Nachweis der MicroRNA-Expression in den Nieren von Immunglobulin A nephropathischen Mäusen

Zusammenfassung

microRNAs sind an der Pathogenese der IgA-Nephropathie beteiligt. Wir haben eine zuverlässige Methode zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Diese neue Methode wird es erleichtern, die Beteiligung von miRNAs an der IgA-Nephropathie zu überprüfen.

Zusammenfassung

Die Immunglobulin-A-Nephropathie (IgA) ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA gekennzeichnet ist und zum Nierenversagen im Endstadium führt. In den letzten Jahren wurde über die Beteiligung von microRNAs (miRNAs) an der Pathogenese der IgA-Nephropathie berichtet. Es gibt jedoch keine etablierte Methode zur Profilierung von miRNAs in der IgA-Nephropathie anhand von Kleintiermodellen. Daher haben wir eine zuverlässige Methode zur Analyse von miRNA in der Niere eines IgA-Mausmodells (HIGA-Maus) entwickelt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die veränderten Expressionsniveaus von miRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen im Vergleich zu den Konzentrationen in den Nieren von Kontrollmäusen nachzuweisen. Kurz gesagt besteht diese Methode aus vier Schritten: 1) Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen; 2) Aufreinigung der Gesamt-RNA aus Nierenproben; 3) Synthese komplementärer DNA aus Gesamt-RNA; und 4) quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) von miRNAs. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich die Expressionsniveaus mehrerer miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p) in den Nieren von HIGA-Mäusen nachweisen. Diese neue Methode kann auch auf andere Studien zur Profilierung von miRNAs bei IgA-Nephropathie angewendet werden.

Einleitung

Die Immunglobulin A (IgA)-Nephropathie ist eine Form der primären Glomerulonephritis, die durch eine abnorme Ablagerung von IgA in der glomerulären Mesangialregion der Nieren gekennzeichnet ist ^1,2. Sie ist die häufigste der primären Glomerulonephritis und führt bei 20–40 % der Patienten zu Nierenversagen im Endstadium². Die Ursache ist noch unbekannt, aber eine anhaltende Schleimhautentzündung wurde in Verbindung gebracht ^1,3. Kortikosteroide, Immunsuppressiva und Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Systems wurden als therapeutische Methoden vorgeschlagen^1,3, sind aber noch nicht vollständig etabliert³. Daher sind weitere Forschungen erforderlich, um die Ätiologie und die therapeutischen Methoden zur Behandlung der IgA-Nephropathie zu klären.

microRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen ^4,5. Es wird berichtet, dass miRNAs an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind, und einige wurden als Krankheitsbiomarker und Therapeutika identifiziert ^4,5. In den letzten Jahren wurde auch über eine Assoziation zwischen miRNAs und der Pathogenese der IgA-Nephropathie berichtet ^2,6,7. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass miR-148b an strukturellen Anomalien von IgA bei Patienten mit IgA-Nephropathie beteiligt ist ^2,6,7, während miR-148b und let-7b als neuartige Biomarker zum Nachweis der IgA-Nephropathie⁷ dokumentiert wurden. Obwohl das Verständnis der Auswirkungen von miRNAs auf die IgA-Nephropathie dazu beitragen kann, die Ätiologie und Behandlung^weiter aufzuklären^{2, wurden} Standardmethoden zur Profilierung von miRNAs bei IgA-Nephropathie anhand von Kleintiermodellen noch nicht etabliert 2.

In dieser Arbeit haben wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Messung der miRNA-Expression in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) entwickelt. Die HIGA-Maus ist ein charakteristischer ddY-Stamm, der einen besonders hohen Serum-IgA-Spiegel und die abnorme Ablagerung von IgA in den Nierenglomeruli^aufweist 8,9,10,11. Daher können HIGA-Mäuse als IgA-Nephropathie-Mausmodell verwendet werden 8,9,10,11. Unsere Methode besteht aus vier Hauptschritten: Erstens, der chirurgischen Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen; zweitens die Homogenisierung von Proben und die Aufreinigung der Gesamt-RNA unter Verwendung einer Spin-Säule auf Basis einer Siliziumdioxidmembran; drittens die Synthese komplementärer DNA (cDNA) aus der Gesamt-RNA mittels reverser Transkription; und viertens, der Nachweis der Expressionsniveaus von miRNA durch quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Die Begründung für diese Methode und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse basieren auf früheren Berichten^12,13. Wir zeigen, dass dies eine nützliche Technik ist, um die miRNA-Expression in einem IgA-Nephropathie-Mausmodell genau zu messen, und dass sie zur Erleichterung der zukünftigen Erforschung von miRNAs bei IgA-Nephropathie verwendet werden könnte.

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Protokoll

Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der Jichi Medical University genehmigt und entsprechen den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren aus dem Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. Gewinnung von Nierenproben von HIGA-Mäusen

HINWEIS: HIGA-Mäuse zeigen nach einem Alter von 25 Wochen einen stabilen Phänotyp der IgA-Nephropathie 8,9,10,11. Als Kontrollgruppe^sollten Balb/c-Mäuse 8,9,10,11 ausgewählt werden. Es wurden 25 Wochen alte weibliche HIGA-Mäuse (n = 10) und 25 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (n = 10) erhalten. Es ist notwendig, die Anzahl der Mäuse, die für Experimente benötigt werden, im Voraus zu bestimmen. Dieser Schritt benötigt etwa 7–8 h für eine Stichprobengröße von 10 HIGA-Mäusen und 10 Balb/c-Mäusen.

1. Bereiten Sie folgende Gegenstände vor: HIGA-Mäuse (25 Wochen alt, weiblich), Balb/c-Mäuse (25 Wochen alt, weiblich), Inhalationsanästhesiegerät, Isofluran, Korkfolie, Nadel, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Injektionsspritzen, Nadeln, chirurgische Schere und Pinzette.
2. Betäuben Sie eine HIGA-Maus mit 4 % bis 5 % Isofluran mit einem Inhalationsanästhesiegerät und befestigen Sie sie mit Stiften in dorsaler Position auf dem Korkblatt. Stellen Sie die Isoflurankonzentration auf 2 % bis 3 % als Erhaltungsdosis nach der Narkoseeinleitung ein.
   HINWEIS: Die Narkosetiefe wird auf einem Niveau gehalten, bei dem die mit dem invasiven Eingriff verbundenen Schmerzen vollständig beseitigt werden. Insbesondere sollte die Isoflurankonzentration auf 4-5 % eingestellt werden, wenn Gewebe wie der Thorax herausgeschnitten werden. Haarentfernung und Augensalbe sind nicht unbedingt erforderlich. Es ist nicht notwendig, die Maus auf einem Heizkissen zu montieren, wenn der Vorgang schnell durchgeführt werden kann.
3. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette einen 3–4 cm langen Mittellinienschnitt der Bauchdecke der Maus und identifizieren Sie vorsichtig beide Seiten der Niere.
4. Schneiden Sie die Rippen und das Zwerchfell mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette ein, um das Herz freizulegen. Nachdem Sie den rechten Vorhof eingeschnitten haben, injizieren Sie PBS in die linke Herzkammer, bis sich die Nierenfarbe in blassgelb ändert (dieses Verfahren bedeutet, dass der gesamte Körper der Maus mit PBS durchblutet wird).
5. Durchtrennen Sie die Nierenarterie, die Nierenvene und den Harnleiter und entfernen Sie die Niere. Teilen Sie die Niere in 30-mg-Stücke, um sie im nächsten Schritt zu verwenden.
   HINWEIS: Die Pathologie der IgA-Nephropathie betrifft hauptsächlich den Glomerulus in der Nierenrinde (äußerer Teil der Niere). Obwohl es schwierig ist, den Kortex und das Mark makroskopisch und vollständig zu unterscheiden, ist es wünschenswert, hauptsächlich den äußeren Teil der Niere zu sammeln. Diese Proben können mehrere Monate bei –80 °C gelagert werden.

2. Aufreinigung der Gesamt-RNA aus Nierenproben

HINWEIS: In diesem Schritt wird ein kommerziell erhältliches miRNA-Isolationskit für die Extraktion der Gesamt-RNA verwendet. Darüber hinaus wird eine Biopolymer-Zerkleinerungs-Schleuderkolonne eingesetzt. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle . Das miRNA-Isolationskit enthält eine Spinsäule auf Kieselsäuremembranbasis, Phenol/Guanidin-basierte Lysereagenzien, Guanidin/Ethanol-Waschpuffer (Waschpuffer 1), Ethanol-Waschpuffer (Waschpuffer 2) und nukleasefreies Wasser. Dieser Schritt benötigt ca. 3 h für eine Stichprobengröße von 10 HIGA-Mäusen und 10 Kontrollmäusen.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5- oder 2,0-ml-Sammelröhrchen, 100 % Ethanol, Chloroform, Siliziumhomogenisator, Mikropipetten, Pipettenspitzen, Zentrifuge, Spin-Säule zum Zerkleinern von Biopolymeren, Spin-Säule auf Kieselsäuremembranbasis, Lysereagenzien auf Phenol-/Guanidin-Basis, Guanidin/Ethanol-Waschpuffer (Waschpuffer 1), Ethanol-Waschpuffer (Waschpuffer 2) und nukleasefreies Wasser.
2. Homogenisieren Sie 30 mg Nierenproben mit einem Siliziumhomogenisator und 700 μl des Phenol/Guanidin-basierten Lysereagenzes bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Die miRNAs in der Probe sind anfällig, bis sie einem Phenol/Guanidin-basierten Lysereagenz ausgesetzt wurden, daher sollten diese Schritte umgehend durchgeführt werden.
3. Das Lysat wird in die Biopolymer-Zerkleinerungsspinne überführt und bei 15.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
4. 140 μL Chloroform zum Filtrat geben und 15 s kräftig mischen. 2–3 min einwirken lassen, dann bei 12.000 x g bei 4 °C 15 min zentrifugieren.
5. Übertragen Sie den klaren Überstand, ohne die mittlere Schicht zu berühren, vorsichtig in ein neues Auffangröhrchen und fügen Sie das ermittelte Volumen (siehe unten) 100 % Ethanol hinzu. Wirbel für 5 s.
   Anmerkungen: Es ist 100 % Ethanol mit dem 1,5-fachen Volumen des erhaltenen Überstands erforderlich.
6. Übertragen Sie die Probe (Obergrenze 700 μl) in eine Spinsäule auf Siliziumdioxidmembranbasis und zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie das Filtrat nach der Zentrifugation.
7. Geben Sie 700 μl Waschpuffer 1 in die auf Siliziumdioxidmembran basierende Spin-Säule und zentrifugieren Sie die Säule bei Raumtemperatur für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie das Filtrat nach der Zentrifugation.
8. Geben Sie 500 μl Waschpuffer 2 in die Schleudersäule auf Silica-Membranbasis und zentrifugieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie das Filtrat nach der Zentrifugation.
9. Geben Sie 500 μl Waschpuffer 2 in die Schleudersäule auf Silica-Membranbasis und zentrifugieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie das Filtrat nach der Zentrifugation.
10. Zentrifugieren Sie die auf Siliziumdioxidmembran basierende Spin-Säule erneut, ohne etwas hinzuzufügen, um zusätzliches Ethanol zu entfernen, bei 15.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Filtrat nach dem Zentrifugieren.
11. Tauschen Sie das an der Schleudersäule befestigte Röhrchen in ein neues Sammelröhrchen aus.
12. Geben Sie 30 μl nukleasefreies Wasser in die Spin-Säule auf Silica-Membranbasis und zentrifugieren Sie sie bei 8.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Die resultierende 30-μl-Lösung enthält eine hohe Konzentration an Gesamt-RNA. Diese Probe kann mehrere Monate bei –80 °C gelagert werden.

3. Synthese von cDNA aus Gesamt-RNA

HINWEIS: In diesem Schritt wird ein kommerziell erhältliches Reverse-Transkriptions-Kit verwendet. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle . Dieses Kit enthält eine Nukleinsäuremischung, eine Reverse-Transkriptase-Mischung und einen Puffer. Dieser Vorgang muss auf Eis durchgeführt werden, um ein Fortschreiten der Reaktion zu verhindern. Dieser Schritt benötigt ca. 3 h für eine Stichprobengröße von 10 HIGA-Mäusen und 10 Kontrollmäusen.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5-ml-Sammelröhrchen, Acht-Well-Streifenröhrchen, Mikropipetten, Pipettenspitzen, Spektralphotometer, nukleasefreies Wasser, Eis, Nukleinsäuremischung, Reverse-Transkriptase-Mischung, Puffer und Thermocycler.
2. Messen Sie die Konzentration der Gesamt-RNA mit einem Spektralphotometer. Berechnen Sie dann das erforderliche Volumen an nukleasefreiem Wasser, so dass 12 μl 1 μg Gesamt-RNA enthalten.
3. Bereiten Sie eine Mastermischung mit folgendem Inhalt vor: 2,0 μl Nukleinsäuremischung, 2,0 μl Reverse-Transkriptase-Mischung und 4,0 μl Puffer auf insgesamt 8,0 μl pro Probe.
4. Geben Sie 8 μl der Mastermischung in jede Vertiefung der Acht-Well-Streifenröhrchen.
5. Verdünnen Sie die Gesamt-RNA in dem in 3.2 berechneten Volumen des nukleasefreien Wassers. Geben Sie dann 12 μl der gesamten RNA-Lösung (mit 1 μg Gesamt-RNA) in jede Vertiefung von Acht-Well-Streifenröhrchen.
6. Inkubieren Sie die Probe in 8-Well-Streifenröhrchen bei 37 °C für 60 min mit dem Thermocycler. Anschließend bei 95 °C für 5 min mit dem Thermocycler inkubieren.
   HINWEIS: Die Lösung nach der Inkubation enthält eine hohe Konzentration an cDNA.
7. Übertragen Sie diese Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 200 μl nukleasefreies Wasser hinzu.
   HINWEIS: Die resultierenden 200 μl Lösung können für die qRT-PCR als Template-cDNA verwendet werden. Diese Probe kann ca. 1 Jahr bei –80 °C gelagert werden.

4. qRT-PCR der miRNA

HINWEIS: In diesem Schritt wird ein handelsübliches PCR-Kit verwendet. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle . Dieses Kit enthält eine PCR-Mischung, einen universellen Primer und nukleasefreies Wasser. Die Proben sollten in zweifacher Ausfertigung angefertigt werden, wobei die Genauigkeit der Ergebnisse in jedem Fall zu berücksichtigen ist. Die Expression von miRNA wird mit der ΔΔCT-Methode quantifiziert. Dieser Schritt benötigt ca. 4 h für eine Stichprobengröße von 10 HIGA-Mäusen und 10 Kontrollmäusen.

1. Bereiten Sie die folgenden Artikel vor: 1,5-ml-Sammelröhrchen, 96-Well-Reaktionsplatte, Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte, Mikropipetten, Pipettenspitzen, PCR-Mix, Universalprimer, nukleasefreies Wasser, miRNA-spezifische Primer und ein Real-Time-PCR-Gerät.
2. Bereiten Sie den Mastermix mit folgendem Inhalt vor: 12,5 μl PCR-Mix, 2,5 μl Universal-Primer, 1,25 μl 5 μM miRNA-spezifischer Primer und 6,25 μl nukleasefreies Wasser für jede Welle.
   HINWEIS: In diesem Assay wurden miRNA-spezifische Primer [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p] verwendet. RNU6-2 wurde als endogene Kontrolle verwendet¹⁴.
3. Geben Sie 22,5 μl der Mastermischung in jede Vertiefung der 96-Well-Reaktionsplatte.
4. Fügen Sie 2,5 μl cDNA, die in Schritt 3.7 hergestellt wurde, in die einzelne Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu.
5. Decken Sie die 96-Well-Reaktionsplatte mit Haftfolie ab und zentrifugieren Sie sie dann 30 s lang bei 1.000 x g .
6. Führen Sie das Real-Time-PCR-Gerät aus. Programmieren Sie das PCR-Gerät wie folgt: Erstaktivierung bei 95 °C für 15 min, dann 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 15 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 70 °C für 30 s.
7. Quantifizierung der Genexpression mit der ΔΔCT-Methode. Relative Expressionsniveaus werden mit 2^–ΔΔCT bestimmt.
   HINWEIS: Abnorme PCR-Amplifikationskurven sollten für den Ausschluss aus den Ergebnissen in Betracht gezogen werden.

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Ergebnisse

Wir untersuchten die Expression von miRNAs in den Nieren von HIGA-Mäusen (n=10). Dieses Ergebnis wurde vollständig auf der Grundlage des beschriebenen Protokolls erzielt. Als Kontrolle wurden die Nieren von Balb/c-Mäusen ausgewählt (n=10). In beiden Gruppen wurde ein Alter von 25 Wochen ausgewählt. Nur weibliche HIGA-Mäuse waren beim Lieferanten erhältlich. Die Expressionsniveaus von drei miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p und miR-21-5p; Abbildung 1) festgestellt, die zuvor mit einer IgA...

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Diskussion

Mit dieser neuen Methode konnten wir die Expression von miRNAs in den Nieren eines IgA-Nephropathie-Mausmodells (HIGA-Mäuse) messen. Die IgA-Nephropathie ist eine ungeklärte Erkrankung, die weiterer Forschung bedarf, um ihre Ätiologie und ihre therapeutischen Ziele zu klären ^1,3. Die Gewinnung menschlicher Nierenproben ist jedoch sehr invasiv. Diese neue Technik hat insofern den Vorteil, als sie die Untersuchung der IgA-Nephropathie an Kleintieren ermöglicht...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer