检测免疫球蛋白A肾病小鼠肾脏中的microRNA表达

摘要

microRNA参与IgA肾病的发病机制。我们已经开发出一种可靠的方法来检测IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的microRNA表达水平。这种新方法将有助于检查miRNA是否参与IgA肾病。

摘要

免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA沉积异常，导致终末期肾衰竭。近年来，在IgA肾病的发病机制中报道了microRNA（miRNA）的参与。然而，没有使用小动物模型分析IgA肾病中miRNA的既定方法。因此，我们开发了一种可靠的方法来分析IgA小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的miRNA。该协议的目标是检测与对照小鼠肾脏中的水平相比，HIGA小鼠肾脏中miRNA的表达水平改变。简而言之，该方法包括四个步骤:1）从HIGA小鼠获得肾脏样本;2）从肾脏样本中纯化总RNA;3）从总RNA合成互补DNA;4）miRNA的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。使用这种方法，我们成功地检测了HIGA小鼠肾脏中几种miRNA（miR-155-5p，miR-146a-5p和miR-21-5p）的表达水平。这种新方法可以应用于其他分析IgA肾病中miRNA的研究。

引言

免疫球蛋白A（IgA）肾病是一种原发性肾小球肾炎，其特征是IgA在肾小球系膜区域^1,2中的异常沉积。它是最常见的原发性肾小球肾炎，在20%-40%的患者中导致终末期肾衰竭²。病因尚不清楚，但与持续性黏膜感染有关^1,3。皮质类固醇、免疫抑制剂和肾素-血管紧张素系统抑制剂已被提出作为治疗方法^1,3，但尚未^{完全确立3}。因此，需要进一步研究明确治疗IgA肾病的病因和治疗方法。

microRNA（miRNA）是小的非编码RNA，在调节基因表达中起重要作用^4,5。据报道，miRNA参与各种疾病的发病机制，有些已被确定为疾病生物标志物和治疗剂^4,5。近年来，miRNA与IgA肾病发病机制之间的关联也有报道^2,6,7。例如，miR-148b被证明与IgA肾病^2,6,7患者的IgA结构异常有关^，而miR-148b和let-7b被记录为检测IgA肾病^的新型生物标志物7。尽管了解miRNA对IgA肾病的影响可能有助于进一步阐明病因和治疗2，但尚未建立使用小动物模型分析IgA肾病中miRNA的标准方法²。

我们在此开发了一种简单可靠的方法来测量IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中的miRNA表达水平。HIGA小鼠是一种特征性的ddY菌株，显示血清IgA水平特别高，肾小球8,9,10,11中IgA的异常沉积。因此，HIGA小鼠可用作IgA肾病小鼠模型8,9,10,11。我们的方法包括四个主要步骤:首先，通过手术从HIGA小鼠获得肾脏样本;其次，使用基于硅胶膜的离心柱均质化样品并纯化总RNA;第三，使用逆转录从总RNA合成互补DNA（cDNA）;第四，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平。这种方法的基本原理和结果的可靠性基于以前的报告^12,13。我们表明，这是一种准确测量IgA肾病小鼠模型中miRNA表达水平的有用技术，并且可用于促进未来对IgA肾病中miRNA的研究。

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研究方案

动物实验经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并符合《吉智医科大学实验动物指南》中的实验动物使用和护理指南。

1. 从HIGA小鼠中获取肾脏样本

注意:HIGA小鼠在8,9,10,11岁25周后显示出稳定的IgA肾病表型。应选择Balb/c小鼠作为对照组⁸、⁹、^10、11。获得25周龄雌性HIGA小鼠（n = 10）和25周龄雌性Balb / c小鼠（n = 10）。有必要提前确定实验所需的小鼠数量。对于10只HIGA小鼠和10只Balb / c小鼠的样本量，此步骤需要约7-8小时。

1. 准备这些物品:HIGA小鼠（25周龄，雌性），Balb / c小鼠（25周龄，雌性），吸入麻醉器，异氟醚，软木板，针，磷酸盐缓冲盐水（PBS），注射器，针头，手术剪刀和镊子。
2. 使用4%-5%的异氟醚和吸入麻醉装置麻醉HIGA小鼠，并使用销钉将其安装在软木板上的背侧位置。将异氟醚的浓度调节至2%-3%作为诱导麻醉后的维持剂量。
   注意:麻醉深度保持在完全消除与侵入性手术相关的疼痛的水平。特别是，在切除胸部等组织时，异氟醚浓度应调节至4-5%。脱毛和眼膏不是必需的。如果可以快速执行该过程，则无需将鼠标安装在加热垫上。
3. 用手术剪刀和镊子在小鼠腹壁上做一个3-4厘米的中线切口，并仔细识别肾脏的两侧。
4. 用手术剪刀和镊子切开肋骨和横膈膜，露出心脏。切开右心房后，将PBS注射到左心室，直到肾脏颜色变为淡黄色（此过程意味着小鼠的整个身体都注入了PBS。
5. 切开肾动脉、肾静脉和输尿管，切除肾脏。将肾脏分成30毫克片，用于下一步。
   注意:IgA肾病的病理主要涉及肾皮质（肾脏外部）中的肾小球。虽然很难在肉眼下完全区分皮层和髓质，但希望主要收集肾脏的外部。这些样品可在–80°C下储存数月。

2. 纯化肾脏样本中的总RNA

注意:在此步骤中，市售miRNA分离试剂盒用于提取总RNA。此外，还使用生物聚合物粉碎离心柱。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。miRNA 分离试剂盒包含基于硅胶膜的离心柱、基于苯酚/胍的裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）和无核酸酶的水。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约3小时。

1. 准备以下物品:1.5 或 2.0 mL 收集管、100% 乙醇、氯仿、硅均质器、微量移液器、移液器吸头、离心机、生物聚合物粉碎离心柱、硅胶膜离心柱、苯酚/胍基裂解试剂、胍/乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 1）、乙醇洗涤缓冲液（洗涤缓冲液 2）和无核酸酶水。
2. 在室温下，使用硅匀浆器和 700 μL 苯酚/胍基裂解试剂匀浆 30 mg 肾脏样品。
   注意:样品中的miRNA在暴露于基于苯酚/胍的裂解试剂之前是脆弱的，因此应立即执行这些步骤。
3. 将裂解物转移到生物聚合物粉碎离心柱中，并在室温下以15,000× g 离心2分钟。
4. 向滤液中加入 140 μL 氯仿并剧烈混合 15 秒。放置2-3分钟，然后在4°C下以12,000 ×g 离心15分钟。
5. 轻轻地将透明上清液不接触中间层转移到新的收集管中，并加入测定体积（见下文）的100%乙醇。涡旋5秒。
   注意:需要100%乙醇，为获得的上清液体积的1.5倍。
6. 将样品（上限 700 μL）转移到基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心样品 15 秒。离心后弃去滤液。
7. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液 1，并在室温下以 8,000 x g 离心柱 15 秒。离心后弃去滤液。
8. 将 500 μL 洗涤缓冲液 2 加入基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
9. 将 500 μL 洗涤缓冲液 2 加入基于硅胶膜的离心柱中，并在室温下以 8,000 x g 离心 15 秒。离心后弃去滤液。
10. 再次离心基于硅胶膜的离心柱，而不添加任何东西以除去任何额外的乙醇，在室温下以15,000× g 离心1分钟。离心后扔掉滤液。
11. 将连接到离心柱的管更换为新的收集管。
12. 向基于硅胶膜的离心柱中加入 30 μL 无核酸酶水，并在室温下以 8,000 x g 离心 1 分钟。
    注意:所得的 30 μL 溶液含有高浓度的总 RNA。该样品可在–80°C下储存数月。

3. 从总RNA合成cDNA

注意:在此步骤中，使用市售的逆转录试剂盒。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。该试剂盒包含核酸混合物、逆转录酶混合物和缓冲液。此过程必须在冰上进行，以防止反应进展。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约3小时。

1. 准备以下物品:1.5 mL 收集管、八孔试管、微量移液器、移液器吸头、分光光度计、无核酸酶水、冰、核酸混合物、逆转录酶混合物、缓冲液和热循环仪。
2. 使用分光光度计测量总RNA的浓度。然后，计算所需体积的无核酸酶水，使 12 μL 含有 1 μg 总 RNA。
3. 制备含有以下内容的预混液:2.0 μL 核酸混合物、2.0 μL 逆转录酶混合物和 4.0 μL 缓冲液，每个样品总共 8.0 μL。
4. 向八孔试管的每个孔中加入 8 μL 预混液。
5. 稀释以3.2计算的无核酸酶水体积中的总RNA。然后，向每个八孔试管孔中加入 12 μL 总 RNA 溶液（含有 1 μg 总 RNA）。
6. 使用热循环仪将样品在37°C的8孔试管中孵育60分钟。然后，使用热循环仪在95°C孵育5分钟。
   注意:孵育后的溶液含有高浓度的cDNA。
7. 将该溶液转移到 1.5 mL 管中，加入 200 μL 无核酸酶水。
   注意:所得的 200 μL 溶液可用作 qRT-PCR 模板 cDNA。该样品可在–80°C下储存约1年。

4. miRNA 的 qRT-PCR

注意:在此步骤中，使用市售PCR试剂盒。有关更多详细信息，请参阅 材料表 。该试剂盒包含PCR混合物、通用引物和无核酸酶水。样品应一式两份制备，并在每种情况下考虑结果的准确性。miRNA的表达水平通过ΔΔCT方法定量。对于10只HIGA小鼠和10只对照小鼠的样本量，此步骤需要约4小时。

1. 准备以下物品:1.5 mL 收集管、96 孔反应板、用于 96 孔反应板的粘合膜、微量移液器、移液器吸头、PCR 混合物、通用引物、无核酸酶水、miRNA 特异性引物和实时荧光定量 PCR 仪器。
2. 制备含有以下内容的预混液:每孔 12.5 μL PCR 混合物、2.5 μL 通用引物、1.25 μL 5 μM miRNA 特异性引物和 6.25 μL 无核酸酶水。
   注意:在该测定中，使用了对miRNA[RNA，U6小核2（RNU6-2），miR-155-5p，miR-146a-5p和miR-21-5p]特异性引物。RNU6-2用作内源性对照¹⁴。
3. 向 96 孔反应板的每个孔中加入 22.5 μL 预混液。
4. 将步骤 3.7 中制备的 2.5 μL cDNA 加入 96 孔板的各个孔中。
5. 用粘附膜覆盖96孔反应板，然后以1,000× g 离心30秒。
6. 运行实时荧光定量 PCR 仪器。对PCR仪器进行编程如下:在95°C下初始活化15分钟，然后在94°C下变性40个循环15秒，在55°C下退火30秒，并在70°C下延伸30秒。
7. 使用 ΔΔCT 方法定量基因表达。相对表达水平确定为 2^–ΔΔCT。
   注意:应考虑从结果中排除异常的PCR扩增曲线。

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结果

我们研究了miRNA在HIGA小鼠肾脏中的表达水平（n = 10）。该结果完全基于所描述的协议获得。选择Balb / c小鼠的肾脏作为对照（n = 10）。在两组中，均选择25周龄。供应商仅提供雌性HIGA小鼠。三种miRNA（miR-155-5p、miR-146a-5p和miR-21-5p）的表达水平;图1）被检测到，之前报道与 IgA 肾病有关^15,16。采用t检验比较两组相对miRNA表达水平，P<0.05?...

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讨论

我们能够使用这种新方法测量IgA肾病小鼠模型（HIGA小鼠）肾脏中miRNA的表达水平。IgA肾病是一种无法解释的疾病，需要进一步研究以阐明其病因和治疗靶点^1,3。然而，获取人类肾脏样本是高度侵入性的。这种新技术的优点在于它允许使用小动物研究IgA肾病，并且应该有助于未来对IgA肾病和miRNA的研究。在未来的研究中，该方法可以应用于治疗IgA肾病的新...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer