小鼠的共性共性隔离和识别

摘要

这里介绍的是一个协议，用于分离和放大有氧和体性厌氧小鼠结膜共体细菌使用独特的眼拭子和基于培养的丰富步骤，随后通过微生物为基础的方法和MALDI-TOF质谱识别。

摘要

眼表面曾经被认为是免疫特权和非生物，但最近看来，有一个小的，但持久的共生存在。眼粘膜细菌物种的鉴定和监测一直具有挑战性，因为其丰度低，而且缺乏适当的共生和识别方法。有两种标准方法:基于文化或DNA测序方法。第一种方法是有问题的，由于有限的可回收细菌和第二种方法识别活细菌和死细菌导致异常的眼部空间表示。我们利用标准的微生物培养技术，开发出一种坚固灵敏的细菌分离方法。这是一种基于拭子的技术，使用"实验室内"制成的薄拭子，瞄准下结膜，然后是有氧和足部厌氧基因的放大步骤。该协议使我们能够分离和识别结膜物种，如 科琳细菌、凝固负葡萄球菌、链球菌等。该方法适用于定义不同疾病条件下小鼠的同体多样性。

引言

本议定书的目的是加强从眼结膜中分离出可行和罕见的有氧和足性厌氧微生物的具体隔离，以特性眼微生物群。广泛的研究已经剖析了皮肤、肠道、呼吸道和生殖器上的粘膜群落，并表明这些社区影响免疫系统的发展和反应^1，2，3。眼科共生社区已被证明在某些疾病病理学中发生改变，如干眼病4、Sjogren综合征⁵和糖尿病^6。然而，与其他粘膜部位^6、7、8相比，其丰度相对较低^，妨碍了定义典型眼表面共体群落的能力。这引发了一场关于是否有常驻眼微生物群以及是否存在、它是否与皮肤微生物群不同以及其对与生俱来的免疫系统发育和反应的局部影响的争议。此协议可以帮助解决此问题。

一般来说，定义眼部共融利基的方法是基于测序和基于文化的技术^4，7，9。16 S rDNA测序和BRISK分析⁷显示，与基于文化的技术相比，其多样性更为广泛，但无法区分活微生物和死微生物。由于眼部表面由于撕裂膜的抗微生物特性而对许多微生物怀有敌意^，因此基于DNA的方法将检测这些文物，这些文物可能会使数据偏向于将死细菌识别为常驻共产物而不是污染物。这导致异常的共体识别和描述的眼部空间是较高的微生物丰度和多样性^10。这使得很难通过基于DNA的方法定义常驻眼微生物群。然而，基于文化的标准技术无法检测共体，因为负载太低^11。我们的方法改进了标准做法，使用薄拭子，可以瞄准结膜，从而避免来自邻近皮肤的污染，以及可行的生物体可以通过营养密集介质的短暂培养来丰富的概念，目的是恢复可行但不可耕种的微生物，以及丰富稀有可行的微生物。

结果，每个眼拭子的眼部共生体相对丰度，是结膜常驻微生物群的特征，对比较目的很重要。我们的数据显示，皮肤和结膜微生物之间有差异，随着年龄的增长和性别的丰度差异，多样性也越来越大。此外，这种方法在淘汰小鼠¹²中重新发现了共性差异。此协议可用于描述可能因细胞实践、地理或疾病状态而变化的眼微生物群，以及共生代谢物和产品对免疫系统发育和反应的局部影响。

研究方案

所有涉及小鼠的程序均遵循机构动物护理和使用委员会的准则。在与微生物和潜在受污染材料合作时，请遵循实验室安全指南（由您的机构环境健康和安全部门指导）。在处置可能受到生物危害的受污染材料之前，使用适当的废物贮器和净化程序。

