Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A

Resumen

Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Resumen

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA, que conduce a la insuficiencia renal terminal. En los últimos años, se ha reportado la participación de microRNAs (miRNAs) en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Sin embargo, no existe un método establecido para perfilar miRNAs en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños. Por lo tanto, desarrollamos un método confiable para analizar miRNA en el riñón de un modelo de ratón IgA (ratón HIGA). El objetivo de este protocolo es detectar los niveles de expresión alterados de miRNAs en los riñones de ratones HIGA en comparación con los niveles en riñones de ratones control. En resumen, este método consta de cuatro pasos: 1) obtención de muestras de riñón de ratones HIGA; 2) purificar el ARN total de muestras de riñón; 3) sintetizar ADN complementario a partir de ARN total; y 4) reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos con éxito los niveles de expresión de varios miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p) en los riñones de ratones HIGA. Este nuevo método se puede aplicar a otros estudios que perfilan miRNAs en nefropatía por IgA.

Introducción

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA en la región mesangial glomerular renal ^1,2. Es la más común de las glomerulonefritis primarias y conduce a la insuficiencia renal terminal en 20-40% de los pacientes². La causa aún se desconoce, pero la infección persistente de la mucosa ha sido implicada ^1,3. Los corticosteroides, inmunosupresores e inhibidores del sistema renina-angiotensina han sido propuestos como métodos terapéuticos^1,3, pero no han sido completamente establecidos ³. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para aclarar la etiología y los métodos terapéuticos para tratar la nefropatía por IgA.

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica ^4,5. Se informa que los miARN están involucrados en la patogénesis de diversas enfermedades, y algunos han sido identificados como biomarcadores de enfermedades y agentes terapéuticos ^4,5. En los últimos años, también se ha descrito una asociación entre los miRNAs y la patogénesis de la nefropatía por IgA ^2,6,7. Por ejemplo, se demostró que miR-148b estaba involucrado en anomalías estructurales de IgA en pacientes con nefropatía por IgA ^2,6,7, mientras que miR-148b y let-7b se documentaron como nuevos biomarcadores para detectar la nefropatía por IgA⁷. Aunque comprender los efectos de los miARN sobre la nefropatía por IgA puede ayudar a dilucidar aún más la etiología y el tratamiento 2, aún no se han establecido métodos estándar para perfilar los miARN en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños².

Aquí desarrollamos un método simple y confiable para medir los niveles de expresión de miARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía por IgA (ratones HIGA). El ratón HIGA es una cepa ddY característica que muestra un nivel particularmente alto de IgA sérica y el depósito anormal de IgA en los glomérulos renales 8,9,10,11. Por lo tanto, los ratones HIGA se pueden utilizar como un modelo de ratón de nefropatía por IgA 8,9,10,11. Nuestro método consta de cuatro pasos principales: primero, obtener quirúrgicamente muestras de riñón de ratones HIGA; segundo, homogeneizar muestras y purificar el ARN total utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice; tercero, sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN total mediante transcripción inversa; y cuarto, detectar los niveles de expresión de miRNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). La justificación de este método y la fiabilidad de los resultados se basan en informes anteriores^12,13. Demostramos que esta es una técnica útil para medir con precisión los niveles de expresión de miARN en un modelo de ratón con nefropatía por IgA, y que podría usarse para facilitar futuras investigaciones sobre miARN en la nefropatía por IgA.

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Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Jichi y cumplen con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi.

1. Obtención de muestras de riñón de ratones HIGA

NOTA: Los ratones HIGA muestran un fenotipo estable de nefropatía por IgA después de las 25 semanas de edad 8,9,10,11. Los ratones Balb/c deben seleccionarse como grupo control 8,9,10,11. Se obtuvieron ratones HIGA hembra de 25 semanas de edad (n = 10) y ratones Balb/c hembra de 25 semanas de edad (n = 10). Es necesario determinar el número de ratones necesarios para los experimentos de antemano. Este paso requiere aproximadamente 7-8 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones Balb/c.

