Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.

Resumo

A superfície ocular já foi considerada imuno-privilegiada e abiótica, mas recentemente parece que há uma pequena, mas persistente presença commensal. A identificação e o monitoramento de espécies bacterianas na mucosa ocular têm sido desafiadores devido à sua baixa abundância e disponibilidade limitada de metodologia adequada para crescimento e identificação commensais. Existem duas abordagens padrão: métodos de sequenciamento de cultura ou sequenciamento de DNA. O primeiro método é problemático devido às bactérias recuperáveis limitadas e a segunda abordagem identifica bactérias vivas e mortas levando a uma representação aberrante do espaço ocular. Desenvolvemos um método robusto e sensível para o isolamento bacteriano, baseando-se em técnicas de cultivo microbiológico padrão. Trata-se de uma técnica baseada em swab, utilizando um cotonete fino "em laboratório" que visa a conjuntiva inferior, seguido por um passo de amplificação para genera aeróbico aeróbico e facultativo. Este protocolo nos permitiu isolar e identificar espécies conjuntivistas como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp. A abordagem é adequada para definir a diversidade commensal em camundongos em diferentes condições de doença.

Introdução

O objetivo deste protocolo é aumentar o isolamento específico de micróbios aeróbicos e anaeróbicos viáveis e facultativos da conjuntiva ocular para caracterizar o microbioma ocular. Estudos extensivos têm perfilado comunidades mucosas commensais nos tratos da pele, intestino, respiratório e genital e mostram que essas comunidades influenciam o desenvolvimento do sistema imunológico e a resposta^1,2,3. Comunidades commensais oculares têm sido demonstradas para mudar durante certas patologias da doença, como doença do olho seco⁴, síndrome de Sjogren⁵ e diabetes⁶. No entanto, a capacidade de definir uma comunidade típica de superfície ocular commensal é dificultada por sua abundância relativamente baixa em comparação com os outros sítios mucosas^6,7,8. Isso gera controvérsia sobre se existe um microbioma ocular residente e se ele existe, se ele difere do microbioma da pele e, consequentemente, seu efeito local sobre o desenvolvimento e resposta do sistema imunológico inato. Este protocolo pode ajudar a resolver essa questão.

Geralmente, as abordagens para definir o nicho commensal ocular baseiam-se no sequenciamento e nas técnicas baseadas na cultura^4,7,9. 16 S rDNA sequenciamento e análise BRISK⁷ mostram uma diversidade mais ampla do que as técnicas baseadas na cultura, mas são incapazes de diferenciar entre micróbios vivos e mortos. Uma vez que a superfície ocular é hostil a muitos micróbios devido às propriedades antimicrobísis do filme lacrimal⁴ gerando uma grande variedade de fragmentos de DNA, abordagens baseadas em DNA detectarão esses artefatos que podem distorcer os dados para identificação de bactérias mortas como commensais residentes em vez de contaminantes. Isso resulta na identificação e caracterização aberrante do espaço ocular como sendo maior em abundância de micróbios e diversidade¹⁰. Isso dificulta a definição do microbioma ocular residente através de métodos baseados em DNA. Considerando que as técnicas padrão baseadas na cultura são incapazes de detectar commensais porque a carga é muito baixa¹¹. Nosso método melhora as práticas padrão usando um cotonete fino que pode atingir a conjuntiva, evitando assim a contaminação da pele vizinha, bem como o conceito de que organismos viáveis podem ser enriquecidos por uma breve cultura em meios densos de nutrientes com o objetivo de ressuscitar viável, mas não cultural, bem como, enriquecer para micróbios viáveis raros.

Os resultados, abundância relativa de commensais oculares por cotonete ocular, caracterizam o microbioma residente conjuntiva e são importantes para fins comparativos. Nossos dados mostram que há uma diferença entre a pele e a microbiota conjuntivival, bem como maior diversidade com aumento da idade e diferença de sexo específico em abundância. Além disso, essa abordagem tem encontrado diferenças commensais em camundongos^{nocautes 12}. Este protocolo pode ser aplicado para descrever o microbioma ocular que pode variar devido a práticas de caging, geografia ou estado de doença, bem como os efeitos locais de metabólitos commensais e produtos sobre desenvolvimento e resposta do sistema imunológico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo camundongos seguem as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais. Siga as diretrizes de segurança laboratorial (conforme orientado pelo departamento de Saúde e Segurança Ambiental Institucional) ao trabalhar com microrganismos e materiais potencialmente contaminados. Utilize recipientes de resíduos adequados e procedimentos de descontaminação antes do descarte de materiais contaminados potencialmente de risco biológico.

1. Preparação do cotonete de olhos, configuração de campo de trabalho, limpeza de olhos de rato e enriquecimento de amostras

1. Prepare cotonetes estéreis nos olhos
   NOTA: Os cotonetes estéreis são palitos de dente de madeira finamente revestidos com uma fina camada de fibra de algodão e feitos em casa.
   1. Autoclave quantidade apropriada de rebatidas de algodão e palitos de dente para o número de ratos a serem esfregados.
   2. Belisque um pedaço de algodão de meio centímetro de comprimento batendo com polegar e dedo indicador. Provoque rebater puxando as bordas com polegares e dedos indicadores para formar uma camada porosa única plana, parando pouco antes do rebatedor desmoronar (pequenos pedaços de algodão dispersos ao longo do rebatedor esticado são aceitáveis).
   3. Gire o rebatedor em torno de uma das extremidades afiadas do palito segurando levemente a peça esticada na ponta do palito enquanto é torcida, veja Figura 1. O cotonete "completo" terá uma camada muito fina de algodão estendida sobre a ponta, estendendo-se aproximadamente meio a um centímetro de distância da ponta.
   4. Insira cotonetes "completos" em béquer pequeno, cotonete lateral para baixo e cubra. autoclave.
2. Configure o espaço de trabalho
   1. Prepare anestesia contendo 2 mL de cetamina (100 mg/mL), 400 μL de xilazina (100 mg/ml) e 27,6 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl em dH₂O) em um tubo estéril de centrífuga estéril de 50 mL. Filtrar esterilizar e aliquot anestesia para uso imediato (pode ser armazenado a 4 °C por 1 mês; sempre permitir o equilíbrio à temperatura ambiente antes do uso).
   2. Limpe e limpe a área de trabalho com desinfetante para minimizar a contaminação.
   3. Alíquota de 0,5 mL de mídia estéril de infusão cardíaca cerebral (BHI) em tubos de microcentrifuge estéreis de 1,5 mL (1 tubo por rato e controle); organizar em rack microcentrifuge. Coloque o rack no gelo.
   4. Configurar o fluxo de trabalho da seguinte forma (da esquerda para a direita): estação de anestesia do rato (gaiola contendo ratos experimentais, gaiola estéril vazia, anestesia de temperatura ambiente, agulha de 25 G e seringa de 1 mL), estação de cotonização dos olhos (BHI aliquoted no gelo, cotonetes oculares esterilizados, toalhas de papel limpas, 70% spray de isopropanol) e estação de revestimento (placas de ágar de sangue de temperatura ambiente, 10 μL pipeta , 10 μL pontas descartáveis estéreis, recipiente de resíduos de risco biológico).
3. Eye swabbing
   1. Administre 10 μL de anestesia por 1 g de dosagem de peso do rato de cetamina e xilazina, respectivamente, intraperitoneal para cada rato adulto e coloque em uma gaiola autoclavada. Testar a anestesia apertando a almofada de pé traseiro; nenhum movimento indica anestesia apropriada.
   2. Atribua uma mão apenas para manusear camundongos anestesiados e a outra mão para apenas manusear o cotonete dos olhos e a cultura. Para limpar, remova o rato totalmente anestesiado da gaiola; colocar em cima da superfície de trabalho limpo posicionado do seu lado com o olho esquerdo exposto. Spray mãos enluvadas com isopropanol, seco com papel toalha limpa.
   3. Uncap especificamente rotulado bhi micro-centrífuga tubo com mão de manuseio de mídia dedicada. Coloque o tubo de volta no rack de microcrífugas no gelo.  Mergulhe a ponta revestida de algodão do cotonete dos olhos em BHI, retire o cotonete do tubo girando a ponta 2 vezes contra o tubo interno para remover o excesso de líquido.
   4. Com a mão manuseando o mouse, segure suavemente o mouse pelo escroto do pescoço. Por outro lado, coloque a ponta do cotonete dos olhos contra a região de conjuntivival medial do olho esquerdo, veja Figura 2A. Deprimir levemente o globo ocular e mover o cotonete em um movimento de lavagem da janela(Figura 2B) para frente e para trás, entre a pálpebra inferior e o olho, 10 vezes. Mantenha a pressão constante.
   5. Sem tocar na pele, remova suavemente a ponta do cotonete, perpendicular para onde foi inserido, e coloque o lado do algodão do cotonete diretamente em um tubo de microcrédito rotulado contendo mídia BHI. Aplique um colírio lubrificante no olho esfregado.
   6. Devolva o rato para a gaiola.
   7. Deixe o cotonete ficar por 10 a 15 minutos no gelo e remova o cotonete dos olhos com a mão de luva esterilizada misturando a ponta na mídia para 10 rotações. Retire o cotonete girando contra a parede interna do tubo de microcrífugas para 5 rotações. Descarte o cotonete em recipiente de risco biológico.
   8. Repita as etapas 1.3.2 a 1.3.7 para cada rato e para amostras de controle (swab de pele ou pele). Esterilize as luvas apropriadamente entre cada cotonete.
4. enriquecimento
   1. Enriqueça a amostra incubando o tubo estaticamente por 1 h a 37 °C
   2. Durante a incubação, rotule uma soja de tripática de temperatura ambiente com 5% de placa de ágar de ovelha (placa TSA) por rato e divida ao meio.
   3. Após a incubação da cultura do cotonete dos olhos, remova amostras enriquecidas da incubadora e coloque no gelo.
   4. Brevemente amostras de vórtice para misturar e chapa de acordo com o esquema na Figura 3A. Alíquota 10 μL da amostra na placa TSA e inclinar a placa para formar uma tira, repita 2 vezes.
   5. Do outro lado da linha divisória da placa, pontuem 10 μL de amostra no ágar, repita 9 vezes.
   6. Incubar placas a 37 °C durante 18h, 2 dias e 4 dias (em uma câmara limpa que impede a secagem das placas de ágar). Conte colônias em tiras, note morfologia e calcule unidades de formação de colônias (UFC) por cotonete para isolados morfologicamente semelhantes. Olhe para pontos para organismos únicos não capturados em tiras.

2. Placa de mestre, caracterização e identificação de micróbios oculares

1. Placa principal
   1. Desenhe grades na parte de trás de uma placa TSA(Figura 3B). Escolha uma colônia com um palito estéril de cada placa de cotonete de olho do rato e listrar o quadrado da placa principal (grades), grade de etiqueta com número de colônia e informações do rato. Escolha e emplaque três colônias diferentes para cada colônia morfologicamente distinta.
   2. Incubar a placa durante a noite a 37 °C. Continue a incubação por 96 horas, verificando diariamente o aparecimento de novos isolados.
      NOTA: A população commensal vai variar de acordo com a idade do camundongo, nutrição, estado da doença e práticas de caging. A caracterização isolada baseia-se nas bactérias anaeróbicas aeróbicas e facultativas predominantes encontradas em nosso laboratório.
2. caracterização
   1. Duplicar¹³ micróbios de placas de Mannitol Salt Agar (MSA) e MacConkey (MAC), incubar durante a noite a 37 °C. Observe o crescimento para cada isolado e presença de colônias ceradas ou colônias amarelas com halo em MSA.
   2. Para Gram positivo cocci, teste com o teste de catalase^13,14. Coloque uma gota de 3% de peróxido de hidrogênio em uma lâmina de vidro limpa. Usando um palito estéril, escolha o micróbio correspondente da placa do cotonete dos olhos. Nenhuma formação de bolha indica Streptococcus spp., formação de bolhas leves indica Corynebacterium spp. e talvez Aerococcus spp. e formação rápida de bolhas indica Staphylococcus spp.
3. Identificação: Análise MALDI-TOF MS
   NOTA: As identificações bacterianas são realizadas utilizando o MALDI-TOF e o Banco de Dados de Software. Este sistema emprega o tempo de desorção a laser assistido por matriz da espectrometria de massa de voo (MALDI-TOF MS) para o desenvolvimento de perfis de espectros que são comparados com espectros bacterianos conhecidos para identificação. E.coli, ATCC 8739, é usado para calibração do sistema.
   1. A placa bacteriana isola em placas TSA contendo 5% de sangue de ovelha e incubam durante a noite com 5% de dióxido de carbono a 37 °C.
   2. Usando um loop de 1 μL, aplique uma camada fina das bactérias puras no slide de destino MALDI-TOF; 1 μL de solução matricial MALDI-TOF MS CHCA (ácido alfa-cyano-4-hidroxicinâmico) é sobreposta e permitido secar completamente antes de carregar o slide no instrumento MALDI-TOF.
   3. Cada isolado é visto em duplicata.
   4. Relatórios contendo escores de probabilidade superiores a 80%, que indicam um alto valor de discriminação, são aceitos como resultados confiáveis e a identificação bacteriana aceita.

Resultados

Os resultados representativos para uma placa de cotonete dos olhos que demonstram diferentes métodos de chapeamento são retratados na Figura 3A mostrando isolados morfologicamente diversos do mouse C57BL/6. Para cada isolado distinto, as colônias foram contadas na faixa e a abundância relativa, unidades de formação de colônias únicas (UFC) por cotonete de olhos, calculadas e plotadas para fins de comparação. Para caracterização microbiológica, as bactérias foram colhidas a part...

Discussão

Devido ao estado paucibacteriano da superfície ocular, muitos laboratórios têm tido dificuldade em isolar as commensals oculares^7,20, resultando em baixo número de amostras com crescimento, baixa abundância e baixa diversidade⁸. Este método melhora significativamente as práticas de cultura padrão^4,21 pela adição de uma etapa de enriquecimento, bem como um cotonete ocular ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 to 10 µl pipet tip	USA Scientific	1110-300	autoclave before use
0.5 to 10 µl Eppendorf pipet	Fisher Scientific	13-690-026
1 ml syringe	Fisher Scientific	BD309623	1 syringe for each eye swab group
1.5 ml Eppendorf tubes	USA Scientific	1615-5500	autoclave before use
1000 µ ml pipet tip	USA Scientific	1111-2021	autoclave before use
200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000)	Fisher Scientific	F123602G
25 G needle	Fisher Scientific	14-826AA	1 needle per eye swab group
3 % Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	S25359
37 ° C Incubator	Lab equipment
70 % Isopropanol	Fisher Scientific	PX1840-4
Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml)	Santa Cruz Animal Health	SC-362949Rx
BD BBL Gram Stain kit	Fisher Scientific	B12539
Bunsen Burner	Lab equipment
Clean paper towels	Lab equipment
Cotton Batting/Sterile rolled cotton	CVS
Disposable 1 ml Pipets	Fisher Scientific	13-711-9AM	for Gram stain and catalase tests
E.coli	ATTC	ATCC 8739
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	for Gram stain and catalase tests
Ketamine (100mg/ml)	Henry Schein	9950001
Mac Conkey Agar Plates	Fisher Scientific	4321270	store at 4 °C until ready to use
Mannitol Salt Agar	Carolina Biological Supply	784641	Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week
Mice	Jackson Labs	C57/BL6J
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-12	for Mannitol Salt agar plates
RPI Brain Heart Infusion Media	Fisher Scientific	50-488525	prepare according to directions and autoclave
SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	to sterilize anesthesia
Sterile Corning Centrifuge Tube	Fisher Scientific	430829	anesthesia preparation
Sterile mouse cage	Lab equipment
Tooth picks (round bamboo)	Kitchen Essentials		autoclave before use and swab preparation
Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates	Fisher Scientific	4321261	store at 4 °C until ready to use
Vitek target slide	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS	BioMerieux Inc. Durham,NC
Vitek-MS CHCA matrix solution	BioMerieux Inc. Durham, NC	411071
Single use eye drops	CVS Pharmacy		Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each