1. 眼拭子准备、工作现场设置、鼠标眼拭子和样品浓缩

1. 准备无菌眼拭子
   注:无菌眼拭子是薄涂层的木制牙签，纤维薄层棉击打和自制。
   1. 自动抽脂适量的棉击和牙签，以清除被擦拭的老鼠数量。
   2. 用拇指和食指捏掉一块半厘米长的棉击。用拇指和食指拉在边缘，形成一个扁平的单多孔层，在击球分崩离析之前停止（在整个伸展击球中分散的一小块棉花是可以接受的）。
   3. 将击球绕在牙签的一端，轻轻握住牙签尖端的拉伸件，使其扭曲，见 图1。"完成"眼拭子将有一个非常薄的棉层伸展在尖端，延伸约半到一厘米远的尖端。
   4. 将"完成"的拭子插入小烧嘴中，向下拭子侧并盖住。高压 釜。
2. 设置工作空间
   1. 准备麻醉，在无菌的50毫升无菌离心管中含有2毫升氯胺酮（100毫克/毫升）、400微升的西拉津（100毫克/毫升）和27.6毫升的无菌盐水（dH₂O中的0.9%纳克）。过滤器消毒和麻醉立即使用（可储存在4°C1个月;始终允许在使用前平衡到室温）。
   2. 用消毒剂清洁工作区域，以尽量减少污染。
   3. Aliquot 0.5 mL 无菌脑心输液介质 （BHI） 放入标有 1.5 mL 无菌微中微管（每只鼠标 1 管并控制）:安排在微中心架。将机架放在冰上。
   4. 设置工作流程如下（从左到右）:小鼠麻醉站（笼内装有实验鼠， 空无菌笼、室温麻醉、25 G针头和1mL注射器）、眼拭子站（冰上引用的BHI、消毒眼拭子、干净的纸巾、70%异丙酚喷雾剂）和电镀站（室温血脂板、10 μL移液器）， 10 μL 无菌一次性提示，生物危害废物容器）。
3. 眼睛擦拭
   1. 每1克小鼠体重剂量分别给每只成年小鼠注射10微克麻醉剂，并放入自封笼中。通过挤压后脚垫测试麻醉;没有运动表示适当的麻醉。
   2. 分配一只手只处理麻醉小鼠，另一只手只处理眼拭子和文化。对于擦拭，从笼子里取出完全麻醉的老鼠:放置在干净的工作表面的顶部，位于其"侧面，左眼暴露。用异丙酚喷洒戴手套的手，用干净的纸巾擦干。
   3. Uncap 专门标记 BHI 微型离心机管，配有专用介质处理手。将管子放回冰上的微型离心机架。 将棉质涂层的眼拭子尖浸入 BHI 中，从管子中取出眼拭子，将眼拭子旋转 2 次，对着内管，以去除多余的液体。
   4. 用鼠标处理手，轻轻地按住鼠标的脖子擦伤。另一方面，将眼尖拭子放在左眼的中间结合区域，见 图2A。轻轻压低眼球，在窗户清洗运动中（图2B）来回移动拭子，在下眼睑和眼睛之间移动10次。保持恒定的压力。
   5. 无需接触毛皮，轻轻取出拭子尖端，垂直于插入位置，并将棉签侧直接放入含有 BHI 介质的标记微离心管中。将润滑眼滴涂抹在擦拭的眼睛上。
   6. 把老鼠还给笼子。
   7. 让拭子在冰上站立10至15分钟，用消毒的手套手取出眼拭子，在介质中混合尖端10次旋转。通过将尖端旋转到微型离心管的内壁进行 5 次旋转来提取拭子。将拭子丢弃在生物危害容器中。
   8. 每个鼠标和控制样本（皮肤或毛皮拭子）重复步骤 1.3.2 到 1.3.7。在每个拭子之间适当消毒手套。
4. 富 集
   1. 通过在 37 °C 下静态地孵育管 1 小时来丰富样品
   2. 在孵化过程中，用每只老鼠5%的羊血糖板（TSA板）标记一个室温的Trypticase大豆，并分成两半。
   3. 眼拭子培养孵化后，从孵化器中取出丰富的样品并放在冰上。
   4. 根据 图3A中的示意图，将漩涡样品与板短暂混合。将样品的 10 μL 引用到 TSA 板上，并将板倾斜以形成条状，重复 2 次。
   5. 在板的分界线的另一边，在 agar 上点 10 μL 的样品，重复 9 次。
   6. 在 37 °C 下孵化板，18 小时、2 天和 4 天（在防止 agar 板干燥的干净腔室中）。以条状计数菌落，注意形态，并计算每个拭子的菌落形成单位 （CFUs），以形成形态相似的分离物。查看未在条带中捕获的独特生物点。

2. 眼微生物的主板、特征和识别

1. 主板
   1. 在 TSA 板背面绘制网格（图 3B）。从每个鼠标眼拭子板中挑选一个带无菌牙签的菌落，并划出主板正方形（网格）、带有菌落编号和鼠标信息的标签网格。为每个形态上截然不同的殖民地挑选和盘取三个不同的殖民地。
   2. 在 37 °C 下连夜孵化盘子。 继续孵化96小时，每天检查新隔离物的外观。
      注:根据小鼠年龄、营养、疾病状态和捕食做法，共和人群会有所不同。分离特征基于我们实验室中发现的主要是有氧和足部性厌氧细菌。
2. 表征
   1. 复制曼尼托盐阿加 （MSA） 和麦康基 （MAC） 板上的¹³ 个板微生物，在 37 °C 的夜间孵化。 注意每个隔离区的增长和蜡殖民地或黄色殖民地的存在，在 MSA 上带有光环。
   2. 对于格拉姆阳性可可西，测试与猫科动物测试^13，14。将3%过氧化氢滴在干净的玻璃滑梯上。使用无菌牙签，从眼拭板中挑选相应的微生物。没有气泡形成表示链球菌，轻微的气泡形成表示科里恩细菌，也许气泡的快速形成表示葡萄球菌的含量。
3. 识别:马尔迪-托夫MS分析
   注:细菌鉴定使用MALDI-TOF和软件数据库进行。该系统采用矩阵辅助激光脱硫电流时间飞行质谱仪（MALDI-TOF MS），用于开发光谱剖面，该光谱剖面与已知细菌光谱进行比较以进行识别。 大肠杆菌，ATCC 8739，用于系统校准。
   1. 板菌分离到TSA板含有5%羊血，并在37°C时以5%的二氧化碳在一夜之间孵化。
   2. 使用 1 μL 循环，将纯细菌的薄层涂抹在 MALDI-TOF 目标滑梯上;1μL 的 MALDI-TOF MS CHCA 基质溶液（阿尔法-氰诺-4-羟基辛酸）覆盖并允许在将幻灯片加载到 MALDI-TOF 仪器之前完全干燥。
   3. 每个隔离点都以重复体中发现。
   4. 包含概率分数大于 80% 的报告，表明具有较高的歧视值，被接受为可靠的结果，并接受细菌识别。

结果

显示不同电镀方法的眼拭板的代表性结果见 图 3A， 显示与 C57BL/6 鼠标的形态多样性隔离。对于每个不同的隔离，殖民地被计算在条和相对丰度，独特的殖民地形成单位（CFU）每个眼拭子，计算和绘制的比较目的。对于微生物特征，细菌从单个鼠标眼拭子板中采摘，以产生主 TSA 板（通过从每个鼠眼拭子板中采摘三元形的形态分明分离物创建）。从主板块，在第二天或当增长...

讨论

由于眼表面的低菌态，许多实验室难以分离眼科共生^体7、20，导致生长、丰度低、多样性低^{的样品数量少。}这种方法通过增加充实步骤以及MALDI-TOF MS重新设计的眼拭子和识别，显著改进了标准文化实践^4，21。浓缩步骤通过放大细菌负荷来解决低可回收性问题。可回收细菌从不到100个CFU显著增...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each