Détection de l’expression de microARN dans les reins de souris néphropathiques immunoglobulines A

Résumé

Les microARN sont impliqués dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Nous avons développé une méthode fiable pour détecter les niveaux d’expression des microARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). Cette nouvelle méthode facilitera la vérification de l’implication des miARN dans la néphropathie à IgA.

Résumé

La néphropathie à immunoglobuline A (IgA) est un type de glomérulonéphrite primaire caractérisée par le dépôt anormal d’IgA, conduisant à l’insuffisance rénale terminale. Ces dernières années, l’implication des microARN (miARN) a été rapportée dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Cependant, il n’existe pas de méthode établie pour profiler les miARN dans la néphropathie à IgA à l’aide de modèles de petits animaux. Par conséquent, nous avons développé une méthode fiable pour analyser les miARN dans le rein d’un modèle murin IgA (souris HIGA). L’objectif de ce protocole est de détecter les niveaux d’expression altérés des miARN dans les reins des souris HIGA par rapport aux niveaux dans les reins des souris témoins. En bref, cette méthode comprend quatre étapes: 1) l’obtention d’échantillons de reins de souris HIGA; 2) purifier l’ARN total des échantillons de reins; 3) synthétiser l’ADN complémentaire à partir de l’ARN total; et 4) la réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) des miARN. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à détecter les niveaux d’expression de plusieurs miARN (miR-155-5p, miR-146a-5p et miR-21-5p) dans les reins de souris HIGA. Cette nouvelle méthode peut être appliquée à d’autres études de profilage des miARN dans la néphropathie à IgA.

Introduction

La néphropathie à immunoglobuline A (IgA) est un type de glomérulonéphrite primaire caractérisée par le dépôt anormal d’IgA dans la région mésangiale glomérulaire^{rénale 1,2}. C’est la glomérulonéphrite primaire la plus fréquente et conduit à l’insuffisance rénale terminale chez 20 à 40 % des patients². La cause est encore inconnue mais une infection muqueuse persistante a été impliquée ^1,3. Des corticostéroïdes, des immunosuppresseurs et des inhibiteurs du système rénine-angiotensine ont été proposés comme méthodes thérapeutiques^1,3, mais n’ont pas été complètement établis³. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour clarifier l’étiologie et les méthodes thérapeutiques de traitement de la néphropathie à IgA.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui jouent un rôle important dans la régulation de l’expression génique ^4,5. Les miARN seraient impliqués dans la pathogenèse de diverses maladies, et certains ont été identifiés comme biomarqueurs de maladies et agents thérapeutiques ^4,5. Au cours des dernières années, une association entre les miARN et la pathogenèse de la néphropathie à IgA a également été rapportée ^2,6,7. Par exemple, miR-148b s’est avéré impliqué dans les anomalies structurelles des IgA chez les patients atteints de néphropathie à IgA ^2,6,7, tandis que miR-148b et let-7b ont été documentés en tant que nouveaux biomarqueurs pour la détection de la néphropathie à IgA⁷. Bien que la compréhension des effets des miARN sur la néphropathie à IgA puisse aider à élucider davantage l’étiologie et le traitement 2, les méthodes standard pour profiler les miARN dans la néphropathie à IgA à l’aide de modèles de petits animaux n’ont pas encore été établies².

Nous avons développé ici une méthode simple et fiable pour mesurer les niveaux d’expression des miARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). La souris HIGA est une souche caractéristique de ddY présentant un taux particulièrement élevé d’IgA sériques et le dépôt anormal d’IgA dans les glomérules^rénaux 8,9,10,11. Par conséquent, les souris HIGA peuvent être utilisées comme souris néphropathie à IgA modèle 8,9,10,11. Notre méthode comprend quatre étapes principales: premièrement, l’obtention chirurgicale d’échantillons de reins de souris HIGA; deuxièmement, homogénéiser les échantillons et purifier l’ARN total à l’aide d’une colonne de spin à membrane de silice; troisièmement, synthétiser l’ADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARN total en utilisant la transcription inverse; et quatrièmement, la détection des niveaux d’expression des miARN par réaction en chaîne de la polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR). La justification de cette méthode et la fiabilité des résultats sont fondées sur des rapports antérieurs^12,13. Nous montrons qu’il s’agit d’une technique utile pour mesurer avec précision les niveaux d’expression des miARN dans un modèle murin de néphropathie à IgA, et qu’elle pourrait être utilisée pour faciliter les recherches futures sur les miARN dans la néphropathie à IgA.

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Jichi et sont conformes aux directives sur l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire du Guide des animaux de laboratoire de l’Université médicale de Jichi.

1. Obtention d’échantillons de reins de souris HIGA

REMARQUE: Les souris HIGA présentent un phénotype stable de néphropathie à IgA après^{l’âge de} 25 semaines 8,9,10,11. Les souris Balb/c doivent être sélectionnées comme groupe témoin 8,9,10,11. Des souris HIGA femelles de 25 semaines (n = 10) et des souris Balb/c femelles de 25 semaines (n = 10) ont été obtenues. Il est nécessaire de déterminer à l’avance le nombre de souris nécessaires pour les expériences. Cette étape nécessite environ 7 à 8 heures pour un échantillon de 10 souris HIGA et 10 souris Balb/c.

1. Préparez ces articles : souris HIGA (femelle de 25 semaines), souris Balb/c (femelle de 25 semaines), appareil d’anesthésie par inhalation, isoflurane, feuille de liège, épingle, solution saline tamponnée au phosphate (PBS), seringues d’injection, aiguilles, ciseaux chirurgicaux et forceps.
2. Anesthésier une souris HIGA en utilisant 4% à 5% d’isoflurane avec un appareil d’anesthésie par inhalation et la monter en position dorsale sur la feuille de liège à l’aide de broches. Ajuster la concentration d’isoflurane à 2 % à 3 % comme dose d’entretien après l’induction de l’anesthésie.
   REMARQUE: La profondeur de l’anesthésie est maintenue à un niveau auquel la douleur associée à la procédure invasive est complètement éliminée. En particulier, la concentration d’isoflurane doit être ajustée à 4-5% lors de l’excisation de tissus tels que le thorax. L’épilation et la pommade oculaire ne sont pas essentielles. Il n’est pas nécessaire de monter la souris sur un coussin chauffant si la procédure peut être effectuée rapidement.
3. Faites une incision médiane de 3 à 4 cm de la paroi abdominale de la souris avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps et identifiez soigneusement les deux côtés du rein.
4. Inciser les côtes et le diaphragme avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exposer le cœur. Après avoir incisé l’oreillette droite, injectez du PBS dans le ventricule gauche jusqu’à ce que la couleur du rein passe au jaune pâle (cette procédure signifie que tout le corps de la souris est perfusé avec du PBS.)
5. Coupez l’artère rénale, la veine rénale et l’uretère, et retirez le rein. Diviser le rein en morceaux de 30 mg pour une utilisation à l’étape suivante.
   NOTE: La pathologie de la néphropathie à IgA implique principalement le glomérule dans le cortex rénal (partie externe du rein). Bien qu’il soit difficile de distinguer macroscopiquement et complètement le cortex et la moelle, il est souhaitable de collecter principalement la partie externe du rein. Ces échantillons peuvent être conservés à –80 °C pendant plusieurs mois.

2. Purification de l’ARN total à partir d’échantillons de reins

REMARQUE: Dans cette étape, le kit d’isolation miARN disponible dans le commerce est utilisé pour l’extraction de l’ARN total. En outre, une colonne de spin de déchiquetage de biopolymères est utilisée. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails. Le kit d’isolation miARN contient une colonne de spin à base de membrane de silice, des réactifs de lyse à base de phénol / guanidine, un tampon de lavage guanidine / éthanol (tampon de lavage 1), un tampon de lavage à l’éthanol (tampon de lavage 2) et de l’eau sans nucléase. Cette étape nécessite environ 3 heures pour un échantillon de 10 souris HIGA et 10 souris témoins.

1. Préparer les articles suivants : tubes de collecte de 1,5 ou 2,0 mL, éthanol à 100 %, chloroforme, homogénéisateur de silicium, micropipettes, embouts de pipettes, centrifugeuse, colonne de spin de déchiquetage de biopolymères, colonne de spin à membrane de silice, réactifs de lyse à base de phénol/guanidine, tampon de lavage guanidine/éthanol (tampon de lavage 1), tampon de lavage à l’éthanol (tampon de lavage 2) et eau sans nucléase.
2. Homogénéiser 30 mg d’échantillons de rein à l’aide d’un homogénéisateur au silicium et 700 μL du réactif de lyse à base de phénol/guanidine à température ambiante.
   REMARQUE: Les miARN dans l’échantillon sont vulnérables jusqu’à ce qu’ils aient été exposés au réactif de lyse à base de phénol / guanidine, de sorte que ces étapes doivent être effectuées rapidement.
3. Transférer le lysat dans la colonne de spin de déchiquetage de biopolymère et le centrifuger à 15 000 x g pendant 2 min à température ambiante.
4. Ajouter 140 μL de chloroforme au filtrat et mélanger vigoureusement pendant 15 s. Laisser reposer 2–3 min, puis centrifuger à 12 000 x g à 4 °C pendant 15 min.
5. Transférer doucement le surnageant transparent sans toucher la couche intermédiaire dans un nouveau tube collecteur et ajouter le volume déterminé (voir ci-dessous) d’éthanol à 100%. Vortex pendant 5 s.
   NOTE: 100% d’éthanol à 1,5x le volume du surnageant obtenu est nécessaire.
6. Transférer l’échantillon (limite supérieure 700 μL) dans une colonne de spin à base de membrane de silice et centrifuger l’échantillon à température ambiante pendant 15 s à 8 000 x g. Jeter le filtrat après centrifugation.
7. Ajouter 700 μL de tampon de lavage 1 à la colonne de spin à base de membrane de silice et centrifuger la colonne à température ambiante pendant 15 s à 8 000 x g. Jeter le filtrat après centrifugation.
8. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 2 à la colonne de spin à base de membrane de silice et centrifuger à température ambiante pendant 15 s à 8 000 x g. Jeter le filtrat après centrifugation.
9. Ajouter 500 μL de tampon de lavage 2 à la colonne de spin à base de membrane de silice et centrifuger à température ambiante pendant 15 s à 8 000 x g. Jeter le filtrat après centrifugation.
10. Centrifuger à nouveau la colonne de spin à base de membrane de silice sans rien ajouter pour éliminer tout éthanol supplémentaire, à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Jeter le filtrat après centrifugation.
11. Changez le tube attaché à la colonne de rotation par un nouveau tube de collecte.
12. Ajouter 30 μL d’eau exempte de nucléases à la colonne de spin à base de membrane de silice et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min à température ambiante.
    NOTE: La solution de 30 μL résultante contient une concentration élevée d’ARN total. Cet échantillon peut être conservé à –80 °C pendant plusieurs mois.

3. Synthèse de l’ADNc à partir de l’ARN total

REMARQUE: Dans cette étape, un kit de transcription inverse disponible dans le commerce est utilisé. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails. Ce kit contient un mélange d’acides nucléiques, un mélange de transcriptase inverse et un tampon. Cette procédure doit être effectuée sur la glace pour empêcher la progression de la réaction. Cette étape nécessite environ 3 heures pour un échantillon de 10 souris HIGA et 10 souris témoins.

1. Préparez les éléments suivants : tubes de collecte de 1,5 mL, tubes à bande à huit puits, micropipettes, embouts de pipettes, spectrophotomètre, eau exempte de nucléase, glace, mélange d’acides nucléiques, mélange de transcriptase inverse, tampon et cycleur thermique.
2. Mesurer la concentration d’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, calculez le volume requis d’eau exempte de nucléases afin que 12 μL contiennent 1 μg d’ARN total.
3. Préparer un mélange maître avec le contenu suivant : 2,0 μL de mélange d’acides nucléiques, 2,0 μL de mélange de transcriptase inverse et 4,0 μL de tampon pour un total de 8,0 μL par échantillon.
4. Ajouter 8 μL du mélange maître à chaque puits de tubes à bande de huit puits.
5. Diluer l’ARN total dans le volume d’eau exempte de nucléases calculé en 3.2. Ensuite, ajoutez 12 μL de la solution d’ARN totale (contenant 1 μg d’ARN total) à chaque puits de tubes à bande de huit puits.
6. Incuber l’échantillon dans 8 tubes en bande de puits à 37 °C pendant 60 min à l’aide du cycleur thermique. Ensuite, incuber à 95 °C pendant 5 min à l’aide du cycleur thermique.
   REMARQUE: La solution après incubation contient une forte concentration d’ADNc.
7. Transférer cette solution dans un tube de 1,5 mL et ajouter 200 μL d’eau sans nucléase.
   REMARQUE: Les 200 μL de solution résultant peuvent être utilisés pour la qRT-PCR comme ADNc modèle. Cet échantillon peut être conservé à –80 °C pendant environ 1 an.

4. qRT-PCR des miARN

REMARQUE: Dans cette étape, un kit PCR disponible dans le commerce est utilisé. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails. Ce kit contient un mélange PCR, un apprêt universel et de l’eau sans nucléase. Les échantillons doivent être préparés en double exemplaire et l’exactitude des résultats doit être prise en compte dans chaque cas. Les niveaux d’expression des miARN sont quantifiés par la méthode ΔΔCT. Cette étape nécessite environ 4 heures pour un échantillon de 10 souris HIGA et 10 souris témoins.

1. Préparez les éléments suivants : tube de collecte de 1,5 mL, plaque de réaction à 96 puits, film adhésif pour la plaque de réaction à 96 puits, micropipettes, pointes de pipettes, mélange PCR, amorce universelle, eau sans nucléase, amorces spécifiques aux miARN et instrument de PCR en temps réel.
2. Préparer le mélange principal avec le contenu suivant : 12,5 μL de mélange PCR, 2,5 μL d’amorce universelle, 1,25 μL d’amorce spécifique à 5 μM miARN et 6,25 μL d’eau sans nucléase pour chaque puits.
   NOTE: Dans ce test, des amorces spécifiques aux miARN [ARN, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p et miR-21-5p] ont été utilisées. RNU6-2 a été utilisé comme témoin endogène¹⁴.
3. Ajouter 22,5 μL du mélange maître à chaque puits de la plaque de réaction de 96 puits.
4. Ajouter 2,5 μL d’ADNc préparé à l’étape 3.7 dans le puits individuel de la plaque de 96 puits.
5. Couvrir la plaque de réaction à 96 puits avec un film d’adhérence, puis centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s.
6. Exécutez l’instrument PCR en temps réel. Programmez l’instrument PCR comme suit : activation initiale à 95 °C pendant 15 min, puis 40 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 15 s, recuit à 55 °C pendant 30 s et extension à 70 °C pendant 30 s.
7. Quantifier l’expression génique à l’aide de la méthode ΔΔCT. Les niveaux d’expression relatifs sont déterminés comme 2^–ΔΔCT.
   REMARQUE : Les courbes d’amplification anormales de la PCR doivent être considérées pour être exclues des résultats.

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Résultats

Nous avons étudié les niveaux d’expression des miARN dans les reins de souris HIGA (n = 10). Ce résultat a été obtenu entièrement sur la base du protocole décrit. Les reins des souris Balb/c ont été choisis comme témoins (n = 10). Dans les deux groupes, des personnes âgées de 25 semaines ont été sélectionnées. Seules les souris HIGA femelles étaient disponibles auprès du fournisseur. Les niveaux d’expression de trois miARN (miR-155-5p, miR-146a-5p et miR-21-5p; Graphique 1

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Discussion

Nous avons pu mesurer les niveaux d’expression des miARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA) en utilisant cette nouvelle méthode. La néphropathie à IgA est une maladie inexpliquée qui nécessite des recherches supplémentaires pour clarifier son étiologie et ses cibles thérapeutiques ^1,3. Cependant, l’obtention d’échantillons de rein humains est très invasive. Cette nouvelle technique est avantageuse en ce qu’...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer