Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.

Résumé

La surface oculaire a été une fois considérée privilégiée et abiotique immunisée, mais récemment il s’affiche qu’il y ait une petite, mais persistante présence commensale. L’identification et la surveillance des espèces bactériennes au niveau de la muqueuse oculaire ont été difficiles en raison de leur faible abondance et de la disponibilité limitée de la méthodologie appropriée pour la croissance et l’identification commensales. Il existe deux approches standard : les méthodes de séquençage de l’ADN basées sur la culture ou les méthodes de séquençage de l’ADN. La première méthode est problématique en raison des bactéries récupérables limitées et la seconde approche identifie les bactéries vivantes et mortes conduisant à une représentation aberrante de l’espace oculaire. Nous avons développé une méthode robuste et sensible pour l’isolement bactérien en nous appuyant sur des techniques de culture microbiologique standard. Il s’agit d’une technique basée sur un écouvillon, utilisant un écouvillon mince « en laboratoire » qui cible la conjonctive inférieure, suivi d’une étape d’amplification pour les genres aérobies et anaérobies facultatifs. Ce protocole nous a permis d’isoler et d’identifier des espèces conjonctivales telles que Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. L’approche convient pour définir la diversité commensale chez les souris dans différentes conditions de maladie.

Introduction

Le but de ce protocole est d’améliorer l’isolement spécifique des microbes aérobies et anaérobies facultatifs viables et rares de la conjonctive oculaire pour caractériser le microbiome oculaire. Des études approfondies ont profilé les communautés muqueuses commensales sur la peau, l’intestin, les voies respiratoires et génitales et montrent que ces communautés influencent le développement du système immunitaire et la réponse^1,2,3. Il a été démontré que les communautés commensales oculaires changent au cours de certaines pathologies, telles que la sécheresse oculaire^4,le syndrome de Sjögren⁵ et le diabète^6. Pourtant, la capacité de définir une communauté commensale de surface oculaire typique est entravée par leur abondance relativement faible par rapport aux autres sites muqueux^6,7,8. Cela suscite une controverse sur l’existence d’un microbiome oculaire résident et, s’il existe, s’il diffère du microbiome cutané et, par conséquent, de son effet local sur le développement et la réponse du système immunitaire inné. Ce protocole peut aider à résoudre cette question.

Généralement, les approches pour définir la niche commensale oculaire sont basées sur des techniques de séquençage et de culture^4,7,9. Le séquençage de l’ADNr 16 S et l’analyse BRISK⁷ montrent une plus grande diversité que les techniques basées sur la culture, mais sont incapables de faire la différence entre les microbes vivants et morts. Étant donné que la surface oculaire est hostile à de nombreux microbes en raison des propriétés antimicrobiennes du film lacryptique^{4 générant} un large éventail de fragments d’ADN, les approches basées sur l’ADN détecteront ces artefacts qui peuvent biaiser les données vers l’identification des bactéries mortes en tant que commensaux résidents plutôt que contaminants. Il en résulte une identification et une caractérisation commensales aberrantes de l’espace oculaire comme étant plus élevées en abondance et en diversité microbles¹⁰. Il est donc difficile de définir le microbiome oculaire résident par des méthodes basées sur l’ADN. Considérant que les techniques standard basées sur la culture sont incapables de détecter les commensaux parce que la charge est trop faible¹¹. Notre méthode améliore les pratiques standard en utilisant un écouvillon mince qui peut cibler la conjonctive, évitant ainsi la contamination de la peau voisine, ainsi que le concept selon lequel les organismes viables peuvent être enrichis par une brève culture dans des milieux denses en nutriments dans le but de ressusciter viable mais non cultivable, ainsi que d’enrichir pour les microbes viables rares.

Les résultats, l’abondance relative des commensaux oculaires par écouvillonnage oculaire, caractérisent le microbiome résident de la conjonctive et sont importants à des fins de comparaison. Nos données montrent qu’il y a une différence entre la peau et le microbiote conjonctival, ainsi qu’une plus grande diversité avec l’âge et une différence d’abondance spécifique au sexe. De plus, cette approche a permis de trouver de manière reproductible des différences commensales chez les souris knock-out¹². Ce protocole peut être appliqué pour décrire le microbiome oculaire qui peut varier en raison des pratiques de mise en cage, de la géographie ou de l’état pathologique, ainsi que des effets locaux des métabolites et des produits commensaux sur le développement et la réponse du système immunitaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des souris suivent les lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux. Suivez les directives de sécurité du laboratoire (selon les directives de votre service d’intégrité et de sécurité environnementales en établissement) lorsque vous travaillez avec des micro-organismes et des matières potentiellement contaminées. Utiliser des récipients à déchets et des procédures de décontamination appropriés avant d’éliminer les matières potentiellement contaminées par des biorisques.

1. Préparation de l’écouvillonnage oculaire, mise en place du terrain de travail, écouvillonnage de l’œil de souris et enrichissement de l’échantillon

1. Préparer des écouvillons oculaires stériles
   REMARQUE: Les écouvillons stériles sont des cure-dents en bois finement enduits avec une fine couche de fibres de coton et fabriqués à l’interne.
   1. Autoclave quantité appropriée de lamation de coton et de cure-dents pour le nombre de souris à écouvillons.
   2. Pincez un morceau de coton d’un demi-centimètre de long avec le pouce et l’index. Taquinez la batte en tirant sur les bords avec les pouces et les index pour former une seule couche poreuse plate, en s’arrêtant juste avant que la batte ne s’effondre (de petits morceaux de coton dispersés dans la batte étirée sont acceptables).
   3. Faites pivoter la batte autour de l’une des extrémités pointues du cure-dent en maintenant légèrement la pièce étirée sur la pointe du cure-dent pendant qu’elle est tordue , voir la figure 1. L’écouvillonnage oculaire « terminé » aura une très fine couche de coton tendue sur la pointe, s’étendant sur environ un demi-centimètre à un centimètre de la pointe.
   4. Insérer les écouvillons « terminés » dans le petit bécher, l’écouvillon côté vers le bas et le couvercle. autoclave.
2. Configurer l’espace de travail
   1. Préparer une anesthésie contenant 2 mL de kétamine (100 mg/mL), 400 μL de xylazine (100 mg/ml) et 27,6 mL de solution saline stérile (NaCl à 0,9 % dans dH₂O) dans un tube de centrifugation stérile de 50 mL. Stériliser le filtre et aliquoter l’anesthésie pour une utilisation immédiate (peut être conservé à 4 °C pendant 1 mois; toujours laisser s’équilibrer à la température ambiante avant l’utilisation).
   2. Nettoyez et nettoyez l’aire de travail avec du désinfectant pour minimiser la contamination.
   3. Aliquote 0,5 mL de milieu stérile d’infusion de cœur de cerveau (BHI) dans des tubes de microcentrifugation stériles étiquetés de 1,5 mL (1 tube par souris et témoin); disposer en rack microcentrifuge. Placez le rack sur la glace.
   4. Configurez le flux de travail comme suit (de gauche à droite) : station d’anesthésie de souris (cage contenant des souris expérimentales, cage stérile vide, anesthésie à température ambiante, aiguille de 25 G et seringue de 1 ml), station d’écouvillonnage des yeux (BHI aliquoted sur glace, écouvillons stériles, serviettes en papier propre, pulvérisation d’isopropanol à 70 %) et station de placage (plaques de gélose au sang à température ambiante, pipette de 10 μL , 10 μL de décharges stériles jetables, contenant de déchets à biorisque).
3. Écouvillonnage
   1. Administrer 10 μL d’anesthésie par 1 g de dose de kétamine et de xylazine respectivement par voie intrapéritonéale à chaque souris adulte et placer dans une cage autoclavée. Tester l’anesthésie en serrant le coussinet du pied arrière; aucun mouvement n’indique une anesthésie appropriée.
   2. Assignez une main pour ne manipuler que les souris anesthésiées et l’autre main pour ne manipuler que l’écouvillon oculaire et la culture. Pour l’écouvillonnage, retirez la souris entièrement anesthésiée de la cage; placer sur le dessus de la surface de travail propre positionnée sur son côté avec l’œil gauche exposé. Vaporisez les mains gantées avec de l’isopropanol, sec avec une serviette en papier propre.
   3. Uncap spécifiquement étiqueté tube micro-centrifugeuse BHI avec main de manipulation de support dédiée. Replacez le tube dans le rack de micro-centrifugeuse sur de la glace.  Trempez la pointe enduite de coton de l’écouvillon dans BHI, retirez l’écouvillon oculaire du tube en faisant tourbillonner la pointe 2 fois contre la chambre à air pour éliminer l’excès de liquide.
   4. Avec la main de manipulation de la souris, tenez doucement la souris par la peau du cou. D’autre part, placez le bout de l’écouvillon contre la région conjonctivale médiale de l’œil gauche, voir la figure 2A. Relâchez légèrement le globe oculaire et déplacez l’écouvillon dans un mouvement de lavage de fenêtre(figure 2B)d’avant en arrière, entre la paupière inférieure et l’œil, 10 fois. Maintenez une pression constante.
   5. Sans toucher la fourrure, retirez délicatement la pointe de l’écouvillon, perpendiculairement à l’endroit où elle a été insérée, et placez le côté coton-tige de l’écouvillon directement dans un tube à micro-centrifugeuse étiqueté contenant un milieu BHI. Appliquez une goutte oculaire lubrifiante sur l’œil écouvillonné.
   6. Retournez la souris dans la cage.
   7. Laissez reposer l’écouvillon pendant 10 à 15 min sur de la glace et retirez l’écouvillonnage avec la main gantée stérilisée en mélangeant la pointe dans le support pendant 10 rotations. Retirer l’écouvillon en faisant tourbillonner la pointe contre la paroi interne du tube de micro-centrifugeuse pendant 5 rotations. Jetez l’écouvillon dans un contenant de biorisque.
   8. Répéter les étapes 1.3.2 à 1.3.7 pour chaque souris et pour les échantillons témoins (écouvillonnage de peau ou de fourrure). Stérilisez les gants de manière appropriée entre chaque écouvillon.
4. enrichissement
   1. Enrichir l’échantillon en incubant le tube statiquement pendant 1 h à 37 °C
   2. Pendant l’incubation, étiquetez une trypticase à température ambiante Soja avec 5% de plaque de gélose sanguine de mouton (plaque TSA) par souris et divisez-la en deux.
   3. Après l’incubation de la culture par écouvillonnage oculaire, retirer les échantillons enrichis de l’incubateur et les placer sur de la glace.
   4. Brièvement des échantillons de vortex à mélanger et à plaquer selon le schéma de la figure 3A. Aliquote 10 μL de l’échantillon sur la plaque TSA et incliner la plaque pour former une bande, répéter 2 fois.
   5. De l’autre côté de la ligne de séparation de la plaque, point 10 μL d’échantillon sur gélose, répéter 9 fois.
   6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 h, 2 jours et 4 jours (dans une chambre propre qui empêche les plaques de gélose de sécher). Comptez les colonies en bandes, notez la morphologie et calculez les unités formant colonies (UFC) par écouvillon pour les isolats morphologiquement similaires. Regardez les points pour les organismes uniques qui ne sont pas capturés dans des bandes.

2. Plaque maîtresse, caractérisation et identification des microbes oculaires

1. Plaque maîtresse
   1. Dessinez des grilles à l’arrière d’une plaque TSA (Figure 3B). Choisissez une colonie avec un cure-dent stérile dans chaque plaque d’écouvillonnage des yeux de souris et stries le carré de la plaque maîtresse (grilles), étiquetez la grille avec le numéro de colonie et les informations sur la souris. Choisissez et plaquez trois colonies différentes pour chaque colonie morphologiquement distincte.
   2. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 °C. Poursuivre l’incubation pendant 96 heures, en vérifiant quotidiennement l’apparition de nouveaux isolats.
      REMARQUE: La population commensale variera en fonction de l’âge de la souris, de la nutrition, de l’état de la maladie et des pratiques de mise en cage. La caractérisation des isolats est basée sur les bactéries anaérobies aérobies et facultatives prédominantes trouvées dans notre laboratoire.
2. caractérisation
   1. Dupliquer¹³ microbes sur les plaques de gélose au sel de mannitol (MSA) et de MacConkey (MAC), incuber pendant la nuit à 37 °C. Notez la croissance pour chaque isolat et la présence de colonies cireuses ou de colonies jaunes avec halo sur MSA.
   2. Pour les cocci Gram positif, test avec le test de catalase^13,14. Placez une goutte de peroxyde d’hydrogène à 3% sur une lame de verre propre. À l’aide d’un cure-dent stérile, choisissez le microbe correspondant dans la plaque d’écouvillonnage oculaire. Aucune formation de bulles n’indique Streptococcus spp.,une légère formation de bulles indique Corynebacterium spp. et peut-être Aerococcus spp. et la formation rapide de bulles indique Staphylococcus spp.
3. Identification : Analyse maldi-tof ms
   REMARQUE: Les identifications bactériennes sont effectuées à l’aide du MALDI-TOF et de la base de données logicielle. Ce système utilise la spectrométrie de masse à ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) pour développer des profils de spectres qui sont comparés aux spectres bactériens connus pour l’identification. E.coli, ATCC 8739, est utilisé pour l’étalonnage du système.
   1. Plaquer les isolats bactériens sur les plaques de TSA contenant 5% de sang de mouton et incuber pendant la nuit avec 5% de dioxyde de carbone à 37 °C.
   2. À l’aide d’une boucle de 1 μL, appliquez une fine couche de bactéries pures sur la lame cible MALDI-TOF; 1 μL de solution matricielle MALDI-TOF MS CHCA (acide alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) est superposée et laissée sécher complètement à l’air avant de charger la lame dans l’instrument MALDI-TOF.
   3. Chaque isolat est repéré en double.
   4. Les rapports contenant des scores de probabilité supérieurs à 80%, qui indiquent une valeur de discrimination élevée, sont acceptés comme des résultats fiables et l’identification bactérienne acceptée.

Résultats

Des résultats représentatifs pour une plaque d’écouvillonnage montrant différentes méthodes de placage sont illustrés à la figure 3A montrant des isolats morphologiquement divers de souris C57BL/6. Pour chaque isolat distinct, les colonies ont été comptées dans la bande et l’abondance relative, unités formant colonies (UFC) uniques par écouvillonnage oculaire, a été calculée et tracée à des fins de comparaison. Pour la caractérisation microbiologique, les bactéries ont...

Discussion

En raison de l’état paucibactérien de la surface oculaire, de nombreux laboratoires ont eu du mal à isoler les commensaux oculaires^7,20,ce qui a entraîné un faible nombre d’échantillons avec croissance, une faible abondance et une faible diversité^8. Ce procédé améliore significativement les pratiques de culture standard^4,21 par l’ajout d’une étape d’enrichissem...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each