Bindehautkommusale Isolierung und Identifizierung bei Mäusen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Amplifikation aerober und fakultativer anaerober Maus-Bindehaut-Kommensalbakterien unter Verwendung eines einzigartigen Augenabstrichs und eines kulturbasierten Anreicherungsschritts mit anschließender Identifizierung durch mikrobiologische Methoden und MALDI-TOF-Massenspektrometrie vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Augenoberfläche galt einst als immunprivilegiert und abiotisch, aber in letzter Zeit scheint es, dass es eine kleine, aber anhaltende kommensale Präsenz gibt. Die Identifizierung und Überwachung von Bakterienarten an der Augenschleimhaut war aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und der begrenzten Verfügbarkeit geeigneter Methoden für das kommensale Wachstum und die Identifizierung eine Herausforderung. Es gibt zwei Standardansätze: kulturbasierte oder DNA-Sequenzierungsmethoden. Die erste Methode ist aufgrund der begrenzten rückgewinnbaren Bakterien problematisch und der zweite Ansatz identifiziert sowohl lebende als auch tote Bakterien, was zu einer abweichenden Darstellung des Augenraums führt. Wir haben eine robuste und empfindliche Methode zur Bakterienisolierung entwickelt, indem wir auf mikrobiologischen Standardkulturtechniken aufbauen. Dies ist eine auf Tupfern basierende Technik, bei der ein "im Labor" hergestellter dünner Tupfer verwendet wird, der auf die untere Bindehaut abzielt, gefolgt von einem Amplifikationsschritt für aerobe und fakultative anaerobe Gattungen. Dieses Protokoll hat es uns ermöglicht, Bindehautarten wie Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. usw.zu isolieren und zu identifizieren. Der Ansatz eignet sich, um die kommmensale Diversität bei Mäusen unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu definieren.

Einleitung

Ziel dieses Protokolls ist es, die spezifische Isolierung lebensfähiger und seltener aerober und fakultativer anaerober Mikroben aus der okulären Bindehaut zu verbessern, um das okuläre Mikrobiom zu charakterisieren. Umfangreiche Studien haben kommensale Schleimhautgemeinschaften auf Haut, Darm, Atemwegen und Genitaltrakt profiliert und zeigen, dass diese Gemeinschaften die Entwicklung des Immunsystems und die Reaktion beeinflussen^1,2,3. Es wurde gezeigt, dass sich okuläre Kommensalgemeinschaften während bestimmter Krankheitspathologien wie der Erkrankung des trockenen Auges⁴, des Sjögren-Syndroms⁵ und des Diabetes⁶verändern. Die Fähigkeit, eine typische kommensale Gemeinschaft an der Augenoberfläche zu definieren, wird jedoch durch ihre relativ geringe Häufigkeit im Vergleich zu den anderen^{Schleimhautstellen behindert 6,7,8}. Dies löst eine Kontroverse darüber aus, ob es ein residentes Augenmikrobiom gibt und ob es existiert, ob es sich vom Hautmikrobiom und folglich seiner lokalen Wirkung auf die Entwicklung und Reaktion des angeborenen Immunsystems unterscheidet. Dieses Protokoll kann helfen, diese Frage zu lösen.

Im Allgemeinen basieren Ansätze zur Definition der okulären kommensalen Nische auf Sequenzierung und kulturbasierten Techniken^4,7,9. 16 S rDNA-Sequenzierung und BRISK-Analyse⁷ zeigen eine größere Vielfalt als kulturbasierte Techniken, sind aber nicht in der Lage, zwischen lebenden und toten Mikroben zu unterscheiden. Da die Augenoberfläche für viele Mikroben aufgrund der antimikrobiellen Eigenschaften des Tränenfilms 4 feindlich^ist, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten erzeugen, werden DNA-basierte Ansätze diese Artefakte erkennen, die die Daten zur Identifizierung toter Bakterien als ansässige Kommensale und nicht als Verunreinigungen verzerren können. Dies führt zu einer abweichenden kommensalen Identifizierung und Charakterisierung des Augenraums als höher in Mikrobenhäufigkeit und Diversität¹⁰. Dies macht es schwierig, das ansässige okuläre Mikrobiom mit DNA-basierten Methoden zu definieren. Während Standardkulturbasierte Techniken keine Kommensalen erkennen können, weil die Last zu niedrig ist¹¹. Unsere Methode verbessert die Standardpraktiken, indem sie einen dünnen Tupfer verwendet, der auf die Bindehaut abzielen kann, wodurch eine Kontamination durch benachbarte Haut vermieden wird, sowie das Konzept, dass lebensfähige Organismen durch kurze Kultur in nährstoffreichen Medien angereichert werden können, mit dem Ziel, lebensfähige, aber nicht kultivierbare, sowie die Anreicherung seltener lebensfähiger Mikroben wiederzubeleben.

Die Ergebnisse, relative Häufigkeit von okulären Kommensalen pro Augenabstrich, charakterisieren das Bindehaut-residente Mikrobiom und sind für Vergleichszwecke wichtig. Unsere Daten zeigen, dass es einen Unterschied zwischen Haut und Bindehautmikrobiota sowie eine größere Vielfalt mit zunehmendem Alter und einem geschlechtsspezifischen Unterschied in der Fülle gibt. Darüber hinaus hat dieser Ansatz reproduzierbar kommsale Unterschiede bei Knock-out-Mäusen^{gefunden 12}. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das okuläre Mikrobiom zu beschreiben, das aufgrund von Käfigpraktiken, Geografie oder Krankheitszustand variieren kann, sowie die lokalen Auswirkungen von kommensalen Metaboliten und Produkten auf die Entwicklung und Reaktion des Immunsystems.

Protokoll

Alle Verfahren mit Mäusen folgen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee. Befolgen Sie die Laborsicherheitsrichtlinien (gemäß den Anweisungen Ihrer Abteilung für umweltbedingte Gesundheit und Sicherheit), wenn Sie mit Mikroorganismen und potenziell kontaminierten Materialien arbeiten. Verwenden Sie geeignete Abfallbehälter und Dekontaminationsverfahren, bevor Sie potenziell biologisch kontaminationsgefährdete Materialien entsorgen.

1. Vorbereitung des Augenabstrichs, Arbeitsfeld-Setup, Mausaugenabstrich und Probenanreicherung

1. Sterile Augenabstriche vorbereiten
   HINWEIS: Sterile Augenabstriche sind dünn beschichtete Holzzahnstocher mit einer faserdünnen Schicht Baumwolle, die im eigenen Haus hergestellt werden.
   1. Autoklav angemessene Menge an Baumwollschlägern und Zahnstochern für die Anzahl der Mäuse, die abgetupft werden sollen.
   2. Kneifen Sie ein halbes Zentimeter langes Stück Baumwollschläger mit Daumen und Zeigefinger ab. Necken Sie das Schlagen, indem Sie mit Daumen und Zeigefingern an den Kanten ziehen, um eine flache, einzelne poröse Schicht zu bilden, die kurz vor dem Auseinanderfallen des Schlages stoppt (kleine Baumwollstücke, die über den gestreckten Schlag verteilt sind, sind akzeptabel).
   3. Schwenken Sie den Schlag um eines der scharfen Enden des Zahnstochers, indem Sie das ausgestreckte Stück leicht an der Zahnstocherspitze halten, während es verdreht wird, siehe Abbildung 1. Der "fertige" Augenabstrich wird eine sehr dünne Schicht Baumwolle über die Spitze gespannt haben, die sich etwa einen halben bis einen Zentimeter von der Spitze entfernt erstreckt.
   4. "Fertige" Tupfer in kleines Becherglas geben, mit der Seite nach unten abtupfen und abdecken. Autoklav.
2. Einrichten des Arbeitsbereichs
   1. Bereiten Sie eine Anästhesie mit 2 ml Ketamin (100 mg/ml), 400 μL Xylazin (100 mg/ml) und 27,6 ml steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl in dH 2 O) in_einemsterilen 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen vor. Filter sterilisieren und aliquote Anästhesie für den sofortigen Gebrauch (kann bei 4 ° C für 1 Monat gelagert werden; immer vor gebrauchen auf Raumtemperatur ausgleichen lassen).
   2. Reinigen und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel, um Verunreinigungen zu minimieren.
   3. Aliquot 0,5 ml steriles Brain Heart Infusion Media (BHI) in markierte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro Maus und Kontrolle); im Mikrozentrifugenge-Rack anordnen. Stellen Sie das Rack auf Eis.
   4. Arbeitsablauf wie folgt einrichten (von links nach rechts): Mausanästhesiestation (Käfig mit Versuchsmäusen, leerer steriler Käfig, Anästhesie bei Raumtemperatur, 25 G Nadel und 1 ml Spritze), Augenabstrichstation (aliquoteiertes BHI auf Eis, sterilisierte Augenabstriche, saubere Papierhandtücher, 70% Isopropanol-Spray) und Beschichtungsstation (Blutagarplatten bei Raumtemperatur, 10 μL Pipette) , 10 μL sterile Einwegspitzen, Biogefahren-Abfallbehälter).
3. Augenabstrich
   1. 10 μL Anästhesie pro 1 g Mausgewichtsdosis von Ketamin bzw. Xylazin intraperitoneal an jede erwachsene Maus verabreichen und in einen autoklavierten Käfig geben. Testen Sie die Betäubung durch Zusammendrücken des Hinterfußpolsters; keine Bewegung deutet auf eine angemessene Betäubung hin.
   2. Weisen Sie eine Hand zu, nur mit betäubten Mäusen umzugehen und die andere Hand, nur mit dem Augenabstrich und der Kultur umzugehen. Zum Abtupfen die vollständig betäubte Maus aus dem Käfig entfernen; auf die saubere Arbeitsfläche legen, die auf der Seite mit dem linken Auge positioniert ist. Behandschuhte Hände mit Isopropanol besprühen, mit sauberem Papiertuch trocknen.
   3. Uncap speziell beschriftete BHI-Mikrozentrifugenröhre mit dedizierter Medienhandhand. Legen Sie das Röhrchen wieder in das Mikrozentrifugengestell auf Eis.  Tauchen Sie die mit Baumwolle beschichtete Spitze des Augenabstrichs in BHI, ziehen Sie den Augenabstrich aus dem Schlauch und schwenken Sie die Spitze 2 Mal gegen den Innenschlauch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
   4. Halten Sie die Maus mit der Hand vorsichtig am Hals. Legen Sie mit der anderen Hand den Augentupfer gegen die mediale Bindehautregion des linken Auges, siehe Abbildung 2A. Drücken Sie den Augapfel leicht und bewegen Sie den Tupfer in einer Fensterwaschbewegung (Abbildung 2B) zwischen Unterlid und Auge 10 Mal hin und her. Halten Sie konstanten Druck aufrecht.
   5. Ohne das Fell zu berühren, entfernen Sie vorsichtig die Spitze des Tupfers senkrecht zur Stelle, an der sie eingeführt wurde, und legen Sie die Wattebauschenseite direkt nach unten in ein markiertes Mikrozentrifugenröhrchen mit BHI-Medien. Tragen Sie einen schmierenden Augentropfen auf das abgetupfte Auge auf.
   6. Bringen Sie die Maus in den Käfig zurück.
   7. Lassen Sie den Tupfer 10 bis 15 minuten auf Eis stehen und entfernen Sie den Augenabstrich mit der sterilisierten behandschuhten Hand, indem Sie die Spitze für 10 Umdrehungen in das Medium mischen. Ziehen Sie den Tupfer zurück, indem Sie die Spitze für 5 Umdrehungen gegen die Innenwand des Mikrozentrifugenrohrs schwenken. Entsorgen Sie den Tupfer in einem Biohazard-Behälter.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.7 für jede Maus und für Kontrollproben (Haut- oder Fellabstrich). Sterilisieren Sie die Handschuhe entsprechend zwischen jedem Tupfer.
4. Anreicherung
   1. Anreichern der Probe durch statische Inkubation des Röhrchens für 1 h bei 37 °C
   2. Während der Inkubation ein Trypticase-Soja bei Raumtemperatur mit 5% Schafsblut-Agarplatte (TSA-Platte) pro Maus beschriften und in zwei Hälften teilen.
   3. Nach der Inkubation der Augenabstrichkultur angereicherte Proben aus dem Inkubator entfernen und auf Eis legen.
   4. Kurz Wirbelproben zum Mischen und Platten gemäß dem Schema in Abbildung 3A. Aliquot 10 μL der Probe auf die TSA-Platte und kippen Sie die Platte, um einen Streifen zu bilden, wiederholen Sie 2 mal.
   5. Auf der anderen Seite der Trennlinie der Platte, Punkt 10 μL der Probe auf Agar, wiederholen Sie 9 mal.
   6. Inkubieren Sie Die Platten bei 37 °C für 18 h, 2 Tage und 4 Tage (in einer sauberen Kammer, die das Trocknen von Agarplatten verhindert). Zählen Sie Kolonien in Streifen, notieren Sie die Morphologie und berechnen Sie koloniebildende Einheiten (CFUs) pro Tupfer für morphologisch ähnliche Isolate. Schauen Sie sich Punkte für einzigartige Organismen an, die nicht in Streifen gefangen sind.

2. Hauptplatte, Charakterisierung und Identifizierung von Augenmikroben

1. Masterplatte
   1. Zeichnen Sie Gitter auf der Rückseite einer TSA-Platte (Abbildung 3B). Wählen Sie eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher von jeder Mausaugenabstrichplatte und streifen Sie das Hauptplattenquadrat (Gitter), das Etikettenraster mit kolonienummer und Mausinformationen. Wählen und tafeln Sie drei verschiedene Kolonien für jede morphologisch unterschiedliche Kolonie.
   2. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C. Setzen Sie die Inkubation für 96 Stunden fort und überprüfen Sie täglich das Auftreten neuer Isolate.
      HINWEIS: Die kommmensale Population variiert je nach Alter, Ernährung, Krankheitszustand und Käfigpraktiken der Maus. Die Isolatcharakterisierung basiert auf den vorherrschenden aeroben und fakultativen anaeroben Bakterien, die in unserem Labor gefunden werden.
2. Charakterisierung
   1. Duplizieren Sie¹³ Plattenmikroben auf Mannitol Salt Agar (MSA) und MacConkey (MAC) Platten, inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Beachten Sie das Wachstum für jedes Isolat und das Vorhandensein von wachsartigen Kolonien oder gelben Kolonien mit Halo auf MSA.
   2. Für grampositive Kokken mit dem Katalasetest^{13,14 testen.} Legen Sie einen Tropfen von 3% Wasserstoffperoxid auf einen sauberen Glasträger. Pflücken Sie mit einem sterilen Zahnstocher die entsprechende Mikrobe von der Augenabstrichplatte. Keine Blasenbildung deutet auf Streptococcus spp.hin, leichte Blasenbildung deutet auf Corynebacterium spp. und vielleicht Aerococcus spp. hin und schnelle Blasenbildung deutet auf Staphylococcus spp. hin.
3. Identifikation: MALDI-TOF MS Analyse
   HINWEIS: Die Identifizierung von Bakterien erfolgt über das MALDI-TOF und die Software-Datenbank. Dieses System verwendet matrixgestützte Laserdesorptionsionisationszeit-Flug-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) zur Entwicklung von Spektrenprofilen, die zur Identifizierung mit bekannten Bakterienspektren verglichen werden. E.coli, ATCC 8739, wird für die Systemkalibrierung verwendet.
   1. Plattenbakterienisolate auf TSA-Platten mit 5% Schafsblut und inkubieren über Nacht mit 5% Kohlendioxid bei 37 °C.
   2. Tragen Sie mit einer 1 μL-Schleife eine dünne Schicht der reinen Bakterien auf den MALDI-TOF-Zielträger auf. 1 μL MALDI-TOF MS CHCA-Matrixlösung (alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) wird überlagert und an der Luft trocknen gelassen, bevor der Objektträger in das MALDI-TOF-Instrument geladen wird.
   3. Jedes Isolat wird doppelt gesichtet.
   4. Berichte mit Wahrscheinlichkeitswerten von mehr als 80%, die auf einen hohen Diskriminierungswert hinweisen, werden als zuverlässige Ergebnisse akzeptiert und die bakterielle Identifizierung akzeptiert.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für eine Augenabstrichplatte, die verschiedene Methoden zur Beschichtung demonstriert, sind in Abbildung 3A dargestellt, die morphologisch unterschiedliche Isolate von C57BL/6-Maus zeigt. Für jedes einzelne Isolat wurden die Kolonien im Streifen gezählt und die relative Häufigkeit, einzigartige Colony Forming Units (CFUs) pro Augenabstrich, berechnet und zu Vergleichszwecken aufgezeichnet. Für die mikrobiologische Charakterisierung wurden Bakterien aus einzeln...

Diskussion

Aufgrund des paucibakteriellen Zustands der Augenoberfläche hatten viele Labore Schwierigkeiten, die okulären Kommensalen⁷,^20zuisolieren, was zu einer geringen Anzahl von Proben mit Wachstum, geringer Häufigkeit und geringer Diversität^{führte 8}. Diese Methode verbessert die Standardkulturpraktiken^4,21 erheblich durch die Hinzufügung eines Anreicherungsschritts sowie eines neu ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each