7. Maya her dönüştürülmüş suşu için 1/10 ve 1/100 seyreltme ayarlayın.
  8. Plazmidler için seçmek için her numuneden 150 μL'lik steril teknik plakayı Kullanarak SC-lösin plakaları üzerine yerleştirin. Hücreleri düzgün ve eşit olarak yayın ve 30 °C'de ters çevirmeve kuluçkadan önce plakanın kurumasını bekleyin ve 48-72 saat uzamasını bekleyin.
    NOT: Uygun suşu oluşturulduktan sonra -80 °C'de %25 gliserolde uzun süreli saklanabilir. Mevcut kopya sayısının niceliği, qPCR, RNA-FISH veya başka bir uygun ölçü37,38dahil olmak üzere çeşitli metodolojiler tarafından belirlenebilir.

5. Kısaltılmış CLS fenotip baskısını test etmek için kronolojik ömrü belirleyin

  1. Kısa ömürlü maya CLS üzerinde putatif bastırıcı aşırı ekspresyon etkisini test edin, atg1Δ mutant, zaman39bir fonksiyonu olarak kalır koloni oluşturan birimlerin (CPU) sayısını belirleyerek .
    NOT: Denemenin bu bölümünü uygun denetimlerle ayarlamak gerekir. Tipik bir deney, yabani bir maya türünü (WT) boş vektörle, WT'yi bastırıcı vektörü, silme mutantını boş vektörle ve silme mutantını bastırıcı vektörüyle karşılaştıracaktır.
    1. SC-LEU medya içine çalışma ve aşılamak için suş tek bir koloni alın. Kültürü 30 °C'de 72 saat boyunca sallayarak büyütün.
    2. Bir hemositometre kullanarak, kültür40mevcut hücrelerin konsantrasyonu belirlemek.
    3. Kültürün bir aliquot seyreltmek, böylece sonuç steril su 150 μL hacmi hücrelerin in tek tip bir sayıdır. SC-LEU plakaları üzerine steril tekniği kullanarak kültür plaka ve 72 saat için 30 °C'de büyümek. Bu plakalar gün üç saat noktası ve deney% 100 canlılık39olarak bu zaman noktasına normalize edilecektir.
      NOT: Hücre sayısı 200-500, analiz için yeterince büyük ve sayma için yönetilebilir bir sayı olmalıdır. Bu çalışmada kaplama miktarımız için 200 hücre kullandık.
    4. Maya kültürlerini 30 °C'de kuluçkaya yatırmaya devam edin, 5.1.3'te belirtildiği gibi düzenli aliquots ve kaplama alın. Suşlar artık geçerli olana kadar bu işleme devam edin, ardından sonuçları derleyip analiz edin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan suşların tam listesi Tablo 3'tebulunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yaşlanma sırasında SIR2 rolü hakkında çelişkili raporlar olduğu gibi, biz atg1Δ mutant kısaltma CLS fenotip potansiyel bir bastırıcı olarak çalışma için bu geni seçti26. SIR2 rolü biraz tartışmalı, CLS uzanan rolü hakkında çelişkili raporlar ile, ancak açıkça en az bir maya arka plan artmış CLS ile bağlantılı olmuştur, hem otofaji ve mitophagy bir rol ile22,31,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yaşlanma nın genetiğini çözmek zor bir iştir ve daha fazla çalışma için var olan karmaşık etkileşimler hakkında önemli bilgiler edinebilecek pek çok fırsat vardır. Maya45,46null suşları çalışması için fonksiyon kaybı mutantların hızlı nesil için izin birçok yöntem vardır. Bu yöntem, aşırı ekspresyon baskılayıcı çalışmalar için pRS315 vektörüne genleri tanımlamak ve klonlamak için basit bir yaklaşım sunar. Bu yakla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ediyor.

Teşekkürler

James T. Arnone, 2017 ve 2018 yıllarında William Paterson Üniversitesi'nde düzenlenen rekombinant DNA Teknolojileri dersinde yer alan ve bu projede yer alan ancak çabaları yazarlık eşiğini aşmayan öğrencilerin desteğini kabul etmek ister: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie Irvin Gamarra, Precious Isbor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rektör, Aida Shono ve Matthew So. Siz büyük bilim adamlarısınız ve hepinizi özledim!

Yazarlar, William Paterson Üniversitesi'nde Eğitim ve Araştırma Teknolojisi'nin paha biçilmez desteğini kabul etmek isterler: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella ve Henry Heinitsh. Yazarlar ayrıca SANAT desteği için Provost Ofisi, Dekan Ofisi ve Bilim ve Sağlık Koleji Araştırma Merkezi bu çalışmayı desteklemek ve bu projeyi desteklemek için Biyoloji Bölümü kabul etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Fungal/Bacterial DNA kitZymo ResearchD6005
HindIIIHF enzymeNew England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Plasmid miniprep kitQiagen12123
SacII enzymeNew England BiolabsR0157S
Salmon sperm DNAThermofisherAM9680
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S

Referanslar

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 163kronolojik ya lanmaotofajiSIR2lizin deasetilazbask lay c ekranSaccharomyces cerevisiae kopya numaras ekran

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır