Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Resumo

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Resumo

O envelhecimento é o tempo dependente da deterioração dos processos biológicos normais de um organismo que aumenta a probabilidade de morte. Muitos fatores genéticos contribuem para alterações no processo normal de envelhecimento. Esses fatores se cruzam de forma complexa, como evidenciado pela riqueza de elos documentados identificados e conservados em muitos organismos. A maioria desses estudos se concentra na perda de função, mutantes nulos que permitem a triagem rápida de muitos genes simultaneamente. Há muito menos trabalho que se concentra em caracterizar o papel que a superexpressão de um gene nesse processo. No presente trabalho, apresentamos uma metodologia simples para identificar e clonar genes na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae, para estudo em supressão do fenótipo cronológico de vida curta visto em muitas origens genéticas. Este protocolo foi projetado para ser acessível a pesquisadores de uma ampla variedade de origens e em vários estágios acadêmicos. O gene SIR2, que codifica uma deacetilase histone, foi selecionado para clonagem no vetor pRS315, pois houve relatos conflitantes sobre seu efeito sobre a vida cronológica. O SIR2 também desempenha um papel na autofagia, que resulta quando interrompida através da exclusão de vários genes, incluindo o fator de transcrição ATG1. Como prova de princípio, clonamos o gene SIR2 para realizar uma tela supressora no fenótipo de vida encurtado característico do mutante atg1Δ deficiente da autofagia e compará-lo com um fundo genético isogênico e selvagem.

Introdução

O envelhecimento é a perda de integridade dependente do tempo em uma miríade de processos biológicos que, em última análise, aumenta a probabilidade de morte organismoal. O envelhecimento é quase inevitável para todas as espécies. Em nível celular, existem várias marcas bem caracterizadas que estão associadas ao envelhecimento, incluindo: instabilidade genômica, alterações epigenéticas, perda de proteostase, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado, senescência celular e atrito de telômero^1,,2. Em organismos unicelulares, como as leveduras, isso leva a uma redução do potencial replicativo e da vida cronológica^3,4. Essas alterações celulares se manifestam em organismos mais complexos, como humanos, como patologias que incluem cânceres, insuficiência cardíaca, neurodegeneração, diabetes e osteoporose^5,,6,7. Apesar das muitas complexidades que caracterizam o processo de envelhecimento, há a conservação dessas marcas moleculares subjacentes a esse processo em organismos amplamente divergentes^8,,9,,10. A identificação dessas vias durante o envelhecimento levou à percepção de que elas podem ser manipuladas através de mudanças no estilo de vida – a restrição alimentar é demonstrada para prolongar substancialmente a vida útil em muitos organismos¹¹. Esses caminhos convergem e se cruzam entre si e muitos outros caminhos, de formas complexas. A elucidação e caracterização dessas interações oferece potencial para intervenções terapêuticas para prolongar a vida útil e a vida saudável^12,,13,,14.

A conservação dos fundamentos moleculares do envelhecimento permite a dissecção funcional das interações genéticas subjacentes ao processo através do uso de organismos modelos mais simples – inclusive na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Existem dois tipos estabelecidos de envelhecimento modelado por levedura brotante: envelhecimento cronológico (a vida cronológica, CLS) e envelhecimento replicativo (a vida útil replicativa, RLS)¹⁷. O envelhecimento cronológico mede a quantidade de tempo que uma célula pode sobreviver em um estado não-divisória. Isso é análogo ao envelhecimento que é visto em células que passam a maior parte de sua vida em G_0,como os neurônios⁴. Alternativamente, a vida útil replicativa é o número de vezes que uma célula pode se dividir antes da exaustão e é um modelo para tipos de células mitoticamente ativas (por exemplo, o número de células filhas que uma célula pode ter)¹⁸.

O objetivo geral deste método é apresentar um protocolo que permita a dissecção funcional da genética do envelhecimento utilizando S. cerevisiae. Embora tenha havido muitos estudos excelentes realizados por muitos pesquisadores que levaram ao nosso entendimento atual, ainda há muitas oportunidades disponíveis para os pesquisadores contribuirem para o campo do envelhecimento desde o início de sua carreira acadêmica. Apresentamos uma metodologia clara que permitirá aos pesquisadores avançar ainda mais no campo do envelhecimento. Este protocolo foi projetado para ser acessível para todos os pesquisadores, independentemente do estágio em sua carreira acadêmica, fornecendo as ferramentas necessárias para formular e testar suas próprias hipóteses novas. A vantagem de nossa abordagem é que este é um método econômico facilmente acessível a todos os pesquisadores independentemente da instituição – e não requer equipamentos caros e especializados necessários para alguns protocolos¹⁹. Existem várias maneiras diferentes de projetar este tipo de tela, a abordagem descrita neste trabalho é particularmente favorável à triagem de mutantes nulos de genes não essenciais que exibem uma redução severa na vida cronológica em comparação com uma cepa isogênica de levedura selvagem.

Como prova de princípio, clonamos o SIR2, uma deacetylase de liseina relatada como exibindo um CLS estendido e encurtado quando superexpresso. A superexpressão SIR2 foi recentemente encontrada para aumentar o CLS em leveduras vinícolas; no entanto, vários grupos não relataram nenhuma ligação entre a extensão SIR2 e a CLS, deixando seu papel sob caracterizado^20,21,22. Devido a esses relatos conflitantes na literatura, selecionamos este gene para adicionar pesquisas independentes para ajudar a esclarecer o papel do SIR2 no envelhecimento cronológico, se houver. Além disso, aumentar o número de cópias de um homólogo SIR2 estende a vida útil em um sistema modelo de verme de nematoides²³.

A autofagia é um sistema de degradação intracelular para fornecer produtos citolíticos, como proteínas e organelas, ao lyssomsome²⁴. A autofagia está intimamente ligada à longevidade através de seu papel na degradação de proteínas e organelas danificadas para manter a homeostase celular²⁵. A indução da autofagia depende da orquestração da expressão de muitos genes, e a exclusão do gene ATG1 resulta em um CLS anormalmente curto na levedura^{brotante 26}. Códigos ATG1 para uma proteína serina/threonina quinase necessária para a formação de vesículas em autofagia e a via citoplasma-para-vacuole (o equivalente fúngico lysosômico)^27,28. Aqui, apresentamos nosso método para uma tela de número de cópia aumentada, testando o efeito do aumento da cópia SIR2 no CLS em um tipo selvagem e um fundo atg1-nulo. Esse método é particularmente favorável a pesquisadores juniores e grupos de pesquisa em instituições de graduação, muitas das quais atendem comunidades sub-representadas nas ciências e têm recursos limitados.

Protocolo

1. Identifique interações genéticas potenciais para triagem

1. Identifique o histórico genético para caracterização, que resulta em uma vida cronológica anormalmente curta (CLS) em Saccharomyces cerevisiae usando o Banco de Dados do Genoma de Saccharomyces (o SGD, https://www.yeastgenome.org^29,,30), que compila informações fenotípicas conhecidas para este organismo.
   1. Selecione a guia Função nas opções na parte superior da página web.
   2. Selecione o Fenótipo seguido pela seleção de Procurar todos os Fenótipos.
   3. Desde as opções de ontologia do fenótipo de levedura rolem até a subposição de desenvolvimento e selecione a vida cronológica,encontrada sob a subposição lifespan.
   4. Selecione o qualificador para diminuído,o que permite a identificação de genes que exibem um fenótipo que resulta em um fenótipo cronológico reduzido quando excluído. Para este atg1Δ de prova de método foi selecionado, o que resulta em um fenótipo cls de curta duração e é interrompido para autofagia²⁶.
2. Identificar genees de destino para rastrear interações genéticas que possam suprimir o fenótipo, com base em atributos de ontologia relatados ou previstos, do mutante identificado na parte 1.2. Repita a pesquisa de fenótipo encontrada nas etapas 1.1.1-1.1.4 acima, consultando genes que resultam em um CLS mais longo quando superexpresso em um fundo tipo selvagem. O SIR2 foi selecionado com base no fenótipo cls relatado e relatou interações com a autofagia^31,32.

2. Prepare os reagentes

NOTA: A menos que seja especificado de outra forma, autoclave cada solução a 121 °C por 20 minutos para esterilizar antes de ser usada.

1. Mídia líquida YPAD: Adicione 1% extrato de levedura, 2% Peptone, 2% Dextrose (glicose) e 40 mg de adenina (como sulfato de adenina desidratado) por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
2. Mídia líquida LB: Adicione Triptona (10 g), extrato de levedura (5 g) e cloreto de sódio (10 g) por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
3. Prepare 1000x (100 mg/mL) de ampicillin, em água dupla destilada. Misture bem e o filtro se esterilize.
4. Completo sintético – Mídia líquida leucina (SC-LEU): Adicione 1,7 g de base de nitrogênio de levedura c/o aminoácidos, 2% glicose, 1,92 g de mistura de gota SC-LEU, 5 g de sulfato de amônio por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
5. Tampão te: Mix Tris (concentração final de 10 mM), EDTA (concentração final de 1 mM) na solução com água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
6. Prepare 50% PEG 3350 em solução com dupla água destilada. Misture bem com um agitador magnético.
7. Prepare a solução de acetato de lítio de 1 M e 100 mM com água destilada dupla. Misture bem com um agitador magnético.
   NOTA: Para fazer placas de ágar sólidos adicione 20 g de ágar (por litro com água dupla destilada) à mídia preparada em 2,1 e 2,2 acima antes da autoclavagem. Se preparar as placas de ampicillina adicione 1mL da ampicilina à mídia em 2,2 acima depois de ter esfriado para cerca de 60 °C. Despeje em placas estéreis e deixe fixar por 48-72 h antes de usar. Armazene as placas a 4 °C para um armazenamento mais longo.

3. Projete a estratégia de clonagem para clonar SIR2 no vetor pRS315

1. Projete primers PCR para amplificar o gene SIR2 para clonagem no vetor pRS315.
   1. Projete primers manualmente para ter complementaridade nucleotídeo de 21 a 22 para as regiões intergênicas rio acima e rio abaixo do SIR2. Certifique-se de que todo o gene, juntamente com as regiões não traduzidas do mRNA, seja clonado mapeando esses recursos a partir dos conjuntos de dados disponíveis^33,34.
   2. Certifique-se de que o design da cartilha PCR resulte em primers dianteiros e invertidos que tenham uma temperatura de fusão (Tm) acima de 53 °C e abaixo de 60 °C.
      NOTA: Idealmente, ambos os primers devem ter um Tm tão próximo um do outro quanto a sequência permitirá, com um conteúdo GC aproximado entre 40-50%, certificando-se de evitar repetições de dinucleotídeos e equilibrando a distribuição GC e AT durante toda a sequência.
   3. Após o desenho dos primers PCR que permitirão a geração do amplicon para clonagem, adicione os locais de destino de digestão da enzima de restrição (R.E.D.) até a extremidade de 5' de cada primer compatível com o vetor de clonagem de plasmídeos. Neste método, um local de digestão enzimática de restrição hindiII (5'-AAGCTT-3') é adicionado ao primer upstream, forward e um local de digestão da enzima de restrição SacII (5'-CCGCGG-3') é adicionado ao primer downstream, reverso.
      NOTA: O uso dos locais SacII e HindIII exige que o local de corte de consenso para cada endonuclease não esteja presente no gene alvo. Se qualquer enzima atingir alvos dentro do gene alvo, enzimas alternativas de restrição devem ser escolhidas. Há muitos que são compatíveis com a região do polilinker no vetor pRS315.
   4. Por último, adicione uma sequência de quatro nucleotídeos (5'-NNNN-3') ao final de 5' de cada primer para permitir que a enzima de restrição se ligue e digerir o amplicon. Uma vez que os primers tenham sido projetados, tenha os oligonucleotídeos comercialmente sintetizados para usar a clonagem do gene SIR2.
   5. Resuspensão dos primers PCR: Centrifugar os primers PCR usando um microfuge de mesa em velocidade máxima por 4 minutos. Adicione a solução TE para fazer uma concentração de estoque de 100 μM. Armazene a concentração de estoque a -20 °C e dilua 1/10 para uso em aplicações PCR.
      NOTA: Para fazer um estoque de 100 μM, dissolva os primers em um volume de tampão te estéril que é de 10x a quantidade de nmoles no tubo primer, utilizando microlitros de TE. Por exemplo, se o tubo contiver 15,6 nmoles de primer, adicione 156 μL de tampão TE.
2. Isole gDNA de levedura silvestre para amplificação pcr da construção de clonagem SIR2.
   NOTA: Várias opções de alta qualidade estão disponíveis comercialmente para isolar o gDNA de levedura. A utilização de um kit que inclui a digestão da parede celular fúngica com zymolyase resulta em gDNA de melhor qualidade (maior rendimento, menos impurezas). O protocolo abaixo retorna consistentemente alta concentração e pureza. Detalhes de um kit que recomendamos podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
   1. Cresça 5 mL de levedura tipo selvagem por 48-72 h para a fase pós-log em mídia enriquecida, como YPAD. Pelota as células de levedura em >800 x g por 3 min à temperatura ambiente, remova a mídia de crescimento e resuspenda em 120 μL de tampão de digestão zymolyase suplementado com 5 μL de zymolyase (2 unidades enzima/μL). Misture a amostra por vórtice e incubar a 37 °C por 40 min.
   2. Adicione 120 μL de um tampão de lise chaotrópico (por exemplo, cloreto de guanidinium), 250 μL de clorofórmio e vórtice da amostra para 60 s.
   3. Centrifugar a >8.000 x g por 2 min e transferir o supernante para uma coluna de purificação em um tubo de coleta estéril.
   4. Centrifugar a >8.000 x g para 60 s e descartar o fluxo através. O gDNA será vinculado à matriz da coluna.
   5. Lave a coluna duas vezes com 300 μL de um tampão de lavagem à base de etanol, repetindo o passo de centrifugação de cima (3,2,4). Descarte o fluxo após cada giro. Transfira a coluna para um tubo de microfuça de 1,5 mL, adicione 60 μL de tampão de TE e incubar à temperatura ambiente por 60 s. Gire a amostra por 30 anos para elutar o DNA.
      NOTA: Determine a concentração do DNA na amostra (Absorvância a 260nm) e a qualidade (Absorvância 260nm/280nm). Um rendimento típico será de 100-200 ng/ μL de gDNA com taxa de absorvância em 260nm/280nm o mais próximo possível de 1,8.
3. Amplie e isole o vetor pRS315 plasmídeo para clonagem.
   NOTA: Várias opções de alta qualidade estão disponíveis comercialmente para a purificação de vetores plasmídeos. Recomenda-se uma química de coluna à base de sílica para esta etapa. As mudanças observadas abaixo levaram à maior concentração e pureza. Os detalhes são encontrados na Tabela de Materiais.
   1. Cresça 5 mL de cultura de E. coli contendo o vetor pRS315 durante a noite em mídia lb+ ampicillin (80 μg/mL). Pelota a cultura por centrifugação a >8.000 x g por 2 min no RT (15-25 °C).
   2. Suspenda de forma re-suspender células bacterianas pelleted em 250 μL de tampão de TE com RNase A (100 μg/mL) e transferir para um tubo de microcentrifuuge. Certifique-se de que não restam aglomerados de células.
   3. Adicione 250 μL de tampão de lise e misture invertendo o tubo 6-8 vezes. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Não permita que a lise prossiga por mais de 5 min – um pouco menos é preferível.
   4. Adicione 350 μL de tampão de neutralização e misture imediatamente e completamente invertendo o tubo 10 vezes. Centrifugar por 10 min a >8.000 x g.
   5. Transfira cuidadosamente o supernatante de cima para uma coluna de giro de sílica por pipetação. Centrifugar por 30 s e descartar o fluxo.
   6. Adicione 500 μL de um tampão de lavagem de sal alto e centrífuga como na etapa 3.3.5. Descarte o fluxo. Lave a coluna de giro de ligação de DNA adicionando 750 μL de um tampão de lavagem à base de etanol, para remover sais residuais e centrífuga como na etapa 3.3.5.
   7. Descarte o fluxo através e centrífuga por um adicional de 2 min a >8.000 x g para remover o tampão de lavagem residual. Coloque a coluna de giro em um tubo de microcentrifuge limpo e rotulado de 1,5 mL. Ao DNA elute, adicione 20 μL de tampão te ao centro da coluna de giro, incubar por 1 min em temperatura ambiente e centrífuga por 1 min a >8.000 x g.
   8. Use um espectrofotômetro para determinar a quantidade (Absorvância a 260nm) e a qualidade (Absorvância 260 nm/280 nm) de DNA. Um rendimento típico será de 1-2 μg/μL.
4. Amplificação PCR do gene candidato, SIR2, de DNA genômico tipo selvagem
   1. Para produzir um amplicon adequado para clonagem, utilize uma polimerase PCR de alta fidelidade (HF) para evitar que a geração não intencional de mutações na sequência seja amplificada.
      NOTA: Muitas opções diferentes de PCR de alta fidelidade estão disponíveis comercialmente. Para facilitar a otimização das condições de reação do PCR, use uma combinação de dois buffers: uma que seja um buffer HF padrão e uma otimizada para alta GC e amplicons complexos. Os detalhes podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
   2. O PCR amplifica a construção SIR2 para clonagem conforme descrito na Tabela 1.
      NOTA: Para maximizar o sucesso nas etapas de clonagem, vários 50 μL idênticos podem ser configuradas e concentradas por um passo de limpeza da coluna PCR. Certifique-se de configurar uma reação de controle de modelo gDNA (controle negativo).
   3. Configure as condições de ciclismo PCR conforme descrito na Tabela 2.
      NOTA: Diferentes pares de primer variam em sua temperatura de ressarção e diferentes polímeros funcionam em velocidades diferentes. Certifique-se de otimizar as condições de amplificação com base na enzima selecionada e nas especificações da combinação de primer conforme projetado.
   4. Verifique o sucesso da reação do PCR visualizando a reação pcr, que produziria aproximadamente 2,5 kb de fragmento de DNA, em um gel tae-agarose de 1,0% (com brometo de etídio de 0,5 μg/mL para visualização).
5. Digestão e ligadura do gene candidato, SIR2,no vetor pRS315 plasmid.
   1. Realizar a digestão de restrição do vetor e da inserção: 625 ng DNA (seja o vetor ou inserção), água q.s. para trazer o volume de reação final para 50 μL, 5 μL de tampão, 1 μL SacII e 1 μL HindIII. Incubar as digestões de restrição a 37 °C por 3h, seguido de 80 °C por 20 minutos para aquecer inativar as enzimas. Os digestos podem ser armazenados a 4 °C antes de prosseguir para a próxima etapa.
   2. Configure uma reação de ligadura de 15 μL para criar o plasmídeo desejado: 6 μL de água estéril, 2 μL de vetor digerido de 2 μL (50 ng DNA), inserção digerida de 4 μL (100 ng DNA), tampão de reação T4 2 μL e 1 μL de Ligase de DNA T4. Incubar as reações de ligadura durante a noite a 16 °C, seguido de 80 °C por 20 minutos para aquecer a enzima.
      NOTA: Configure um controle sem inserção, substituindo um adicional de 4 μL de água estéril (10 μL total) em vez da inserção.
   3. Transforme as reações de ligadura em E. coli.
      NOTA: Existem muitas opções disponíveis para células competentes que estão disponíveis. Este protocolo utiliza células quimicamente competentes que são armazenadas a -80 °C antes do uso.
      1. Descongele um tubo de 50 μL de células E. coli congeladas e competentes no gelo até descongelar e adicionar imediatamente 15 μL da reação de ligadura. Aperte o tubo várias vezes. Devolva imediatamente os tubos ao gelo e incubar por 30 minutos.
      2. Choque térmico das células por 20 s em um banho de água exatamente a 42 °C, e imediatamente retornar os tubos ao gelo para uma incubação de 2 minutos. Adicione 450 μL de mídia de recuperação de temperatura ambiente (por exemplo, SOC ou LB) a cada reação de transformação e incubar por 60 min a 37 °C com agitação.
      3. Para cada reação de transformação, faça uma diluição de 1:10 das células. Utilizando técnica estéril, placa 150 μL das células não diluídas e as diluições de 1:10 em placas de ampicillina LB + (80 μg/mL)³⁵. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
6. Screen potenciais transformadores para o vetor de sobreexpressão.
   1. Usando técnica estéril, inocular os potenciais transformadores que cresceram em 5 mL LB + (80 μg/mL) ampicillin e crescer durante a noite. Seguindo o procedimento descrito na seção 3.3.1-3.3.7 acima, isole os plasmídeos de todos os potenciais transformadores e tela para uma integração bem sucedida da inserção por digestão de restrição seguida de eletroforese de gel em um gel tae-agarose de 1,0% (com brometo de ethidium de 0,5 μg/mL para visualização).

4. Transforme o vetor em atg1Δ e cepas de levedura tipo selvagem

NOTA: Isto é realizado utilizando um protocolo modificado de transformação de acetato de lítio³⁶.

1. Pelota 15 mL de tipo selvagem e células de levedura atg1-nulas cultivadas durante a noite em mídia YPAD para fase inicial a mid-log (O.D. 600nm = 0,4-0,9) de crescimento por 3 min a > 800 x g à temperatura ambiente.
2. Decante o supernascer, suspenda a pelota celular em 1 mL de ddH₂O estéril e transfira o conteúdo para um tubo de microfuça de 1,7 mL. Pelota as células por 3 min a > 800 x g em temperatura ambiente.
3. Remova o supernasce e suspenda as células em 250 μL de acetato de lítio de 100 mM com tubulação suave. Divida as células em tubos de microfuge separados para cada uma das transformações que você realizará. Use 50 μL da mistura de acetato celular-lítio por transformação.
4. Criar uma mistura de transformação. Para cada uma das transformações somam-se: 240 μL de 50% PEG3350, 36 μL de acetato de lítio de 1,0 M e 5 μL de DNA de esperma de salmão (ou outro portador), fervido por 5 min e no gelo.
   NOTA: PEG é muito viscoso. Pipeta e meça cuidadosamente. Misture por pipetação após a adição de cada componente antes de seguir em frente.
5. Adicione 5 μL do plasmídeo apropriado para cada transformação realizada. Vórtice cada tubo para misturar bem. Incubar as amostras a 30 °C por 45 min. Amostras de choque térmico a 42 °C por 10 min.
6. Células de pelotas por 3 min a > 800 x g à temperatura ambiente, removam cuidadosamente a mistura de transformação e suspendam cuidadosamente amostras em 300 μL de células estéreis ddH₂O. Repetindo o giro acima, remova cuidadosamente a água e suspenda suas amostras em 200 μL de ddH₂O estéril.
7. Configure 1/10 e 1/100 diluições para cada cepa transformada de levedura.
8. Utilizando placa técnica estéril 150 μL de cada amostra em placas sc-leucina para selecionar para os plasmídeos. Espalhe as células uniformemente e uniformemente e deixe a placa secar antes de inverter e incubar a 30 °C para crescer por 48-72 h.
   NOTA: Uma vez gerada a cepa apropriada, ela poderá ser armazenada a longo prazo em 25% de glicerol a -80 °C. A quantificação do número de cópia presente pode ser determinada por diversas metodologias, incluindo qPCR, RNA-FISH ou outra medida apropriada^37,38.

5. Determine a vida útil cronológica para testar a supressão do fenótipo cls encurtado

1. Teste o efeito da superexpressão do supressor putativo na CLS na levedura de curta duração, mutante atg1Δ, determinando o número de unidades formadoras de colônias (UFC) que permanecem em função do tempo³⁹.
   NOTA: É necessário configurar esta parte do experimento com os controles apropriados. Um experimento típico irá comparar uma variedade de levedura tipo selvagem (WT) com o vetor vazio, WT com o vetor supressor, o mutante de exclusão com o vetor vazio, e o mutante de exclusão com o vetor supressor.
   1. Pegue uma única colônia da cepa para estudar e inocula-a na mídia SC-LEU. Cresça a cultura a 30 °C por 72 h, com agitação.
   2. Utilizando um hemócito, determine a concentração de células presentes na cultura⁴⁰.
   3. Diluir uma alíquota da cultura, de modo que o resultado seja um número uniforme de células em um volume de 150 μL de água estéril. Emplaque a cultura usando técnica estéril em placas SC-LEU e cresça a 30 °C por 72 h. Essas placas são o terceiro ponto de tempo do dia e o experimento será normalizado até este ponto de tempo como 100% de viabilidade³⁹.
      NOTA: O número de células deve ser de 200 a 500, suficientemente grande para a análise e um número gerenciável para contagem. Neste estudo, utilizamos 200 células para nossa quantidade de revestimento.
   4. Continue incubando as culturas de levedura a 30 °C, tomando alíquotas regulares e chapeamento como descrito em 5.1.3. Continue esse processo até que as cepas não sejam mais viáveis, depois compile e analise os resultados.
      NOTA: A lista completa de cepas utilizadas neste estudo está encontrada na Tabela 3.

Resultados

Como há relatos conflitantes sobre o papel do SIR2 durante o envelhecimento, escolhemos este gene para estudo como um potencial supressor do fenótipo CLS do mutante atg1Δ ²⁶. O papel do SIR2 é um tanto controverso, com relatórios conflitantes sobre seu papel na extensão da CLS, porém tem sido claramente ligado ao aumento da CLS em pelo menos um fundo de levedura, com um papel tanto na autofagia quanto na mitofagia^22,,

Discussão

Desvendar a genética do envelhecimento é um desafio difícil, com muitas oportunidades para estudos mais aprofundado que podem potencialmente produzir insights significativos sobre as interações complexas que existem. Existem muitos métodos que permitem a rápida geração de mutantes de perda de função para o estudo de cepas nulas de levedura^45,46. Este método apresenta uma abordagem simples para identificar e clonar genes no vetor pRS315 para estudos su...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S