Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

Christie Dix; Susan Sgro; Anup Patel; Carly Perrotta; Noor Eldabagh; Katherine  L. Lomauro; Fredy  W. Miguez; Prianka Chohan; Charmi Jariwala; James T. Arnone

doi:10.3791/61506

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Method Article

Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/61506

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September 17th, 2020

Christie Dix¹, Susan Sgro¹, Anup Patel¹, Carly Perrotta¹, Noor Eldabagh¹, Katherine L. Lomauro¹, Fredy W. Miguez¹, Prianka Chohan¹, Charmi Jariwala¹, James T. Arnone¹

¹Department of Biology, William Paterson University

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Riepilogo

Ecco un protocollo per identificare le interazioni genetiche attraverso uno schermo soppressore numero di copie aumentato in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente ai ricercatori di identificare, clonare e testare i soppressori in mutanti di lievito di breve durata. Testiamo l'effetto dell'aumento del numero di copie di SIR2 sulla durata della vita in un mutante nullo autofagi.

Abstract

L'invecchiamento è il deterioramento dipendente dal tempo dei normali processi biologici di un organismo che aumenta la probabilità di morte. Molti fattori genetici contribuiscono alle alterazioni nel normale processo di invecchiamento. Questi fattori si intersecano in modo complesso, come dimostra la ricchezza di collegamenti documentati identificati e conservati in molti organismi. La maggior parte di questi studi si concentra sulla perdita di funzione, mutanti nulli che consentono lo screening rapido di molti geni contemporaneamente. C'è molto meno lavoro che si concentra sulla caratterizzazione del ruolo che sovraespressione di un gene in questo processo. Nel presente lavoro, presentiamo una metodologia semplice per identificare e clonare i geni nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, per lo studio nella soppressione del fenotipo cronologico della durata della vita di breve durata visto in molti background genetici. Questo protocollo è progettato per essere accessibile ai ricercatori provenienti da un'ampia varietà di background e in varie fasi accademiche. Il gene SIR2, che codifica per una deacetilase istonea, è stato selezionato per la clonazione nel vettore pRS315, in quanto ci sono state relazioni contrastanti sul suo effetto sulla durata cronologica della vita. SIR2 svolge anche un ruolo nell'autofagia, che si traduce quando interrotto attraverso la cancellazione di diversi geni, tra cui il fattore di trascrizione ATG1. Come prova di principio, clonamo il gene SIR2 per eseguire uno schermo soppressore sul fenotipo abbreviato della durata della vita caratteristica del mutante atg1, un mutante carente di autofagia, e lo confrontiamo con un background genetico altrimenti isogenico di tipo selvaggio.

Introduzione

L'invecchiamento è la perdita di integrità dipendente dal tempo in una miriade di processi biologici che aumenta in ultima analisi la probabilità di morte dell'organismo. L'invecchiamento è quasi inevitabile per tutte le specie. A livello cellulare ci sono diversi segni distintivi ben caratterizzati che sono associati con l'invecchiamento, tra cui: instabilità genomica, alterazioni epigenetiche, perdita di proteostasi, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolamentato, senescenza cellulare, e logoramento telomero¹^,². Negli organismi a singolo cellula, come i lieviti, questo porta ad una ridu....