1. Prepare estos artículos: ratones HIGA (hembra de 25 semanas de edad), ratones Balb/c (hembras de 25 semanas de edad), aparatos de anestesia por inhalación, isoflurano, lámina de corcho, alfiler, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas para inyección, agujas, tijeras quirúrgicas y fórceps.
2. Anestesiar un ratón HIGA usando 4%-5% de isoflurano con aparato de anestesia por inhalación y montarlo en posición dorsal en la lámina de corcho usando alfileres. Ajustar la concentración de isoflurano a 2%-3% como dosis de mantenimiento después de la inducción de la anestesia.
   NOTA: La profundidad de la anestesia se mantiene a un nivel en el que el dolor asociado con el procedimiento invasivo se elimina por completo. En particular, la concentración de isoflurano debe ajustarse al 4-5% cuando se extirpan tejidos como el tórax. La depilación y la pomada para los ojos no son esenciales. No es necesario montar el mouse en una almohadilla térmica si el procedimiento se puede realizar rápidamente.
3. Haga una incisión de 3-4 cm en la línea media de la pared abdominal del ratón con tijeras quirúrgicas y fórceps e identifique cuidadosamente ambos lados del riñón.
4. Incise las costillas y el diafragma con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de incidir la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (este procedimiento significa que todo el cuerpo del ratón se perfunde con PBS).
5. Cortar la arteria renal, la vena renal y el uréter, y extirpar el riñón. Divida el riñón en trozos de 30 mg para usar en el siguiente paso.
   NOTA: La patología de la nefropatía por IgA afecta principalmente al glomérulo de la corteza renal (parte externa del riñón). Aunque es difícil distinguir macroscópicamente y completamente la corteza y la médula, es deseable recolectar principalmente la parte externa del riñón. Estas muestras pueden almacenarse a –80 °C durante varios meses.

2. Purificación del ARN total de muestras renales

NOTA: En este paso, se utiliza el kit de aislamiento de miARN disponible comercialmente para la extracción de ARN total. Además, se utiliza una columna de centrifugado de biopolímeros. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. El kit de aislamiento de miARN contiene una columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasas. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.

1. Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1.5 o 2.0 ml, etanol al 100%, cloroformo, homogeneizador de silicio, micropipetas, puntas de pipeta, centrífuga, columna de centrifugado de biopolímeros, columna de espín a base de membrana de sílice, reactivos de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado de guanidina/etanol (tampón de lavado 1), tampón de lavado de etanol (tampón de lavado 2) y agua libre de nucleasa.
2. Homogeneizar muestras de riñón de 30 mg utilizando un homogeneizador de silicio y 700 μL del reactivo de lisis a base de fenol/guanidina a temperatura ambiente.
   NOTA: Los miRNAs en la muestra son vulnerables hasta que han sido expuestos al reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, por lo que estos pasos deben realizarse con prontitud.
3. Transfiera el lisado a la columna de centrifugado de biopolímero y centrifugarlo a 15.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente.
4. Añadir 140 μL de cloroformo al filtrado y mezclar vigorosamente durante 15 s. Dejar actuar durante 2-3 min, luego centrifugar a 12.000 x g a 4 °C durante 15 min.
5. Transfiera suavemente el sobrenadante transparente sin tocar la capa intermedia a un nuevo tubo de recolección y agregue el volumen determinado (ver más abajo) de etanol al 100%. Vórtice durante 5 s.
   NOTA: Se requiere etanol al 100% a 1,5 veces el volumen del sobrenadante obtenido.
6. Transfiera la muestra (límite superior 700 μL) a una columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la muestra a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
7. Añadir 700 μL de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugar la columna a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
8. Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
9. Añadir 500 μL de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a temperatura ambiente durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
10. Centrifugar de nuevo la columna de centrifugado a base de membrana de sílice sin añadir nada para eliminar el etanol adicional, a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Deseche el filtrado después de la centrifugación.
11. Cambie el tubo conectado a la columna de centrifugado por un nuevo tubo de recolección.
12. Agregue 30 μL de agua libre de nucleasas a la columna de centrifugado a base de membrana de sílice y centrifugarla a 8,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    NOTA: La solución resultante de 30 μL contiene una alta concentración de ARN total. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante varios meses.

3. Síntesis de ADNc a partir de ARN total

NOTA: En este paso, se utiliza un kit de transcripción inversa disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa y tampón. Este procedimiento debe realizarse en hielo para evitar el progreso de la reacción. Este paso requiere aproximadamente 3 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.

1. Prepare los siguientes elementos: tubos de recolección de 1,5 ml, tubos de tira de ocho pocillos, micropipetas, puntas de pipetas, espectrofotómetro, agua libre de nucleasas, hielo, mezcla de ácidos nucleicos, mezcla de transcriptasa inversa, tampón y termociclador.
2. Mida la concentración de ARN total usando un espectrofotómetro. Luego, calcule el volumen requerido de agua libre de nucleasas para que 12 μL contengan 1 μg de ARN total.
3. Prepare una mezcla maestra con el siguiente contenido: 2.0 μL de mezcla de ácidos nucleicos, 2.0 μL de mezcla de transcriptasa inversa y 4.0 μL de tampón hasta un total de 8.0 μL por muestra.
4. Agregue 8 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.
5. Diluir el ARN total en el volumen de agua libre de nucleasas calculado en 3.2. Luego, agregue 12 μL de la solución de ARN total (que contiene 1 μg de ARN total) a cada pocillo de tubos de tira de ocho pocillos.
6. Incubar la muestra en tubos de 8 pocillos a 37 °C durante 60 min utilizando el termociclador. A continuación, incubar a 95 °C durante 5 min utilizando el termociclador.
   NOTA: La solución después de la incubación contiene una alta concentración de ADNc.
7. Transfiera esta solución a un tubo de 1,5 ml y agregue 200 μL de agua libre de nucleasas.
   NOTA: Los 200 μL de solución resultantes se pueden utilizar para qRT-PCR como ADNc plantilla. Esta muestra puede almacenarse a –80 °C durante aproximadamente 1 año.

4. qRT-PCR de miRNA

NOTA: En este paso, se utiliza un kit de PCR disponible comercialmente. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles adicionales. Este kit contiene mezcla de PCR, cebador universal y agua libre de nucleasas. Las muestras deben prepararse por duplicado, y la exactitud de los resultados debe considerarse en cada caso. Los niveles de expresión de miRNA se cuantifican mediante el método ΔΔCT. Este paso requiere aproximadamente 4 h para un tamaño de muestra de 10 ratones HIGA y 10 ratones control.

1. Prepare los siguientes elementos: tubo de recolección de 1,5 ml, placa de reacción de 96 pocillos, película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, micropipetas, puntas de pipeta, mezcla de PCR, cebador universal, agua libre de nucleasas, cebadores específicos de miARN y un instrumento de PCR en tiempo real.
2. Prepare la mezcla maestra con el siguiente contenido: 12,5 μL de mezcla de PCR, 2,5 μL de cebador universal, 1,25 μL de cebador específico de miARN de 5 μM y 6,25 μL de agua libre de nucleasas para cada pozo.
   NOTA: En este ensayo, se utilizaron cebadores específicos para miRNAs [ARN, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p]. RNU6-2 fue utilizado como control endógeno¹⁴.
3. Agregue 22.5 μL de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de reacción de 96 pocillos.
4. Añadir 2,5 μL de ADNc preparado en el paso 3.7 al pocillo individual de la placa de 96 pocillos.
5. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con una película de adhesión, luego centrifugar a 1.000 x g durante 30 s.
6. Ejecute el instrumento de PCR en tiempo real. Programe el instrumento de PCR de la siguiente manera: activación inicial a 95 °C durante 15 min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 70 °C durante 30 s.
7. Cuantificar la expresión génica utilizando el método ΔΔCT. Los niveles de expresión relativos se determinan como 2^–ΔΔCT.
   NOTA: Las curvas de amplificación por PCR anormales deben considerarse para su exclusión de los resultados.

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Resultados

Investigamos los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de ratones HIGA (n = 10). Este resultado se obtuvo completamente en base al protocolo descrito. Los riñones de ratones Balb/c fueron seleccionados como control (n=10). En ambos grupos, se seleccionaron las 25 semanas de edad. Solo los ratones HIGA hembra estaban disponibles en el proveedor. Los niveles de expresión de tres miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p; Figura 1) fueron detectados, que previamente fueron reporta...

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Discusión

Pudimos medir los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA) utilizando este nuevo método. La nefropatía por IgA es una enfermedad inexplicable que necesita más investigación para aclarar su etiología y dianas terapéuticas ^1,3. Sin embargo, la obtención de muestras de riñón humano es altamente invasiva. Esta nueva técnica es ventajosa porque permite el estudio de la nefropatía por IgA utili...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer