JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

Abstract

הזדקנות היא ההידרדרות התלויה בזמן של התהליכים הביולוגיים הרגילים של אורגניזם שמגבירה את ההסתברות למוות. גורמים גנטיים רבים תורמים לשינויים בתהליך ההזדקנות הרגיל. גורמים אלה מצטלבים בדרכים מורכבות, כפי שמעיד העושר של קישורים מתועדים שזוהו וורגנו באורגניזמים רבים. רוב המחקרים מתמקדים באובדן תפקוד, מוטציות Null המאפשרות הקרנה מהירה של גנים רבים בו זמנית. יש הרבה פחות עבודה שמתמקדת באיפיון התפקיד שבאופן יתר של גן בתהליך זה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לזהות ולשבט גנים שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, למחקר בדיכוי של פנוטיפ תוחלת החיים כרונולוגי קצר תוחלת חיים לראות ברקעים גנטיים רבים. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לחוקרים ממגוון רחב של רקעים ובצבים אקדמיים שונים. הגן SIR2, אשר קודים עבור deacetylase histone, נבחר לשיבוט בוקטור pRS315, כפי שהיו דיווחים סותרים על השפעתו על תוחלת החיים הכרונולוגית. SIR2 גם ממלא תפקיד autophagy, אשר תוצאות כאשר משובש באמצעות מחיקה של מספר גנים, כולל גורם שעתוק ATG1. כהוכחה עקרונית, אנו משכפלים את הגן SIR2 כדי לבצע מסך מדכא על פנוטיפ תוחלת החיים המקוצר האופייני למוטציה הפגויה באוטופיה ולהשוות אותו לרקע גנטי איזוגני, פראי.

Introduction

הזדקנות היא אובדן תלוי הזמן של יושרה בתהליכים ביולוגיים אינספור שבסופו של דבר מגביר את ההסתברות למוות אורגני. הזדקנות היא כמעט בלתי נמנעת עבור כל המינים. ברמה התאית ישנם מספר סימני היכר מאופיינים היטב הקשורים להזדקנות, כולל: חוסר יציבות גנומית, שינויים אפיגנטיים, אובדן פרוטאוסטזיס, תפקוד מיטוכונדריאלי, חישה תזונתית מפוקחת, רגישות תאית, והתשהטלומר 1,,2. באורגניזמים חד-תאיים, כגון שמרים, הדבר מוביל לירידה בפוטנציאל המשכפל ותורוחהחיים הכרונולוגית 3,4. שינויים תאיים אלה באים לידי ביטוי אורגניזמים מורכבים יותר, כמו בני אדם, כמו פתולוגיות הכוללות סרטן, אי ספיקת לב, ניוון עצבי, סוכרת,אוסטאופורוזיס 5,,6,7. למרות המורכבות הרבות המאפיינת את תהליך ההזדקנות, יש שימור של סימני ההיכר המולקולריים האלה, המקמים את התהליך הזה על פני אורגניזמיםמפוצלים נרחבים 8,9,10. זיהוי של שינויים במסלולים אלה במהלך ההזדקנות הוביל להבנה כי הם יכולים להיות מניפולציה באמצעות שינויים באורח החיים – הגבלה תזונתית מוצגת להאריך באופן משמעותי את תוחלתהחיים באורגניזמים רבים 11. מסלולים אלה מתכנסים ומצטלבים זה עם זה ועם מסלולים רבים אחרים, בדרכים מורכבות. ההתללות והאפיון של אינטראקציות אלה מציעות פוטנציאל להתערבויות טיפוליות כדי להאריך את תוחלת החיים ואת תוחלתהחיים 12,,13,14.

שימור התבניות המולקולריות מאפשר ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות גנטיות הבסיס לתהליך באמצעות אורגניזמים מודל פשוט יותר – כולל שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae15,16. ישנם שני סוגים מבוססים של הזדקנות במודל על ידי שמרים ניצנים: הזדקנות כרונולוגית (תוחלת החיים הכרונולוגית, CLS) והזדקנות משוכפלת (תוחלת החיים משוכפלת, RLS)17. הזדקנות כרונולוגית מודדת את משך הזמן שתא יכול לשרוד במצב שאינו מחולק. זה מקביל להזדקנות כי הוא נראה בתאים שמבלים את רוב חייהם ב G0, כגון נוירונים4. לחלופין, תוחלת חיים משוכפלת היא מספר הפעמים שתא יכול לחלק לפני תשישות והוא מודל עבור סוגי תאים פעילים mitotically (למשל, מספר תאי הבת כי תא יכול להיות)18.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להציג פרוטוקול המאפשר ניתוח פונקציונלי של הגנטיקה של הזדקנות באמצעות S. cerevisiae. אמנם היו מחקרים מצוינים רבים שבוצעו על ידי חוקרים רבים שהובילו להבנה הנוכחית שלנו, נותרו הזדמנויות רבות זמינות עבור חוקרים ניצנים לתרום לתחום ההזדקנות מתחילת הקריירה האקדמית שלהם. אנו מציגים מתודולוגיה ברורה שתאפשר לחוקרים לקדם עוד יותר את תחום ההזדקנות. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לכל החוקרים ללא קשר לשלב בקריירה האקדמית שלהם על ידי מתן הכלים הדרושים כדי לגבש ולבדוק את השערות הרומן שלהם. היתרון של הגישה שלנו הוא כי זוהי שיטה חסכונית נגישה לכל החוקרים ללא קשר למוסד – ואינה דורשת יקר, ציוד מיוחד הדרוש עבור פרוטוקולים מסוימים19. ישנן מספר דרכים שונות לעצב סוג זה של מסך, הגישה המתוארת בעבודה זו היא במיוחד מותנה מוטציות null של גנים לא חיוניים המציגים הפחתה חמורה תוחלת החיים הכרונולוגית לעומת זן איזוגניים מסוג בר של שמרים.

כהוכחה עקרונית שלנו, אנו לשבט SIR2, deacetylase לייסין דיווח כמוצג הן מורחבת CLS מקוצר כאשר בהגזמה. SIR2 overexpression נמצא לאחרונה להגדיל CLS שמרים ייצור יין; עם זאת, מספר קבוצות דיווחו על כל קשר בין הארכת SIR2 ל-CLS, והותירו את תפקידהתחת מאופיין 20,21,22. בשל דיווחים סותרים אלה בספרות, בחרנו בגן זה כדי להוסיף מחקר עצמאי כדי לעזור להבהיר את התפקיד של SIR2 בהזדקנות כרונולוגית, אם בכלל. בנוסף, הגדלת מספר העותק של הומולוג SIR2 מאריכה את תוחלת החיים במערכת מודל תולעת נמטודה23.

Autophagy היא מערכת השפלה תאית כדי לספק מוצרים cytosolic, כגון חלבונים organelles, כדי lysosome24. Autophagy מקושר באופן אינטימי אריכות ימים באמצעות תפקידו בהשפלה חלבונים פגומים organelles כדי לשמור על הוםאוסטזיס תאי25. אינדוקציה של autophagy תלוי תזמור הביטוי של גנים רבים, ואת המחיקה של הגן ATG1 תוצאות CLS קצר באופן חריג שמריםניצנים 26. ATG1 קודי עבור חלבון serine / קינאז threonine הנדרש עבור היווצרות שלוק autophagy ואת ציקופלסמה-כדי vacuole (המקבילה הפטרייתית lysomal)מסלול 27,28. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו עבור מסך מספר עותק מוגבר, בדיקת ההשפעה של עותק SIR2 מוגברת על CLS בסוג פראי ורקע atg1-null. שיטה זו מתאימה במיוחד לחוקרים זוטרים ולקבוצות מחקר במוסדות לתואר ראשון בעיקר, שרבים מהם משרתים קהילות שאינן מיוצגות כראוי במדעים ויש להן משאבים מוגבלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. זיהוי אינטראקציות גנטיות פוטנציאליות להקרנה

  1. זהה את הרקע הגנטי לאפיון, ותוצאה היא תוחלת חיים כרונולוגית קצרה באופן חריג (CLS) ב Saccharomyces cerevisiae באמצעות מסד הנתונים הגנום Saccharomyces (SGD, https://www.yeastgenome.org29,30),אשר אוסף מידע פנוטיפי ידוע עבור אורגניזם זה.
    1. בחר בכרטיסיה פונקציה מהאפשרויות בראש דף האינטרנט.
    2. בחר פנוטיפ ולאחר מכן בחר עיון בכל הפנוטיפים.
    3. מאפשרויות האונטולוגיה של פנוטיפ שמרים לגלול אל כותרת המשנה פיתוח ובחר תוחלת חיים כרונולוגית, נמצא תחת כותרת משנה תוחלת חיים.
    4. בחר את המזהה עבור ירידה, המאפשר זיהוי של גנים המציגים פנוטיפ התוצאה של פנוטיפ תוחלת חיים כרונולוגית מופחתת בעת נמחק. עבור הוכחת שיטה זו atg1大 נבחר, מה שופך פנוטיפ CLS קצר מועד והוא משובש עבור autophagy26.
  2. זהה את גינות היעד כדי לסנן אינטראקציות גנטיות שעשויות לדכא את הפנוטיפ, בהתבסס על תכונות אונטולוגיה שדווחו או חזויות, של המוטנט שזוהה בחלק 1.2. חזור על חיפוש פנוטיפ כפי שנמצא בשלבים 1.1.1-1.1.4 לעיל, שאילתה עבור גנים התוצאה CLS ארוך יותר כאשר בהדפס יתר ברקע מסוג פראי. SIR2 נבחר בהתבסס על פנוטיפ CLS שדווח ודיווח על אינטראקציות עם autophagy31,32.

2. הכן ריאגנטים

הערה: אלא אם צוין אחרת autoclave כל פתרון ב 121 °C במשך 20 דקות כדי לחטא לפני השימוש.

  1. YPAD מדיה נוזלית: להוסיף 1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% דקסטרוז (גלוקוז), ו 40 אדנין מ"ג (כמו אדנין גופרתי מיובש) לליטר של מים מזוקקים כפול. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
  2. LB מדיה נוזלית: להוסיף טיף (10 גרם), תמצית שמרים (5 גרם), ונתרן כלוריד (10 גרם) לליטר של מים מזוקקים כפולים. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
  3. להכין 1000x (100 מ"ג / מ"ל) מלאי אאמפיצילין, במים מזוקקים כפול. מערבבים היטב ומחטאים.
  4. סינתטי להשלים – לאוצין (SC-LEU) מדיה נוזלית: להוסיף 1.7 גרם של שמרים בסיס חנקן w / o חומצות אמינו, 2% גלוקוז, 1.92 גרם של SC-LEU נושר לערבב, 5 גרם אמוניום סולפט לליטר של מים מזוקקים כפול. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
  5. מאגר TE: מערבב Tris (10 mM ריכוז סופי), EDTA (1 mM ריכוז סופי) בתמיסה עם מים מזוקקים כפול. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
  6. הכן 50% PEG 3350 בתמיסה עם מים מזוקקים כפולים. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
  7. הכן 1 M ו 100 mM ליתיום אצטט פתרון עם מים מזוקקים כפול. מערבבים היטב עם מערבל מגנטי.
    הערה: כדי להפוך צלחות אגר מוצק להוסיף 20 גרם של אגר (לליטר עם מים מזוקקים כפולים) למדיה מוכנה 2.1 ו 2.2 מעל לפני autoclaving. אם הכנת לוחות אאמפיצילין להוסיף 1mL של ampicillin לתקשורת ב 2.2 לעיל לאחר שהוא התקרר בערך 60 מעלות צלזיוס. יוצקים לתוך צלחות סטריליות ומאפשרים להגדיר במשך 48-72 שעות לפני השימוש. אחסן צלחות ב-4°C לאחסון ארוך יותר.

3. תכנון אסטרטגיית השיבוט כדי לשכפל SIR2 לתוך וקטור pRS315

  1. עיצוב פריימרים PCR כדי להגביר את הגן SIR2 לשיבוט לתוך וקטור pRS315.
    1. עיצוב פריימרים באופן ידני כדי לקבל 21-22 נוקלאוטידים משלימים לאזורים הבין-גגניים במעלה הזרם ובמורד הזרם של SIR2. ודא כי הגן כולו, יחד עם האזורים לא מתורגם של mRNA משוכפל על ידי מיפוי תכונות אלה מ- datasetsהזמינים 33,34.
    2. ודא שעיצוב פריימר PCR יתקדם ויהפוך עם טמפרטורת התכה (Tm) מעל 53°C ומתחת ל- 60°C.
      הערה: באופן אידיאלי, שני פריימרים צריכים להיות Tm קרוב ככל שרצף יאפשר, עם תוכן GC משוער של בין 40-50%, הקפדה להימנע חוזרות dinucleotide ואיזון GC ו- AT הפצה לאורך כל הרצף.
    3. לאחר העיצוב של פריימרים PCR שיאפשרו את הדור של amplicon לשיבוט, להוסיף אתרי יעד עיכול אנזימים הגבלה (R.E.D. ) לסוף 5 ' של כל פריימר התואמים וקטור שיבוט plasmid. בשיטה זו, אתר עיכול אנזימים הגבלת הינדי (5'-AAGCTT-3') מתווסף במעלה הזרם, פריימר קדימה ואתר עיכול אנזימים הגבלת SacII (5'-CCGCGG-3') מתווסף במורד הזרם, פריימר הפוך.
      הערה: השימוש באתרי SacII ו- HindIII דורש כי אתר החיתוך הקונצנזוס עבור כל endonuclease אינו קיים בגן היעד. אם אחת ממטרות האנזימים בתוך גן היעד, יש לבחור אנזימי הגבלה חלופיים. ישנם רבים התואמים לאזור polylinker על וקטור pRS315.
    4. לבסוף, הוסף עודף רצף של ארבעה נוקלאוטידים (5'-NNNN-3') לסוף ה-5' של כל פריימר כדי לאפשר לאנזים ההגבלה לאגד ולעכל את האמפליקון. לאחר פריימרים תוכננו, יש oligonucleotides מסונתז מסחרית לשימוש שיבוט הגן SIR2.
    5. תחישות מחדש של פריימר PCR: צנטריפוגה פריימרים PCR באמצעות מיקרופוג שולחן במהירות מרבית במשך 4 דקות. הוסף פתרון TE כדי להפוך את ריכוז המניות של 100 μM. לאחסן את ריכוז המלאי ב -20 °C ולדלל 1/10 לשימוש ביישומים PCR.
      הערה: כדי ליצור מניה של 100 μM, המיס את הפרימרים בנפח של מאגר TE סטרילי שהוא פי 10 מכמות ה-nmoles בצינור פריימר, באמצעות מיקרוליטרים של TE. לדוגמה, אם הצינור מכיל 15.6 נהל-סמול של פריימר, הוסף 156 μL של מאגר TE.
  2. בודד gDNA שמרים מסוג פראי להגדלת PCR של מבנה השיבוט SIR2.
    הערה: מספר אפשרויות באיכות גבוהה זמינות מסחרית לבידוד gDNA שמרים. ניצול של ערכה הכוללת את העיכול של קיר התא פטרייתי עם zymolyase תוצאות gDNA באיכות טובה יותר (תשואה גבוהה יותר, פחות מזהמים). הפרוטוקול שלהלן מחזיר באופן עקבי ריכוז וטוהר גבוהים. פרטים על ערכה שאנו ממליצים עליה נמצאים בטבלת החומרים.
    1. לגדול 5 מ"ל תרבות של שמרים מסוג בר עבור 48-72 שעות לשלב שלאחר יומן במדיה מועשרת, כגון YPAD. גלולות את תאי שמרים ב >800 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את מדיית הצמיחה, ולתחל מחדש ב 120 μL של מאגר עיכול zymolyase בתוספת עם 5 μL של זימוליזה (2 יחידות אנזים / μL). מערבבים את הדגימה על ידי מערבולת ודגירה ב 37 °C במשך 40 דקות.
    2. להוסיף 120 μL של מאגר lysis chaotropic (למשל, גאנידיניום כלוריד), 250 μL של כלורופורם, ומערבולת המדגם עבור 60 s.
    3. צנטריפוגה ב >8,000 x g במשך 2 דקות ולהעביר את supernatant לתוך עמודת טיהור בצינור אוסף סטרילי.
    4. צנטריפוגה ב ->8,000 x g עבור 60 s ולזרוק את הזרימה דרך. GDNA יהיה מאוגד למטריצת העמודה.
    5. לשטוף את העמודה פעמיים עם 300 μL של מאגר כביסה מבוסס אתנול, חוזר על צעד הצנטריפוגציה מלמעלה (3.2.4). בטל את הזרימה לאחר כל סיבוב. העבר את העמודה לתוך צינור מיקרופוג 1.5 מ"ל, להוסיף 60 μL של מאגר TE, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 60 s. תסובב את הדגימה ל-30 שניות כדי לתנוע את הדנ"א.
      הערה: לקבוע את ריכוז ה-DNA בדגימה (ספיגה ב 260nm) ואת האיכות (ספיגה 260nm/280nm). תשואה אופיינית תהיה 100-200 ng/ μL של gDNA עם יחס ספיגה ב 260nm/280nm קרוב ככל האפשר 1.8.
  3. להגביר ולבודד את וקטור pRS315 פלסמיד לשיבוט.
    הערה: מספר אפשרויות באיכות גבוהה זמינות מסחרית לטיהור וקטורים פלסמיד. מומלץ לכימיה של עמודה המבוססת על סיליקה עבור שלב זה. השינויים האם להלן הובילו לריכוז ולטוהר הגבוהים ביותר. פרטים נמצאים בטבלת החומרים.
    1. לגדול 5 מ"ל של תרבות של E. coli המכיל את וקטור pRS315 לילה LB + אאמפיצילין (80 μg / מ"ל) מדיה. גלול את התרבות על ידי צנטריפוגה ב >8,000 x g עבור 2 דקות ב RT (15-25 ° C).
    2. להשעות מחדש תאים חיידקיים כדוריים ב 250 μL של מאגר TE עם RNase A (100 μg / מ"ל) ולהעביר צינור microcentrifuge. ודא שלא יישארו גושי תאים.
    3. להוסיף 250 μL של מאגר lysis ולערבב על ידי היפוך הצינור 6-8 פעמים. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. אל תאפשרו לליסיס להמשיך יותר מ-5 דקות – עדיף קצת פחות.
    4. להוסיף 350 μL של חיץ נטרול ולערבב באופן מיידי ויסודי על ידי היפוך הצינור 10 פעמים. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-8,000 x גרם.
    5. העבר בזהירות את הסופרנטנט מלמעלה לעמודת ספין סיליקה על ידי התפתל. צנטריפוגה ל-30 שניות ולהיפטר מהזרימה.
    6. להוסיף 500 μL של מאגר שטיפת מלח גבוה צנטריפוגה כמו בשלב 3.3.5. תמחק את הזרימה. לשטוף את עמודת ספין איגוד DNA על ידי הוספת 750 μL של מאגר כביסה מבוסס אתנול, כדי להסיר מלחים שיורית, צנטריפוגה כמו בשלב 3.3.5.
    7. בטל את הזרימה וצנטריפוגה למשך 2 דקות נוספות ב- >8,000 x g כדי להסיר מאגר שאריות כביסה. מניחים את עמודת הספין בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי עם תווית של 1.5 מ"ל. כדי להגן על ה-DNA, הוסף 20 μL של מאגר TE למרכז עמודת הסיבוב, דגירה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-8,000 x g.
    8. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את הכמות (ספיגה ב 260nm) ואת האיכות (ספיגה 260 מילימטר / 280 מילימטר) של ה-DNA. תשואה טיפוסית תהיה 1-2 μg/μL.
  4. PCR ההגדלה של הגן המועמד, SIR2, מן ה-DNA גנומי מסוג פראי
    1. כדי לייצר אמליקון המתאים לשיבוט, השתמשו בפולימראז PCR באיכות גבוהה (HF) כדי למנוע את הדור הלא מכוון של מוטציות לתוך הרצף להיות מוגבר.
      הערה: אפשרויות PCR רבות ושונות באיכות גבוהה זמינות באופן מסחרי. כדי להקל על מיטוב תנאי התגובה של PCR, השתמש בשילוב של שני מאגרים: אחד שהוא מאגר HF סטנדרטי ואחד ממוטב ל-GC גבוה ואמפליצ'ונים מורכבים. ניתן למצוא פרטים בטבלת החומרים.
    2. PCR הגביר את מבנה SIR2 לשיבוט כמתואר בטבלה 1.
      הערה: כדי למקסם את ההצלחה בשלבי השיבוט, ניתן להגדיר ולרכז מספר רב של μL זהה של עמודת PCR. הקפד להגדיר תגובת בקרת תבנית gDNA אחת ללא gDNA (פקד שלילי).
    3. הגדר את תנאי הרכיבה על אופניים PCR כמתואר בטבלה 2.
      הערה: זוגות פריימר שונים משתנים בהתאם לטמפרטורת ההתפלה שלהם ופולימראזים שונים מתפקדים במהירויות שונות. הקפד למטב את תנאי ההגדלה בהתבסס על האנזים שנבחר ועל המפרטים של שילוב פריימר כפי שתוכנן.
    4. ודא את ההצלחה של תגובת PCR על ידי הדמיית תגובת PCR, אשר יפיק כ 2.5 kb של שבר DNA, על 1.0% טאי-agarose ג'ל (עם 0.5 μg / mL אתידיום ברומיד להדמיה).
  5. עיכול ורצועה של הגן המועמד, SIR2, לתוך וקטור pRS315 פלסמיד.
    1. לבצע הגבלת עיכול של וקטור ואת הכנס: 625 ng DNA (או וקטור או הכנס), q.s. מים כדי להביא את עוצמת התגובה הסופית 50 μL, 5 μL של חוצץ, 1 μL SacII, ו 1 μL הינדי. דגירה עיכול ההגבלה ב 37 ° C עבור 3 שעות, ואחריו 80 ° C במשך 20 דקות כדי לחמם להשבית את האנזימים. ניתן לאחסן את התקצירים ב- 4 °C לפני שתמשיך לשלב הבא.
    2. להגדיר תגובת קשירה μL 15 כדי ליצור את הפלסמיד הרצוי: 6 μL של מים סטריליים, 2 μL וקטור מעוכל (50 ng DNA), 4 μL מתעכל להוסיף (100 ng DNA), 2 μL T4 תגובה מאגר, ו 1 μL של T4 DNA Ligase. דגירה את תגובות קשירה לילה ב 16 ° C, ואחריו 80 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לחמם להשבית את האנזים.
      הערה: הגדר פקד ללא הוספה, החלפת 4 μL נוספים של מים סטריליים (10 μL סה"כ) במקום ההוספה.
    3. להפוך את תגובות קשירה לאי קולי.
      הערה: קיימות אפשרויות רבות הזמינות עבור תאים מתאימים הזמינים. פרוטוקול זה משתמש בתאים המוסמכים כימית המאוחסנים ב- -80 °C לפני השימוש.
      1. להפשיר צינור 50 μL של קפוא, תאי חיידקי אי קולי על קרח עד רק הפשיר ומיד להוסיף 15 μL של תגובת הרצועה. תלחץ על הצינור מספר פעמים. מחזירים מיד את הצינורות לקרח ומחזירים ל-30 דקות.
      2. הלם חום התאים במשך 20 s באמבט מים בדיוק 42 מעלות צלזיוס, ומיד להחזיר את הצינורות לקרח במשך 2 דקות דגירה. הוסף 450 μL של מדיה שחזור טמפרטורת החדר (למשל, SOC או LB) לכל תגובת טרנספורמציה דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C עם רועד.
      3. עבור כל תגובת טרנספורמציה, בצע דילול של 1:10 של תאים. באמצעות טכניקה סטרילית, צלחת 150 μL של התאים הלא מדוללים ואת 1:10 דילול על LB + (80 μg / מ"ל) לוחות אאמפצילין35. דגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס הלילה.
  6. שנאי ם פוטנציאליים מסך עבור וקטור ההתכחשות יתר.
    1. באמצעות טכניקה סטרילית, לחסן את הטרנספורמטים הפוטנציאליים שגדלו לתוך 5 מ"ל LB + (80 μg / מ"ל) אמפוצילין ולגדול בן לילה. בעקבות ההליך המתואר בסעיף 3.3.1-3.3.7 לעיל, לבודד את plasmids מכל טרנספורמטציה פוטנציאלית ומסך לאינטגרציה מוצלחת של המוכנס על ידי עיכול הגבלה ואחריו אלקטרופורזה ג'ל על 1.0% טאי-agarose ג'ל (עם 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד להדמיה).

4. הפוך את הווקטור atg13 וסוג בר שמרים זנים

הערה: פעולה זו מתבצעת באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה ליתיום אצטט שונה36.

  1. כדורי 15 מ"ל של סוג בר ו atg1-null שמרים תאים גדל בן לילה במדיה YPAD לשלב מוקדם עד אמצע יומן (O.D. 600nm = 0.4-0.9) של צמיחה עבור 3 דקות ב > 800 x g בטמפרטורת החדר.
  2. Decant supernatant, להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של ddHסטרילי 2O ולהעביר את התוכן לצינור 1.7 מ"ל microfuge. גלול את התאים במשך 3 דקות ב > 800 x g בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 250 μL של 100 mM ליתיום אצטט עם pipetting עדין. פצל את התאים לצינורות מיקרופוג נפרדים עבור כל אחת מההמרות שתבצע. השתמש 50 μL של תא ליתיום אצטט לערבב לכל המרה.
  4. הגדר תמהיל טרנספורמציה. לכל אחד מהשינויים להוסיף: 240 μL של 50% PEG3350, 36 μL של 1.0 M ליתיום אצטט, ו 5 μL של זרע סלמון (או נשא אחר) DNA, מבושל במשך 5 דקות על קרח.
    הערה: PEG הוא צמיגי מאוד. פיפטה ומדדו בזהירות. מערבבים על-ידי pipetting לאחר הוספת כל רכיב לפני המעבר הלאה.
  5. הוסף 5 μL של פלסמיד המתאים עבור כל שינוי שבוצע. מערבולת כל צינור לערבב ביסודיות. מדגרים את הדגימות ב-30 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. דגימות הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  6. כדורית תאים במשך 3 דקות ב > 800 x g בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את תערובת הטרנספורמציה, ולהשעות מחדש דגימות ב 300 μL של ddHסטרילי 2O. כדורי תאים על ידי חזרה על הסיבוב מעל, בזהירות להסיר מים, ולהשעות מחדש את הדגימות שלך ב 200 μL של ddH סטרילי2O.
  7. הגדר 1/10 ו 1/100 דילול עבור כל זן שהשרים שהפכו.
  8. באמצעות צלחת טכניקה סטרילית 150 μL מכל דגימה על לוחות SC-leucine כדי לבחור עבור פלסמידים. מורחים את התאים באופן אחיד ושטוי ומאפשרים לצלחת להתייבש לפני היפוך דגירה ב-30 מעלות צלזיוס כדי לצמוח במשך 48-72 שעות.
    הערה: לאחר הזן המתאים נוצר, זה יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך ב 25% גליצרול ב -80 °C. הכימות של מספר עותק הנוכחי יכול להיקבע על ידי מספר מתודולוגיות, כולל qPCR, RNA-FISH, או אמצעי מתאיםאחר 37,38.

5. לקבוע את תוחלת החיים הכרונולוגית כדי לבדוק דיכוי פנוטיפ CLS מקוצר

  1. בדוק את ההשפעה של דיכוי יתר של מדכא putative על CLS שמרים קצרי מועד, atg1大 מוטציה, על ידי קביעת מספר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) שנותרו כפונקציה שלזמן 39.
    הערה: יש צורך להגדיר חלק זה של הניסוי עם הפקדים המתאימים. ניסוי טיפוסי ישווה סוג פראי (WT) זן של שמרים עם וקטור ריק, WT עם וקטור המדכא, מוטציה מחיקה עם וקטור ריק, ואת מוטציה המחיקה עם וקטור המדכא.
    1. קח מושבה אחת של המתח כדי ללמוד ולחסן אותו לתוך SC-LEU מדיה. לגדל את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, עם טלטול.
    2. באמצעות hemocytometer, לקבוע את ריכוז התאים הנוכחיים בתרבות40.
    3. לדלל aliquot של התרבות, כך התוצאה היא מספר אחיד של תאים בנפח 150 μL של מים סטריליים. צלחת התרבות באמצעות טכניקה סטרילית על לוחות SC-LEU ולגדול ב 30 מעלות צלזיוס עבור 72 שעות. צלחות אלה הן היום שלוש נקודת זמן והניסוי יהיה מנורמל עד לנקודה זו זמן כמו 100% קיום39.
      הערה: מספר התאים צריך להיות 200-500, גדול מספיק עבור הניתוח ומספר לניהול לספירה. במחקר זה, השתמשנו ב-200 תאים לכמות הציפוי שלנו.
    4. להמשיך דגירה תרביות שמרים ב 30 מעלות צלזיוס, לוקח aliquots רגיל ציפוי כמתואר 5.1.3. המשך בתהליך זה עד שהזנים לא יהיו ברי קיימא עוד, ולאחר מכן בצע הידור וניתוח של התוצאות.
      הערה: הרשימה המלאה של זנים המשמשים במחקר זה נמצאים בטבלה 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כפי שיש דיווחים סותרים על התפקיד של SIR2 במהלך ההזדקנות, בחרנו גן זה למחקר כמדיכוי פוטנציאלי של פנוטיפ CLS הקצר של atg1 Mutant 26. התפקיד של SIR2 הוא שנוי במחלוקת במקצת, עם דיווחים סותרים על תפקידה בהרחבת CLS, עם זאת זה היה קשור בבירור CLS מוגברת ברקע שמרים אחד לפחות, עם תפקיד הן ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

חשיפת הגנטיקה של הזדקנות היא אתגר קשה, עם הזדמנויות רבות למחקר נוסף שיכול להניב תובנות משמעותיות על האינטראקציות המורכבות הקיימות. ישנן שיטות רבות המאפשרות את הדור המהיר של מוטנטים אובדן תפקוד לחקר זנים null של שמרים45,46. שיטה זו מציגה גישה פשוטה כדי לזהות ולש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

ג'יימס ט. ארנונה רוצה להכיר בתמיכת הסטודנטים במסלול טכנולוגיות הדנ"א הרקומביננטי ב-2017 ו-2018 באוניברסיטת ויליאם פטרסון שהיו מעורבים בפרויקט מראשיתו, אבל מאמציהם לא חצו את הסף לכתיבה: כריסטופר אנדינו, חואן בוטרו, ג'וזפין בוזאן, ברנדה קאלפה, ברנדה קובה, הדטאלאב אסל דדז'י, ארווין גאמארה, פרשסג'יפט איזיבור ויין קו, נלסון מג'יה, הקטור מוטולה, רביע נז, עבדאללה עודה, פרל פגונטלן, דניאל רזאי, גבריאלה רקטור, אאידה שנו ומתיו סו. אתם מדענים נהדרים ואני מתגעגע לכולכם!

המחברים רוצים להכיר בתמיכה רבת הערך של הוראה וטכנולוגיה מחקר באוניברסיטת ויליאם פטרסון על עזרתם: גרג מאטיסון, פיטר Cannarozzi, רוב מאייר, דנטה Portella, והנרי הייניטש. המחברים גם רוצים להכיר במשרד של הנשיא לתמיכה באמנות, משרד הדיקן והמרכז למחקר במכללה למדע ובריאות את תמיכתם בעבודה זו, ואת המחלקה לביולוגיה לתמיכה בפרויקט זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fungal/Bacterial DNA kitZymo ResearchD6005
HindIIIHF enzymeNew England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Plasmid miniprep kitQiagen12123
SacII enzymeNew England BiolabsR0157S
Salmon sperm DNAThermofisherAM9680
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S

References

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351(2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1(2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790(2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064(2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502(2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382(2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45(2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156(2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209(2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163autophagySIR2deacetylaseSaccharomyces cerevisiae

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved