从人类肌肉提比利斯前部高级隔间收集骨骼肌肉活检，用于机械评估

摘要

本技术报告描述了经过改良的Bergström技术的变化，用于对前骨质纤维的活检，以限制纤维损伤。

摘要

收缩骨骼纤维的机械性能是整体肌肉健康、功能和性能的关键指标。人类骨骼肌活检经常收集为这些努力。然而，除了常用的粘液后，活检程序的技术描述相对较少。虽然活检技术经常进行调整，以适应每个肌肉在研究的特点，很少有技术报告分享这些变化，以更大的社区。因此，当操作员重新发明车轮时，人类参与者的肌肉组织经常被浪费掉。从各种肌肉中扩展活检的可用材料可以减少活检失败的事件。本技术报告描述了改进后的 Bergström 技术在粘液头骨前的变化，该技术可限制纤维损坏并提供足够的纤维长度进行机械评估。手术是一个门诊手术，可以在一小时内完成。此程序的恢复期是立即为轻活动（即步行），最多三天恢复正常身体活动，约一个星期的伤口护理。提取的组织可用于机械力实验，我们在这里提供具有代表性的激活数据。该协议适用于大多数收集目的，可能适应其他骨骼肌，并可能通过修改收集针进行改进。

引言

为临床或研究目的研究人类肌肉生理学往往需要肌肉活检。例如，人类肌肉生理学和生物力学的一个主要挑战是区分和理解肌肉性能对运动的各种适应。性能适应不仅包括结构适应（例如，收缩蛋白的变化，肌肉结构），还包括神经适应^1，这是很难，如果不是不可能，单独评估时，测试完好无损的原位人类肌肉。纤维级实验去除这些高阶成分，并允许更直接地评估肌肉收缩，并可通过活检技术收集。肌肉活检已经收集至少自1868^年2。今天，收集肌肉活检的主要技术是修改的Bergström技术^{3,3，4，5，,5}虽然其他技术可用，包括使用威尔-布莱克斯利孔^胸6或所谓的细针^7,7，8。所有这些技术都使用特殊的针状仪器，这些仪器被设计成进入肌肉并切割一块组织。具体来说，经过修改的Bergström技术使用大改性针头（此处为 5 mm 针头尺寸）;图1）有一个靠近针尖的窗户和一个较小的内部小刀，在针尖上和向下移动，在穿过针尖窗口时切割肌肉。在这个神圣的小车内是一个拉罗德，向上和向下移动的轴的特罗卡，并推动活检到针窗。要将肌肉拉入针窗，请连接一根吸气软管，吸出针头的空气，通过负压将肌肉拉入针窗。

肌肉活检通常是为了研究蛋白质含量、基因表达或疾病引起的形态变化，或对^,运动计划^{,1、9、10、11,9的反应而获得的}。¹⁰肌肉活检的另一个关键用途是机械实验，如测量纤维收缩力，肌肉纤维僵硬，和历史依赖肌肉属性12，13，14，15，16。^{12,13,14,15,16}单光纤或光纤束力学通过将光纤连接在长度电机和力传感器之间，在控制光纤长度同时测量力的专用钻机上进行测量。通过渗透（如皮肤）纤维，肉瘤膜变得渗透到沐浴液中的化学物质，允许通过改变钙浓度进行活化控制。此外，通过将有关试剂添加到沐浴液中，可以很容易地评估收缩特性对化学品/药物/其他蛋白质的影响。然而，虽然这项技术在其他动物模型中被高度使用，但对人类肌肉活检^{17、18、19,}的皮片纤维^{进行机械测试的研究明显较少}。原因之一是活检工具和协议旨在去除尽可能多的肌肉组织，而较少考虑组织提取过程中遭受的结构损伤程度。事实上，最近的活检方案建议推动活检针进入肌肉，并收集2-4块肌肉^3。这个过程本身对DNA或蛋白质物质的损害很小，但往往破坏纤维和沙康结构，使肌肉纤维的激活变得不稳定或不可能。此外，活检中纤维的相对长度通常很短（<2 mm），不容易用于机械测试。对于机械测试，理想的纤维长（3-5 毫米），且没有结构损坏。

更先进的组织提取技术可用于限制纤维损伤。例如，^一组20 人利用了先前规划的前臂"开放手术"（例如骨折修复），其中肌肉完全暴露，外科医生能够可视化肌肉结构，并仔细解剖肌肉组织相对较大和结构上未损坏的样本（15毫米x5毫米x5毫米）。这种"开放活检"技术在参与者正在接受先前计划的程序时受到青睐，因此限制了潜在参与者的库，尤其是对健康成年人，否则不会进行手术。因此，许多为研究目的进行的活检都是作为门诊程序进行的，切口部位尽可能小，以限制感染风险、疤痕和愈合时间。因此，大多数活检 是盲目 收集的（即，操作者无法看到收集针头，因为它通过筋膜进入肌肉）。这意味着活检的质量几乎完全基于操作者的技能和经验。每个肌肉在收集组织时都有自己的困难，例如有违反神经和血管的风险，选择理想的收集深度和位置，并决定一个合适的身体位置，以保持肌肉尽可能松弛。不幸的是，大多数肌肉特异性技能集没有写下来，所以每个医生必须"重新发明车轮"时，执行活检的肌肉新到他们。这种缺乏经验通常导致几个收集低质量，直到医生确定对肌肉的活检的最佳做法。新手医生经常通过与经验更丰富的同事交谈来学习这种技能，但相对而言，有关这一问题的信息和同行评议文本相对较少，尤其是对于传统上不用于活检收集的肌肉。如果我们考虑上述信息，以及招募人类志愿者进行活检的困难，显然需要更多的教学信息，从而最大限度地提高每个参与者的成功机会。

因此，本文的目的是提出一种肌肉活检技术，为成功采集肌肉活检和长而未损坏的纤维片段进行机械测试提供了方案。人类肌肉活检通常是进行，和活检训练材料的大部分是，肌肉广大后。其相对较大的肌肉大小和表面位置相对于皮肤允许收集足够的肌肉组织，同时尽量减少病人的不适和身体^{创伤,1，21。}然而，在纵向训练研究中使用广大后法存在一些局限性。例如，在包括培训计划的实验协议期间，学员必须在通常为期 2-6 个月的学习期间内避免在学习之外进行额外培训。对于运动员来说，这通常是不可能的，因为广大的后天运动员通常在典型的练习（如蹲下、跳跃）期间进行训练，或者通常用于这项运动（例如跑步、骑自行车）。这些远离研究目的的单独训练经验可能导致肌肉适应，改变肌肉机制、结构以及生理学，使难以或不可能知道研究的实验协议对肌肉特性的真正影响。对于这些类型的研究，最好选择目标肌肉，这往往不是训练团的重点。肌肉头骨前 （TA） 是满足上述要求的理想目标肌肉。此外，培训干预措施可以针对 TA 使用可控的方法，例如使用测功机。几乎没有与 TA 肌肉活检相关的训练材料。因此，我们开发了一个修改的协议，从TA收集相对未受损的肌肉活检。

研究方案

注意:下面，我们概述了一个协议，从参加单独正在进行的研究的志愿者的 TA 中收获机械未损坏的纤维。该协议与Shanely等人^{描述的相似，他们}描述了经过的《大法》中经过的改进的伯格斯特伦技术。此处提供的信息已被我们的研究小组改进，但可能并非适合所有实验室组或组织设置。我们只给出指南，强烈建议新进入活检收集的实验室在尝试任何人体试验之前咨询有经验的实验室小组。

本文的所有研究都通过了波鸿鲁尔大学体育科学学院伦理委员会的批准。参加者在参加研究之前提供免费的书面知情同意。

1. 实验准备

1. 在学员咨询期间查看学员的详细病史时评估排除标准（见下文）。
   1. 如果参与者在活检前6周内目标肌肉受伤，则排除他们。确保参与者一般健康，没有肌肉或凝血障碍，目前没有服用导致血液变薄的药物（如阿司匹林）。
      注意:在这里，我们选择了适度活跃的参与者，并指示他们至少在活检前3天不要进行密集或不习惯的腿部锻炼。但是，对于其他研究问题，这些标准可能会改变。
2. 坚持消毒和无菌技术，受德国法律和普通做法的规范，并由队医^{监督22，23。,23}此程序通常可以作为"床边"程序或在门诊手术室进行。请咨询当地监管机构以寻求指导。
3. 组成活检小组。我们建议活检小组包括4人。一名医生（或受过活检采集培训的个人）、一名与医生合作的医疗助理、一名监测和与参与者互动的助理以及一名在提取后立即处理肌肉活检的助理。有了这些数字，如果在手术过程中发生医疗紧急情况，可以进行快速的患者护理。如果对手术感到舒服，那么团队只能由两个人组成:医生和医疗助理，他们将同时承担病人护理和组织处理。
4. 让学员与项目负责人/医生会面，审查、讨论和签署用户同意书。详细病史（过敏、损伤或下肢和 TA 手术），如果参与者符合任何排除标准，则将其排除在外。彻底讨论恢复和切口卫生。
   1. 向学员解释，他们会疼痛，但能够在手术后立即四处走动;走下山坡或楼梯往往不舒服，前48小时，与充分活动通常返回后72小时。最后，解释，为了限制感染和机械擦伤，切口部位应保持绷带至少1周，并保持清洁。

2. 使用 B 模式超声波可视化前蒂比利斯

1. 指示学员在舒适的超前位置躺下，并尽可能放松腿部肌肉。使用定制设备（见下文），或让助手将脚踝保持稍微弯曲的位置，以模拟活检期间将完成的工作。
   注意:重要的是，参与者有一个轻松的TA，以便它复制在过程中肌肉特征。在考试期间，请学员收缩和放松肌肉，以便注意到肌肉结构的变化。
2. 使用超声波探针可视化 TA 的肤浅和深层隔间，测量肌肉结构并决定插入深度和攻击的针角（图 2A-B）。指示皮肤上的地标。
   1. 特别注意选择避免主要静脉、动脉或神经的目标区域。
   2. 评估肌肉的横截面，目的是确定 TA 肌肉腹部（大约 1/3 的腿，膝盖的异体，和 2 厘米的侧向的胸膜波峰）（图2B） 。记录中央动脉瘤的位置和深度（通常为 1.5-3 厘米），以便注意不要将收集（Bergström）针头开过这一点。
   3. 将超声波探针定位在目标位置的近近方向上，并可视化分粒笔和肌肉厚度（图2A）。使用此信息，以帮助成功地驱动（盲目）收集针进入肌肉腹部。将目标位置的图像保存在两个平面中，供将来在外科手术期间参考。
3. 使用此信息，创建针向目标区域移动的计划。
   1. 计划使切口1-3厘米远出的目标活检区。针头进入肌肉后，将针头沿肢体的长轴旋转至皮肤 +45% 角，然后向活检区域近向驱动。如果针头被推得太硬，这种策略会限制将针头推入中央动脉瘤的机会。此外，针头可以分位或近位驱动，具体取决于针头操作员的手感。

3. 活检程序

1. 指示学员在手术台上休息，放松腿部肌肉。确保参与者到活检地点的视线被窗帘阻挡。
   1. 将参与者的肢体放入将脚踝固定到稍微弯曲的位置（0-5°，从中性位置）中去除肌肉腹部的被动张力; 图3.询问患者是否还能放松肌肉，因为过度的肌肉可能使其难以放松。
      注:我们发现，从多西灵活的脚收集活检，不超过5°的中性（即脚底垂直到刀柄）产生更一致和更大的活检比更多的植物弯曲的脚踝角度。保持脚踝扭伤的设备是定制的设备。但是，可以制造出任何数量（廉价）设备，这些设备仍会产生预期的结果。
2. 根据标准做法^24，剃须、清洁和消毒所选切口区域。
   注:参与者的"清洁"区域约为20厘米近近和10厘米的中向，建议切口部位。但是，请始终就本主题咨询本机构的和/或国家法规（如果有）。消毒方案包括清洁皮肤，然后使用医用级消毒喷雾剂进行四次消毒。如果参与者因任何原因离开表，则必须重新启动消毒协议。
3. 在活检部位用肾上腺素进行1.5 cc的2%Xylocitin的超面注射，该注射作为局部麻醉和血管收缩剂。等待分配的影响时间为 +20-30 分钟。
   注意:这些药物是肌毒性的，因此绝不能注射到肌肉，只有皮下组织。作为对血管收缩的反应，注射部位的区域可能会变白（肤色较浅）或灰色（肤色较深）。
4. 确认药物效果与皮肤间距和温柔的戳与无菌手术刀。
5. 在先前标记的活检部位，用无菌手术刀切开皮肤和筋膜，露出肌肉腹部，进行1厘米近近的切口。小心完全切开筋膜，因为针头是钝的，不会通过筋膜。
6. 将活检针推入与皮肤垂直的肌肉 0.5-1.0 厘米（图 2C，2E）。
   注:操作员会感觉到驱动针头通过不同组织类型所需的张力发生变化。脂肪组织很容易，筋膜是最艰难的，肌肉之间（但可以是可变的，基于参与者）。
7. 将针头定向到皮肤的 [45] 角位置，沿着腿部的长轴 （图2D， 2F）.将针头再推入肌肉 1-2 厘米，直到针尖位于肌肉内的目标位置。
   注:医生应利用保存的超声波图像来考虑肌肉尺寸的个体变化。因为切口只足够大，可以插入针头，医生会盲目地将针头穿过皮肤。有一种"感觉"，活检操作者获得的经验。新手必须从训练有素的活检操作员那里学习技能（在讨论中将对此进行更多讨论）。
8. 将 100 mL 注射器和软管连接到活检针上（图 1G）。将注射器的柱塞拉约 15-20 mL，在针头中产生负压，将肌肉组织吸进针窗，对 Bergström 针头施加吸力。然后，在针窗上快速推车，切除肌肉。
   注:在吸气之前和吸气过程中，有时对针头窗口上方的皮肤施加轻压有助于将肌肉推入针头。
9. 轻轻地从腿上取出针头，慢慢旋转。提取针头时应仅有耐光性。如果有更多的阻力，这可能表示部分活检切口。发生这种情况，将需求返回到目标位置，并重新尝试组织收集。
10. 使用内部冲压杆将切除的组织推向针窗。
11. 小心地从针头上取出样品。
    注:将针头淹没到采集溶液中（参见纤维制备部分）通常会将活检从针头中分离。此外，注射器还可用于驱动空气通过针头并推出样品。这些技术消除了用钳子实际接触活检的用法，减少了损坏的可能性。如果工具、手（手套或不戴）或非无菌溶液与针头接触，则在手术过程中不能进一步使用针头。因此，如果需要进行第二次立即活检，则必须使用新的无菌针头。这种情况经常发生，因此最好保留多个无菌针头。
12. 将组织识别为肌肉，而不是脂肪或结缔组织。肌肉组织很容易从其他组织识别，因为它的深红色（图4A）。有时，收集的组织不是肌肉，而是脂肪或结缔组织。
    1. 如果收集了足够数量的肌肉组织，请继续执行协议。如果没有足够的肌肉，再次尝试活检。
    2. 如果需要第二次活检，请仔细监测参与者，因为第二次针推偶尔会使参与者比第一次更不舒服。
13. 立即在收集溶液中清洗肌肉样本，并准备进行单纤维实验（参见肌肉活检处理和存储）。
    1. 有一名经验丰富的助理检查样品质量（见下文），并评估是否需要进行第二次活检。单独的助理进行活检处理，而团队的其他成员继续与参与者。
14. 关闭切口站点。
    1. 用无菌的白带胶带关闭切口伤口。使用一个或多个碎片将切口点的边缘与切口垂直于切口的长轴垂直，然后以星形图案中再铺下条带，以防止多向加载。
       注:正确处理此步骤将减少疤痕。伤口的伤口可以做，但没有必要。其他选项包括伤口胶水。
    2. 将无菌伤口敷料（例如，Leucomed T plus）放在切口部位，以防止感染。
    3. 用有凝聚力的弹性绷带（例如 Unihaft）包裹腿部，以限制初始出血，防止外部机械冲击。
    4. 用丙烯酸压缩绷带包裹腿部，以防止出血，并防止较深的绷带松动或毁坏。

4. 活检后护理

1. 请学员在程序后立即四处走动。会有局部的疼痛。指示学员尽可能正常地行走。
2. 指示学员不要取下绷带或让水浸泡绷带。它们必须至少保持一天:丙烯酸绷带一天，有凝聚力弹性绷带三天，伤口敷料七天。通知学员，如果需要，可以重新带带。
   1. 根据个人的需求定制参与者的活检后护理。让训练有素的助理或医生对参与者进行评估，并制定适当的活检后护理计划。对于这个程序，我们建议进一步进行体内神经肌肉测试的TA至少与活检分开一周。

5. 肌肉活检处理和储存

1. 组织提取后，立即将组织放入含有严格收集溶液的 5 mL 小瓶中（在 mM 中:Tris （50）、KCl （2）、NaCl （100）、MgCl₂ （2）、EGTA （1）、蛋白酶抑制剂片剂 （1）、pH 7.0），轻轻摇动 4-6 分钟以洗血。
2. 将Rigor溶液更换为新鲜严格，轻轻摇动4-6分钟，然后在4°C储存4-6小时，以允许蛋白酶抑制剂储存溶液和血液交换。
3. 交换Rigor溶液过夜严格（在mM:Tris（50），KCl（2），NaCl（100），MgCl₂ （2），EGTA（1），蛋白酶抑制剂片剂（1），50:50甘油，pH7.0），并在4°C储存12-18小时。
4. 隔夜更换严格度为 50:50 收集严格:甘油，并在 -20 °C 中储存长达 3 个月，或在 -80°C 冰柜中储存一年。
   注:这个过程渗透纤维膜，允许手动向细胞中和细胞外添加钙。这个过程需要时间，在不同的肌肉和物种之间可能会有所不同。

结果

参与者的整个时间承诺是大约1小时（10分钟会诊，10分钟超声波，20分钟的手术准备和麻醉剂，10分钟的手术和10分钟的恢复）。通常，参与者不自觉地激活他们的TA，需要一致的提醒，以保持肌肉尽可能放松。当活检针在肌肉内时，参与者通常会报告活检针周围区域有独特的"压力"感觉，偶尔会出现中度到剧烈的不适。一次，参与者的脚趾在手术过程中稍微抽筋，但在针头被取出后立即停止。活检?...

讨论

在这份报告中，我们描述了一种从TA中对结构上未受损的肌肉组织进行活检的技术。我们发现，这个程序产生一个可接受的含量的可用肌肉纤维（5-10纤维束制剂每50毫克收集的组织）机械测试。此外，我们有足够的组织进行后续的机械、遗传和蛋白质遗传学实验。

有几个方法通常用于收集肌肉活^,检^{3，4，6，27，28。4,6}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction