Обнаружение экспрессии микроРНК в почках мышей-нефропатических иммуноглобулинов А

Резюме

микроРНК участвуют в патогенезе IgA-нефропатии. Мы разработали надежный метод определения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели IgA-нефропатии (мыши HIGA). Этот новый метод облегчит проверку участия микроРНК в IgA-нефропатии.

Аннотация

Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) - это тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA, приводящим к терминальной стадии почечной недостаточности. В последние годы сообщалось об участии микроРНК (миРНК) в патогенезе IgA-нефропатии. Однако не существует установленного метода профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных. Поэтому мы разработали надежный метод анализа микроРНК в почках мышиной модели IgA (мышь HIGA). Целью этого протокола является обнаружение измененных уровней экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA по сравнению с уровнями в почках контрольных мышей. Вкратце, этот метод состоит из четырех этапов: 1) получение образцов почек от мышей HIGA; 2) очистка общей РНК из образцов почек; 3) синтез комплементарной ДНК из общей РНК; и 4) количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR) микроРНК. Используя этот метод, мы успешно определили уровни экспрессии нескольких микроРНК (miR-155-5p, miR-146a-5p и miR-21-5p) в почках мышей HIGA. Этот новый метод может быть применен к другим исследованиям, профилирующим микроРНК при IgA-нефропатии.

Введение

Иммуноглобулиновая нефропатия А (IgA) представляет собой тип первичного гломерулонефрита, характеризующийся аномальным отложением IgA в почечной клубочковой мезангиальной области ^1,2. Он является наиболее распространенным из первичных гломерулонефритов и приводит к терминальной стадии почечной недостаточности у 20–40% пациентов². Причина до сих пор неизвестна, но была зафиксирована персистирующая инфекция слизистой оболочки ^1,3. Кортикостероиды, иммунодепрессанты и ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы были предложены в качестве терапевтических методов^1,3, но не были полностью установлены ³. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для уточнения этиологии и терапевтических методов лечения IgA-нефропатии.

микроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов ^4,5. Сообщается, что микроРНК участвуют в патогенезе различных заболеваний, и некоторые из них были идентифицированы как биомаркеры заболеваний и терапевтические агенты ^4,5. В последние годы также сообщалось о связи между микроРНК и патогенезом IgA-нефропатии ^2,6,7. Например, было показано, что miR-148b участвует в структурных аномалиях IgA у пациентов с IgA-нефропатией ^2,6,7, в то время как miR-148b и let-7b были задокументированы как новые биомаркеры для выявления IgA-нефропатии⁷. Хотя понимание влияния микроРНК на IgA-нефропатию может помочь в дальнейшем выяснении этиологии и лечения 2, стандартные методы профилирования микроРНК при IgA-нефропатии с использованием моделей мелких животных еще не установлены².

Здесь мы разработали простой и надежный метод измерения уровней экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA). Мышь HIGA представляет собой характерный штамм ddY, демонстрирующий особенно высокий уровень сывороточного IgA и аномальное отложение IgA в почечных клубочках 8,9,10,11. Таким образом, мышей HIGA можно использовать в качестве мышиной модели нефропатии IgA 8,9,10,11. Наш метод состоит из четырех основных этапов: во-первых, хирургическое получение образцов почек от мышей HIGA; во-вторых, гомогенизация образцов и очистка общей РНК с использованием спиновой колонки на основе кремнеземной мембраны; в-третьих, синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскрипции; и, в-четвертых, определение уровней экспрессии микроРНК с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Обоснование этого метода и достоверность результатов основаны на предыдущих отчетах^12,13. Мы показываем, что это полезный метод для точного измерения уровней экспрессии микроРНК в мышиной модели нефропатии IgA, и что он может быть использован для облегчения будущих исследований микроРНК при нефропатии IgA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Цзичи и соответствуют рекомендациям по использованию и уходу за экспериментальными животными из Руководства Медицинского университета Джичи для лабораторных животных.

1. Получение образцов почек от мышей HIGA

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши HIGA демонстрируют стабильный фенотип IgA-нефропатии через 25 недель в возрасте 8,9,10,11. Мышей Balb/c следует выбирать в качестве контрольной группы 8,9,10,11. Были получены 25-недельные самки мышей HIGA (n = 10) и 25-недельные самки мышей Balb/c (n = 10). Необходимо заранее определить необходимое для экспериментов количество мышей. На этом этапе требуется около 7–8 часов для выборки из 10 мышей HIGA и 10 мышей Balb/c.

1. Подготовьте следующие предметы: мыши HIGA (25-недельный самка), мыши Balb/c (25-недельный, самка), аппарат для ингаляционной анестезии, изофлуран, пробковый лист, штифт, фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), шприцы для инъекций, иглы, хирургические ножницы и щипцы.
2. Обезболите мышь HIGA, используя 4–5% изофлурана, с помощью аппарата ингаляционной анестезии и установите ее в дорсальном положении на пробковый лист с помощью штифтов. Отрегулируйте концентрацию изофлурана до 2–3% в качестве поддерживающей дозы после индукции анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина анестезии поддерживается на уровне, при котором полностью устраняется боль, связанная с инвазивной процедурой. В частности, концентрация изофлурана должна быть скорректирована до 4-5% при иссечении таких тканей, как грудная клетка. Эпиляция и глазная мазь не обязательны. Нет необходимости крепить мышь на грелку, если процедуру можно выполнить быстро.
3. Сделайте разрез брюшной стенки мыши по средней линии 3–4 см хирургическими ножницами и щипцами и тщательно определите обе стороны почки.
4. Надрежьте ребра и диафрагму хирургическими ножницами и щипцами, чтобы обнажить сердце. После разреза правого предсердия вводите PBS в левый желудочек до тех пор, пока цвет почек не изменится на бледно-желтый (эта процедура означает, что все тело мыши перфузируется PBS).
5. Перережьте почечную артерию, почечную вену и мочеточник и удалите почку. Разделите почку на кусочки по 30 мг для использования на следующем этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Патология IgA-нефропатии в основном затрагивает клубочки в коре почек (наружная часть почки). Хотя макроскопически и полностью различить кору и мозговое вещество сложно, желательно в основном собирать наружную часть почки. Эти образцы могут храниться при температуре –80 °C в течение нескольких месяцев.

2. Очистка общей РНК из образцов почек

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе коммерчески доступный набор для выделения микроРНК используется для экстракции общей РНК. Кроме того, используется спиновая колонна для измельчения биополимеров. Дополнительные сведения см. в таблице материалов . Набор для выделения микроРНК содержит спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны, лизирующие реагенты на основе фенола / гуанидина, буфер для промывки гуанидина / этанола (буфер для промывки 1), буфер для промывки этанола (буфер для стирки 2) и воду, не содержащую нуклеаз. Этот этап требует около 3 часов для размера выборки из 10 мышей HIGA и 10 контрольных мышей.

1. Подготовьте следующие предметы: пробирки для сбора 1,5 или 2,0 мл, 100% этанол, хлороформ, гомогенизатор кремния, микропипетки, наконечники пипеток, центрифугу, спиновую колонну для измельчения биополимеров, спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны, лизирующие реагенты на основе фенола/гуанидина, буфер для промывки гуанидином/этанолом (буфер для промывки 1), буфер для промывки этанолом (буфер для промывки 2) и воду, не содержащую нуклеаз.
2. Гомогенизируют образцы почек 30 мг с использованием гомогенизатора кремния и 700 мкл лизирующего реагента на основе фенола / гуанидина при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: МикроРНК в образце уязвимы до тех пор, пока они не будут подвергнуты воздействию лизирующего реагента на основе фенола / гуанидина, поэтому эти шаги следует выполнять быстро.
3. Перенесите лизат в спиновую колонну для измельчения биополимеров и центрифугируйте ее при 15 000 x g в течение 2 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте в фильтрат 140 мкл хлороформа и энергично перемешивайте в течение 15 с. Оставьте на 2–3 мин, затем центрифугу при 12 000 x g при 4 °C в течение 15 мин.
5. Аккуратно перенесите прозрачную надосадочную жидкость, не касаясь среднего слоя, в новую сборную пробирку и добавьте определенный объем (см. Ниже) 100% этанола. Вихрь за 5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: требуется 100% этанол в 1,5 раза больше объема полученной надосадочной жидкости.
6. Перенесите образец (верхний предел 700 мкл) в спиновую колонку на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте образец при комнатной температуре в течение 15 с при 8000 x g. Выбросьте фильтрат после центрифугирования.
7. Добавьте 700 мкл промывочного буфера 1 в спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте колонну при комнатной температуре в течение 15 с при 8000 x g. Выбросьте фильтрат после центрифугирования.
8. Добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 в спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте ее при комнатной температуре в течение 15 с при 8 000 x g. Выбросьте фильтрат после центрифугирования.
9. Добавьте 500 мкл промывочного буфера 2 в спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте ее при комнатной температуре в течение 15 с при 8 000 x g. Выбросьте фильтрат после центрифугирования.
10. Снова центрифугируйте спиновую колонну на основе кварцевой мембраны, не добавляя ничего, чтобы удалить дополнительный этанол, при 15 000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре. Выбросьте фильтрат после центрифугирования.
11. Замените трубку, прикрепленную к спиновой колонне, на новую сборную трубку.
12. Добавьте 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в спиновую колонну на основе кремнеземной мембраны и центрифугируйте ее при 8000 x g в течение 1 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный раствор объемом 30 мкл содержит высокую концентрацию общей РНК. Этот образец можно хранить при температуре –80 °C в течение нескольких месяцев.

3. Синтез кДНК из общей РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе используется коммерчески доступный набор обратной транскрипции. Дополнительные сведения см. в таблице материалов . Этот набор содержит смесь нуклеиновых кислот, смесь обратной транскриптазы и буфер. Эту процедуру необходимо выполнять на льду, чтобы предотвратить развитие реакции. Этот этап требует около 3 часов для размера выборки из 10 мышей HIGA и 10 контрольных мышей.

1. Подготовьте следующие предметы: пробирки для сбора 1.5 мл, пробирки с восемью лунками, микропипетки, наконечники для пипеток, спектрофотометр, воду без нуклеазы, лед, смесь нуклеиновых кислот, смесь обратной транскриптазы, буфер и термоциклер.
2. Измерьте концентрацию общей РНК с помощью спектрофотометра. Затем рассчитайте необходимый объем безнуклеазной воды так, чтобы в 12 мкл содержался 1 мкг общей РНК.
3. Приготовьте мастер-смесь со следующим содержимым: 2,0 мкл смеси нуклеиновых кислот, 2,0 мкл смеси обратной транскриптазы и 4,0 мкл буфера, что в сумме составляет 8,0 мкл на образец.
4. Добавьте 8 мкл основной смеси в каждую лунку восьмилуночных полосовых трубок.
5. Разбавьте общую РНК в объеме безнуклеазной воды, рассчитанной на 3.2. Затем добавьте 12 мкл общего раствора РНК (содержащего 1 мкг общей РНК) в каждую лунку восьмилуночных полосковых пробирок.
6. Инкубируйте образец в 8-луночных пробирках при 37 °C в течение 60 минут с помощью термоциклера. Затем инкубируйте при 95 °C в течение 5 минут с помощью термоциклера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор после инкубации содержит высокую концентрацию кДНК.
7. Перенесите этот раствор в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные 200 мкл раствора можно использовать для qRT-ПЦР в качестве матрицы кДНК. Этот образец можно хранить при температуре –80 °C около 1 года.

4. qRT-ПЦР микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе используется коммерчески доступный набор для ПЦР. Дополнительные сведения см. в таблице материалов . Этот набор содержит смесь для ПЦР, универсальный праймер и воду, не содержащую нуклеаз. Образцы должны быть подготовлены в двух экземплярах, и в каждом конкретном случае следует учитывать точность результатов. Уровни экспрессии микроРНК количественно определяют методом ΔΔCT. Этот этап требует около 4 часов для выборки из 10 мышей HIGA и 10 контрольных мышей.

1. Подготовьте следующие предметы: пробирку для сбора 1,5 мл, реакционную пластину на 96 лунок, клейкую пленку для реакционной пластины на 96 лунок, микропипетки, наконечники для пипеток, смесь для ПЦР, универсальный праймер, воду без нуклеаз, праймеры, специфичные для микроРНК, и прибор для ПЦР в реальном времени.
2. Приготовьте мастер-смесь со следующим содержанием: 12,5 мкл смеси для ПЦР, 2,5 мкл универсального праймера, 1,25 мкл 5 мкМ-специфического праймера для микроРНК и 6,25 мкл безнуклеазной воды для каждой лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе использовались праймеры, специфичные для микроРНК [РНК, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p и miR-21-5p]. RNU6-2 использовали в качестве эндогенного контроля¹⁴.
3. Добавьте 22,5 мкл мастер-смеси в каждую лунку 96-луночной реакционной пластины.
4. Добавьте 2,5 мкл кДНК, полученной на этапе 3,7, в индивидуальную лунку 96-луночного планшета.
5. Накройте 96-луночную реакционную пластину адгезионной пленкой, затем центрифугу при 1,000 x g в течение 30 с.
6. Запустите прибор ПЦР в реальном времени. Запрограммируйте ПЦР-прибор следующим образом: начальная активация при 95 °C в течение 15 мин, затем 40 циклов денатурации при 94 °C в течение 15 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и расширение при 70 °C в течение 30 с.
7. Количественная оценка экспрессии генов с помощью метода ΔΔCT. Относительные уровни экспрессии определяются как 2^–ΔΔCT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аномальные кривые амплификации ПЦР следует рассматривать для исключения из результатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы исследовали уровни экспрессии микроРНК в почках мышей HIGA (n=10). Этот результат был получен полностью на основе описанного протокола. В качестве контрольной были выбраны почки мышей Balb/c (n=10). В обеих группах были отобраны люди в возрасте 25 недель. У поставщика были доступны только самки ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы смогли измерить уровни экспрессии микроРНК в почках мышиной модели нефропатии IgA (мыши HIGA) с помощью этого нового метода. IgA-нефропатия является необъяснимым заболеванием, которое нуждается в дальнейших исследованиях для уточнения его этиологии и терапевтических целей ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer