在Vivo CRISPR/Cas9筛查中同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

摘要

在这里，我们描述了一种快速和直接的体内CRISPR/Cas9筛查方法，使用超声波引导子宫胚胎扁平注射，同时评估几个基因在皮肤和免疫能力小鼠口腔的功能。

摘要

转基因小鼠模型 （GEMM） 在评估基因功能、模拟人类疾病以及作为临床前模型评估治疗途径方面发挥了重要作用。然而，它们的时间、劳动和成本密集型性质限制了它们对基因功能进行系统分析的效用。基因组编辑技术的最新进展克服了这些限制，并允许以多路复用和快速的方式在特定小鼠器官内快速生成特定的基因扰动。在这里，我们描述了一种基于CRISPR/Cas9的方法（聚集定期间歇短脑重复），在小鼠皮肤和口腔的上皮产生数千个基因敲除克隆，并提供一个协议，详细说明   在肿瘤抑制基因的直接体内CRISPR屏幕执行必要的步骤。这种方法可以应用于其他器官或其他CRISPR/Cas9技术，如CRISPR激活或CRISPR灭活，以研究基因在组织失落期间或在各种疾病环境中的生物功能。

引言

后基因组时代癌症研究面临的挑战之一是挖掘因果基因突变的大量基因组数据，并识别基因网络中可以针对治疗的节点。虽然生物信息分析对实现这些目标大有帮助，但建立有效的体外和体内模型是破译生物系统和疾病状态的复杂性和促进药物开发的先决条件。虽然传统的转基因小鼠模型在体内癌症遗传学研究中被广泛使用，但其成本、时间和劳动密集型性质在很大程度上禁止了对现代基因组学解开的数百个假定癌症基因的系统分析。为了克服这一瓶颈，我们结合了先前建立的子宫内注射方法^1，2的超声波引导与CRISPR/Cas9（聚集定期间歇短巴林德罗米重复）基因编辑技术^3，同时诱导和研究数百个基因在皮肤和单只小鼠口腔的功能丧失突变。

此处描述的方法利用工程扁豆病毒的超声波引导注射到胚胎日E9.5活小鼠胚胎的羊水腔中。含有CRISPR/Cas9成分的扁桃体货物会转导单层表面等体，后者后来导致皮肤和口腔的上皮。皮肤由外表皮组成，其次是地下室膜和真皮。表皮是一种分层上皮，由内基层组成，与地下膜保持接触，具有增殖和干细胞能力。基底层产生上面的分化层，如旋转层、颗粒层和地层角膜层^2、4。血统追踪研究表明，这种直接在体内CRISPR/Cas9方法基因操纵组织驻存干细胞在基底层，持续整个成年。由于扁豆病毒可以滴定以在克隆密度下转导E9.5表面细胞，因此这种方法可用于生成含有数千个离散基因克隆的马赛克小鼠。然后，下一代测序可用于以多路复用的方式分析CRISPR/Cas9介质基因消融在这些克隆中的影响^。

我们最近使用这种方法评估了484个基因的功能，这些基因显示人类头部和颈部鳞状细胞癌（HNSCC）5的反复突变。HNSCC是一种毁灭性的癌症，死亡率高达40-50%，是全世界^第6大最常见的癌症^。HNSCC 出现在上气道或口腔的粘膜衬里中，与烟草和酒精消费或人类瘤病毒（ HPV ）感染有关。皮肤鳞状细胞癌（SCC）是皮肤肿瘤，是人类第二常见的癌症^。角质SCC和HNSCC在病理学和分子学上非常相似，在TP53、PIK3CA、NOTCH1和HRAS⁸中出现改变的病例比例很高。虽然只有少数基因在高频下发生变异，但有数百个基因在低频下发生变异（+lt;5%），这种现象通常被称为长尾分布。由于大多数长尾基因缺乏生物或临床验证，我们利用这种体内CRISPR筛选技术，在p53、Pik3ca或Hras中具有敏感突变的肿瘤易发小鼠中模拟这些基因的功能丧失，并发现了几个与p53、Pik3ca或Hras合作的新型肿瘤抑制基因，以触发肿瘤发育^5。

在这里，我们描述了一个详细的协议，以产生多路sgRNA扁平CRISPR sgRNA库，并在鼠标表面等体中执行CRISPR/Cas9基因敲除屏幕。值得注意的是，这种方法可以应用于整合其他基因操作技术，如CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR灭活（CRISPRi），或修改为针对小鼠的其他器官系统来研究基因功能。

研究方案

该协议是根据多伦多大学的IACUC批准和执行的。

1. 集合的CRISPR库的设计和克隆

1. 选择 4-5 sgRNA，从资源中针对感兴趣的鼠标基因，如博德研究所 sgRNA 设计器 （https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design） 或 CHOPCHOP 服务器 （https://chopchop.cbu.uib.no）。从 Sanjana 等⁹ 中选择同等数量的非目标 sgRNA，以生成同样大小的非目标控制 gRNA 库。
2. 在构建 sgRNA 库时，确保目标器官系统中每个 sgRNA 的覆盖范围足够。对于小鼠皮肤，E9.5的表皮是一个包含约150，000个细胞的单层，其中大多数具有干细胞容量^4。如果扁豆病毒转导导致15-20%的感染，只有18，000-24，000个细胞将在E9.5被转化。相应地扩展实验。
3. 对于这些sgRNA库的克隆和放大，添加BSmBI酶限制位点以及引物结合DNA序列到sgRNA的5'和3'末端，并订购由此产生的全长寡头作为池聚寡核苷酸芯片（图1A）。
   1. 要在一个芯片上复用不同的库，添加库特定的引物序列。
   2. 使用适当的引物对，将每个库与池中的寡头芯片分开放大。在 PCR 管中，混合 25 μL 的 2 倍聚合酶主混合、20μL 的 DNase/RNase 无水、5 ng 的寡头芯片 DNA、2.5 μL 的适当前向引物和 2.5 μL 的适当反向引物。使用 12-15 个周期，放大 98 °C 变性、63-67 °C 退化、72 °C 扩展参数，用于 PCR 机器中的每个周期。
   3. 使用凝胶脱氧核糖核酸清理套件在 2.5% 的蔗糖凝胶上运行 PCR 产品，并净化 +100 bp PCR 产品。
4. 准备骨干质粒。
   1. 文摘 5 μg 的 Cre-重组酶含有 pLKO-Cre 馅料 v3 质粒，在 50 μL 反应组合中含有 2 μL BsmBI，在 55 °C 时 1 小时，然后根据制造商的说明在 37 °C 下 45 分钟进行 1μL 的碱性磷酸酶孵化。
      注:含有pLKO-Cre馅料v3质粒的Cre-重组酶是一种基于扁豆病毒的质粒，含有Cre-重组酶酶，可去除小鼠细胞中的Lox-Stop-Lox盒式磁带，并具有U6促进器来驱动sgRNA和tracrRNA的表达。具有 Cas9 和无 Cas9 的版本可在添加基因#158030和#158031上使用和提供。
   2. 在 1% 的蔗糖凝胶上运行消化的 DNA，并使用凝胶脱氧核糖核酸清理试剂盒净化 7 kb 线性载体带。值得注意的是，2 kb 的填充带也应该可见，表示成功消化。
5. 设置套接反应以生成 sgRNA 质粒库。
   1. 将 1μg 纯化载体和 30 ng 纯化 PCR 插入与 2 μL BsmBI、5 μL T4 DNA 韧带、10μM ATP 和 BsmBI 特有的 1 倍缓冲器混合。在 37 °C 的夜间孵化配对组合。 使用包含上述所有材料的额外管子（PCR 插入物除外）作为负控件。
   2. 第二天早上，使用寡头清理套件净化连带混合，并在 7 μL 的 RNase/DNase 无水中稀释。
6. 将库电波化为称职的单元格。
   1. 在冰上预冷的凹痕（1.0毫米）中，将2μL的eled sgRNA库或负控制配合混合物添加到25μL解冻的电能细胞中。按照制造商的协议（10μF，600欧姆，1800伏特）。在脉冲的10s内加入975μL的恢复介质（或STC介质）。
   2. 将电波细胞转移到培养管中，在300转/分的细菌摇动孵化器中以37°C孵育一小时。
7. 估计每个 sgRNA 的转化效率和库覆盖范围。
   1. 通过将含有用 sgRNA 库电化或负控制粘合的细胞的转化反应的 10μL 传输到 990 μL 的恢复介质并很好地混合，准备 100 倍稀释。
   2. 稀释转化混合物的板 10 μL 到预热 10 厘米 LB + 安非他林 （100 μg/L） agar 板上。这会导致变压器的 10，000 倍稀释，并使用此板来计算转换效率。在 30 °C 下进行 14–16 h 的板的孵化。
8. 通过在每盘共 10 个预热 15 厘米 LB + 安非他林 agar 板上铺上 100 μL 的回收细胞来平展其余的转化反应。在 30 °C 时将板孵化为 14–16 h。 值得注意的是，30 °C 的生长将病毒质粒中的两个长终端重复之间的重组降至最低。
9. 要评估克隆的成功率，计算转化效率。计算稀释板上含有来自 sgRNA 库或负控制结边的变形金刚的菌落数量（10 厘米板，步骤 1.8.2）。负控制组合不应有任何或只有极少数的殖民地。为了获得殖民地总数，将殖民地数量乘以10，000个殖民地。
   注:计算的殖民地总数表示每个 sgRNA 的图书馆覆盖率应至少为 200 倍。
   1. 确保拥有 2000 个 sgRNA 的图书馆将拥有至少 400，000 个殖民地。如果没有足够的殖民地，重复和设置更多的电波。
10. 质量控制:从稀释板中挑选20个菌落，并将每个菌落添加到包含3毫升LB介质+安非他林的单独培养管中。在 30 °C 的摇晃下在 250 rpm 上连夜孵化所有 20 根管子。使用迷你准备套件根据制造商的说明和桑格序列净化质粒DNA，所有 20 个质粒脱氧核糖核酸样本使用 U6 引物（5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATT ATT CC-CC-3'）验证每个样本具有不同的 sgRNA 序列。
11. 从每个15厘米的盘子中收获殖民地。
    1. 添加 7 毫升的 Lb 介质， 然后用细胞扩散器刮掉 Lb Agar 板上的菌落。使用 10 毫升移液器将细胞转移到 2 升无菌圆锥形烧瓶中。重复所有板和池细菌在2 L烧瓶。在 30 °C 下将烧瓶孵化 2-3 小时摇晃。 离心文化，收集颗粒。
    2. 使用 maxi-质粒净化套件净化质粒脱氧核糖核酸。
12. 其他质量控制:使用 1 ng 的 maxi-prep sgRNA 库质粒DNA，并根据制造商的说明使用下一代测序引物运行 PCR 反应。图书馆中所有 sgRNA 的表示可以通过深度测序平台进行验证。

2. 生产适合体内转导的高滴定扁豆病毒

注意:在 BSL2+ 设施中执行协议本节中的所有步骤，该设施位于 A2 类生物安全柜中。293FT，特别是293NT包装细胞允许更高的病毒生成。使用低通道 （+lt:p20） HEK293T、293FT 或 293NT 细胞进行转染。预热所有媒体到37°C。 绝不允许 HEK293T、293FT 或 293NT 细胞在亚文化时汇合。在 G418 面前生长 293FT，以保持 SV40 大型 T 抗原的表达。

1. 准备病毒包装细胞。
   1. 第 1 天，6 个聚 L-lysine 上的板 HEK293T 细胞涂层 15 厘米板，在生长介质中 35% 的汇合度（DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素抗生素溶液 （w/v））。在37°C，5%CO₂的夜间孵化细胞。
   2. 一旦镀金细胞是70-80%的汇合和均匀分布，替换生长介质25 mL的血清和无抗生素的DMEM介质。
   3. 喂食时将介质缓慢地添加到烧瓶的侧面，因为 HEK293T 和 293NT 细胞可以很容易地从组织培养塑料中分离出来
2. 准备传输组合。
   1. 加入 65μg 的扁平包装质粒 psPAX2、43μg 的 VSV-G 表达信封质粒 pMD2.G、65 微克 sgRNA 库质粒和 240 μL 1 毫克/mL 聚乙烯氨酸 （PEI） 至 6 mL 的 DMEM 和涡流。
      注意:始终使用未开封或最近打开的一瓶 DMEM 进行传输，因为此时的 pH 是至关重要的，并且 DMEM 一旦打开，随着时间的推移变得更加基本。
   2. 在室温下孵育15分钟。这种转染混合物足以在 6 x 15 厘米板上镀上 870 厘米² 表面积的细胞。根据实验的要求对转染混合物进行缩放。
3. 病毒包装细胞的传播。
   1. 经过15分钟的孵化，通过在整个板中加入1mL的转染混合物，使每个15厘米的板体变形。孵化在37°C，5%CO₂ 为8小时。
   2. 孵化后，取出含有转染混合物的无血清介质，在 15 厘米板中加入 30 mL 的常规培养介质，在 37 °C、5% CO₂下以 48 h 的速度进行培养。
4. 48小时后，收集病毒超自然药物，并通过0.45μm PVDF过滤器进行过滤。保持1 mL的病毒超自然和存储在-80°C的质量控制和病毒滴定。
5. 使用 SW28 转子头在高速离心机中通过蔗糖梯度离心将病毒超自然物集中。
   1. 用70%的乙醇清洗，然后用PBS冲洗3次，从而提供优质的超中性管。均匀地将大约 30 mL 的病毒超自然体分配到每个 6 超中心管中。
   2. 将20%蔗糖溶液（100毫克PBS中的蔗糖20克蔗糖）的每个管子底部轻轻移液4mL。将六个超中心管放入六个 SW28 摆动桶中，通过添加或去除病毒超自然物精确平衡每对对对水桶。
   3. 离心机病毒超母体在4°C至少2小时和高达4小时在80，000 x 克 和4°C。 离心完成后，小心丢弃超标。
   4. 将超中性管倒置到无菌软纸巾上至少2分钟，然后用软纸巾擦去管内任何超细剂的液滴，以去除任何残留的介质，从而排干剩余的超中性管。管子底部可能可以看到一个小的灰色白色颗粒。
   5. 在每个管子中加入 20-25 μL 冷新鲜的 PBS。密封管与石蜡薄膜和孵化管直立在冰上与轨道平台摇床轻轻摇晃约2小时。
   6. 使用 20 μL 移液器，小心地拆开并重新喷出第一根管子的颗粒，小心不要形成气泡。将介质转移到下一个管子上，重复这个过程，直到所有的病毒颗粒都被移出并组合成一个大约120-150微L体积的管子。在冰上用轻轻的摇晃将这种高滴定病毒悬浮再孵化约2小时。
   7. 将病毒悬架转移到 1.5 mL 微中轴管中，在冷藏和预冷桌面离心机中以 4 °C 旋转管，在 12，000 x g 下旋转 2 分钟。阿里引用明确的病毒超自然小心作为 10 μL 阿利库特在单独的 0.2 mL 管和存储在 - 80 °C. 丢弃管底部的颗粒，因为这将在胚胎注射期间堵塞针头。
6. 汇总的CRISPR扁豆病毒库的滴定
   注:由此产生的病毒悬浮应产生大约2000倍的浓度和由此产生的病毒溶液，并应具有病毒滴定器10^7-109，这是足够好超过100 E9.5手术如下描述。
   1. 种子R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或R26-Lox-STOP-TdTomato原核细胞或任何其他Cre-6细胞系成2×6井板。
   2. 一旦细胞达到~40%的对流，细胞就做好了转导的准备。届时，确定一口井内的细胞数量，以便以后计算病毒滴定器。将 Cre-记者细胞的介质更改为生长介质，并辅以 10 μg/mL 多溴化物（+六甲基溴）。
   3. 用 2 mL 的生长介质稀释 1 μL 的浓缩病毒。添加 0， 10， 50， 200 μL 的稀释病毒悬浮和 50， 200 μL 的未浓缩病毒从步骤 2.4 和混合板和孵育在夜间在 37 °C， 5% CO₂.
   4. 第二天取出含有病毒的生长介质，用PBS清洗细胞，然后用正常生长介质代替。此时，超自然物仍被视为病毒废物，必须按照机构BSL2条例进行处置。
   5. 转导后约 36-48 小时，评估 Lox-STOP-Lox 盒式磁带的 Cre 介导重组和 FACS 的 tdTomato 表达。计算病毒滴定器。使用以下公式计算菌落形成单位（cfu）/mL:
      
      注:将浓缩病毒悬浮剂与其未集中的病毒超纳特进行比较，可以估计 （1） 病毒生产的成功率以及 （2） 病毒浓度。或者，病毒滴定器可以使用 qRT-PCR 方法¹⁰进行估计。大规模生产和浓度的扁豆病毒也可以使用两步浓度与墨盒浓度，然后超中心化，如先前描述^的2。

3. 超声引导手术和注射

注:这项技术是从^4，11改编而^成的。用于表面上皮转导的微注入必须在胚胎日E9.5进行，当表面上皮由单层组成，并在从E10开始形成前，这将防止这种基底层的转导。最好在周五设置小鼠，这样E9.5胚胎的第一个可能的日子是下周一。使用罗莎26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP小鼠（杰克逊实验室#024857）获得最佳的CRISPR/Cas9效率^12。

1. 在所需的手术日期前10天为定时怀孕设置适当的雄性小鼠和雌性小鼠。
   1. 在接下来的几天里，对小鼠进行插头检查，以确定可能怀孕的小鼠。使用超声波检查在计划手术的前一天（即E8.5）确认怀孕。
2. 准备经过修改的培养皿。
   1. 使用双面胶带，将硅胶膜粘在覆盖圆形开口的培养皿底部。使用锋利的剪刀，在硅胶膜上切开一个2×10毫米的椭圆形开口。
3. 微注射系统的准备
   1. 使用带有以下设置的微皮拉器从厚壁玻璃毛细管中准备注射针:压力 = 200;热 = 769;拉=0:速度 = 140;时间=100。
   2. 使用细剪刀切断其直径约30μm水平的针尖。将针头使用针头磨刀在细级磨盘上切至20°，定期润湿20分钟。
   3. 使用 10 mL 注射器使用 26 G1/2 针推 70% 乙醇，对微注射针进行消毒。使用装有矿物油的 10 mL 注射器和 26 G1/2 针，回填微注射针。确保微注射针中没有气泡。
   4. 根据制造商的说明，将微注射器针安装在微脉冲器上。
4. 用病毒性sgRNA库加载针头。
   1. 派珀特 10 μL 的病毒悬浮到固定在平面上的准膜上。
   2. 使用微脉冲器，排出矿物油。针头中少量油的存在将阻止扁豆病毒接触活塞。加载约4-5 μL病毒悬浮缓慢的吸入没有任何气泡。
5. 使用异氟素感应室麻醉怀孕的老鼠。将氧气调节器设置为 1 L/min，异氟化气化剂设置为 2%。要确定动物是否麻醉，请在异氟烷感应室中约 3-5 分钟后检查脚趾捏。
6. 将麻醉动物腹腔侧放在加热手术阶段（40 °C），并应用手术胶带将爪子与鼻锥麻醉管固定到位，以持续供应异氟烷和氧气，直到手术完成。
7. 确认E9.5怀孕，如果它没有在E8.5完成。
   1. 将少量（~1~2茶匙）脱毛霜涂抹在腹部，然后使用棉质贴花施用器将其铺在3×3厘米的区域。
   2. 2-3分钟后，用纱布或组织轻轻取出奶油，使用PBS和70%乙醇清洁区域。
   3. 使用超声波探头和凝胶，检查怀孕小鼠胚胎日E9.5。值得注意的是，这也可以在前一天在E8.5做，以节省实际手术当天的时间。
   4. 使用 BPS 去除超声波凝胶并擦拭区域，然后使用 70% 乙醇进行消毒。
8. 在鼠标大坝中注射 0.02 cc 的丁丙诺啡镇痛剂皮下。
9. 手术暴露子宫
   1. 使用无菌钳子和剪刀，将垂直~2厘米切口切入小鼠的皮肤。
   2. 使用钝钳将切口周围的皮肤与内分母分离。
   3. 使用无菌钳子和剪刀，切开围产。
   4. 使用钝钳，轻轻地拉出左右子宫角，数一数胚胎。
   5. 重新插入大部分子宫角，但让一个含有3个胚胎的子宫角的解剖端暴露。
   6. 使用钝钳，轻轻推拉子宫与3个胚胎通过在改良培养皿的硅胶膜的开口。
   7. 使用建模粘土立方体稳定培养皿。
10. 使用硅胶模具在培养皿内使用三个胚胎稳定子宫。用锋利的刀子将胚胎侧面的硅胶塞平整。
11. 用无菌 PBS 填充培养皿。用怀孕的大坝腹部冲洗培养皿底部的硅膜，防止任何泄漏。
12. 将超声波头移入顶部胚胎上方约 0.5 厘米的培养皿中，并调整舞台，使羊水腔在超声波视野中清晰可见。
13. 将喷油器针小心地对齐修改后的培养皿。使用微脉冲器，将针尖置于顶部胚胎约5毫米的范围内。然后来回切换针头，进入其尖端在超声波图像中显示最亮的平面。
14. 使用微脉冲器将针头穿过子宫壁推入羊水腔。
15. 注射含有sgRNA库的扁豆病毒。
    1. 将喷油器预编程为 62 nL，并以缓慢的注射速度进行编程。微注射器可以编程为以慢速或快速注入特定体积。
    2. 按 下注射 按钮 8 次，每个胚胎共 496 nL。根据需求和病毒滴定调整音量。病毒滴定器 1 x 10⁸ pfu/mL 和 496 nL 注射量将导致约 30% 的感染率。
    3. 对其他两个胚胎重复相同的程序。
    4. 抬起超声波头，取出硅胶插头。
    5. 使用无菌棉交换将 3 个胚胎轻轻推入小鼠腹部。
    6. 轻轻地拉出接下来的3个胚胎，重复注射过程，直到注射所需的胚胎数量。
       注意:不要超过30分钟的麻醉，因为怀孕的水坝更有可能在那个时间之后中止胚胎。经验丰富的外科医生可以在30分钟内注射多达12个胚胎。
16. 抬起超声波头，用针头取出微脉冲器，吸气 PBS 并取出培养皿。使用无菌湿巾，吸收可能积聚在腹腔中的任何 PBS。
17. 使用可吸收的缝合线关闭腹产切口。使用两个主食来关闭腹部皮肤的切口。
    注意:在子宫手术中进行超声引导时，应尽量注意保持清洁环境，尽可能保持不育，避免任何可能的污染物。如果必须在同一天进行多次手术，则使用珠子消毒器消毒解剖仪器，并清洁其他遇到用乙醇清洁的老鼠组织的仪器。这大大提高了手术后胚胎的存活率。此处描述的手术方法的存活率始终在 80-100% 之间。
18. 手术后护理。
    1. 让怀孕的女性在加热的笼子里恢复，观察15-30分钟。
    2. 检查阴道管的血液，这是堕胎和并发症的早期迹象。对于术后止痛，在手术后两天内每天两次服用镇痛剂。
19. 使用荧光解剖显微镜、荧光蛋白手电筒和滤镜，或通过耳部或尾夹中集成病毒颗粒的基因化，识别转基因胚胎/新生儿 Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP 小鼠。
    注意:在头发开始生长之前，最好使用荧光显微镜识别小鼠，直至产后第3天。
20. 为确保CRISPR库有足够的覆盖，请根据以下参数计算覆盖范围:E9.5 小鼠表面等体由 +150，000 个单元组成;转导约20%，导致最小的双重感染率（+1/10双感染细胞^{）4，5，11:}在20%的感染率下，每个胚胎有30，000个受感染细胞。确保至少 100 个单个细胞使用给定的 sgRNA 进行转化。例如，2000 sgRNA 的池需要 2 x 10⁵个细胞或 6-7 个动物。

4. 深度测序程序

1. 在实验终点，如肿瘤形成或任何其他表型，牺牲小鼠和收获感兴趣的组织。使用血液和组织DNA提取试剂盒按照制造商的协议净化基因组DNA。在开始从肿瘤中提取DNA之前，用DNA擦除清洁工作台，并远离处理质粒的实验室区域。
   注意:生成参考样本以允许计算 sgRNA 折叠随时间的变化非常重要。感染后3天或转导细胞（见第2.6步）的转导胚胎可以作为参考样本，以确定sgRNA在原始库中的表示。
2. 使用 100 ng - 1.5 μg 基因组 DNA 作为 50 μL 预放大 PCR 1 反应中的模板，使用 表 1 中列出的外部引物和表 2中概述的 PCR 程序。设置足够的反应以产生所需的覆盖范围。
   注意:在实验室的单独专用区域或通过脱氧核糖核酸擦除彻底清洁的组织培养罩中设置条形码 PCR 反应，以避免任何污染。以水为模板的每个 PCR 板运行负控，以确保没有污染。
3. 将所有 PCR 1 反应池中，在 1.5% 的控制 agarose 凝胶上运行 20 μL，以验证 600 bp 波段的成功放大。
4. 使用 表 3 中列出的独特条形码底漆组合和表 4 中概述的 PCR 程序中的 50μL 的 PCR 2 反应中使用池式 PCR1 反应的 5 μL作为模板。在 2% 的蔗糖凝胶上运行 50 μL 的 PCR 2 反应，并根据制造商的说明使用凝胶提取套件净化 200bp 带。
   注:放大前步骤仅用于放大复杂的转导组织。如果放大一个肿瘤，大概形成一个克隆细胞，因此只包含一个sgRNA，一个人可以跳过预放大PCR1，并立即进行PCR2。
5. 使用荧光量定量量化DNA浓度，并发送到测序设施进行深测序（例如，每个肿瘤100万读数）。
6. 使用 Bowtie v1.2.3，它只允许未加合的对齐，对齐顺序读数到 sgRNA 库¹³。使用以 fasta 格式输入 sgRNA 序列的蝴蝶结生成命令创建蝴蝶结索引。使用带选项-m 2 -v 1的bowtie命令绘制读数地图，允许在读取对齐过程中最多两次错配，并丢弃对齐多个库 sgRNA 序列的读数。通常，超过 80% 的读数在这些参数下对齐。
7. 使用 MAGeCK 计数命令使用对齐的文件作为输入¹⁴获取读数表。sgRNA 计数表可用于下游分析，例如，确定微分 sgRNA （MAGeCK） 和查找基本基因 （BAGEL）。

结果

图1A 显示了寡核苷酸的设计，用于在单个 12k 或 92k 寡头芯片中以经济高效的方式对多个自定义 CRISPR 库进行多路复用。一旦选择 sgRNA（蓝色编码），寡核苷酸将设计为限制位点（橙色 BsmBI）和库特定的 PCR 引物对（绿色编码）。几个库可以通过使用引物对的独特组合来设计，用于在单个寡头芯片中进行多重组合。当 PCR 使用特定的 PCR 底漆对放大库时，始终只包含水负控制，?...

讨论

CRISPR/Cas9基因组编辑已广泛应用于体外和体内研究，以研究基因功能和细胞过程。大多数体内研究都利用CRISPR/Cas9基因编辑的细胞移植到动物模型（异种移植或异种移植）。虽然这是研究癌症遗传学和细胞功能的有力工具，但它仍然缺乏原生组织微环境，并可能引起伤害和/或免疫反应。

为了克服这些挑战，几个小组已经率先在体内CRISPR方法产生几个，多路复用的自动鼠标模型...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 micron filter	Sigma	S2HVU02RE
12k or 92k oligo chip	Customarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture plates	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Alkaline phosphatase	NEB	M0290L
Amplicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI	NEB	R0580L
Chromic gut suture	Covidien
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)	Illumina
DNA-cleanup kit	Zymo Research	D4008
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit	Qiagen	69506
Endura electrocompetent cells	Lucigen	60242-1
Glass Capillaries	Drummond	3-000-203-G/X
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
High-Speed Centrifuge	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Micropipette puller	Sutter Instrument	P97
Mineral oil	Sigma	M5904
Mini-prep plasmid Kit	Frogga Bio	PDH300
Mouse oxygen anaesthesia system	Visual Sonics
Nanoject II micromanipulator	Drummond
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)	NEB	R0580L
Needle sharpener	Sutter Instrument	BV-10
Oligo cleanup kit	Zymo research	D4060
PAGE purified illumina sequencing primer	IDT DNA
PEI (polyethyleneimine)	Sigma	408727-100ML
Permoplast modeling clay
Petridish with central opening	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polymerase 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Fluorometric Quantification	Invitrogen	Q33327
Semicircular Silicone plug	Corning
Silicone membrane	Visual Sonics
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
Ultra-centrifuge tubes	Beckman Coulter	344058
Vevo2000 ultrasound system	Visual Sonics