从脂质绑定蛋白和过敏原中去除和替换内源性利根

摘要

该协议描述了从过敏原中去除内源性脂质，并通过逆相HPLC与热退化用用户指定的配体替换它们。 ³¹P-NMR 和圆形二分法允许快速确认配体去除/装载，并恢复原生过敏原结构。

摘要

许多主要过敏原与疏水性脂质状分子结合，包括Mus m 1、Bet v 1、Der p 2和Fel d 1。这些配体被强烈保留，并有可能通过直接刺激免疫系统或改变过敏蛋白的生物物理特性来影响敏感过程。为了控制这些变量，需要技术来去除内源性绑定配体，并在必要时用已知成分的脂质代替。蟑螂过敏原Bla g 1封闭了一个大的疏水腔，在使用传统技术纯化时结合了异质内源性脂质的混合物。在这里，我们描述了一种方法，通过这种方法，这些脂质被删除使用反相HPLC，然后热退化产生Bla g 1在其Apo形式或重新加载与用户定义的脂肪酸或磷脂货物的混合物。将该协议与生化检测结果结合，可显著改变Bla g 1的恒温性和蛋白解电阻，对T细胞表位生成速率和过敏性有下游影响。这些结果突出了脂质去除/重新加载协议的重要性，例如在研究来自重组源和自然来源的过敏原时所述的协议。该协议可推广到其他过敏原家族，包括脂蛋白（Mus m 1）、PR-10（投注 v 1）、MD-2（Der p 2）和乌特罗蛋白（Fel d 1），为研究脂质在过敏反应中的作用提供了宝贵的工具。

引言

对过敏原数据库的调查显示，过敏原只存在于所有已知蛋白质家族的2%中，这表明常见的功能和生物物理特性有助于过敏^1。在这些特性中，粘合脂质货物的能力在过敏原中似乎被强烈地夸大了，这表明这些货物可能会影响敏感过程^1。事实上，已经表明，巴西坚果过敏原Ber e 1需要与它的内源性脂质共同管理，以实现其充分的敏感潜力^2。这些脂质可能直接刺激免疫系统，如小虫过敏原Der p 2和Der p 7所示，这两种脂质都与LPS结合蛋白^3、4、5具有很强的结构同源性。根据这一观察，建议Derp 2和Der p 7可以结合细菌脂质，并通过TLR4介导信号直接刺激宿主免疫系统，促进^5，6的敏感过程。内源性结合脂质也有可能改变过敏性蛋白质本身的生物物理特性。例如，Sin a 2（芥末）和阿拉h 1（花生）与磷脂性粘结体相互作用的能力显著增强了它们对胃和内分泌降解⁷的抵抗力，而配体与主要的白杨花粉过敏原Bet v 1结合改变了内分泌处理速率和由此产生的肽⁸的多样性。鉴于稳定性、T细胞表位生成和蛋白质（如Bet v 1和Bla g 1）的过敏性之间的相关性，这与过敏性特别相关:后者将是这项工作的主题^9，10。

Bla g 1代表昆虫主要过敏原（MA）蛋白质家族的原型成员，并拥有由12个两栖病态α海片组成的独特结构，包围着异常大的疏水腔^9，11。Bla g 1 的可用 X 射线晶体结构显示该腔内的电子密度与绑定磷脂或脂肪酸配体一致:³¹P-NMR和质谱法证实的猜想。这些货物在性质上是异质的，它们的组成严重依赖过敏原来源，观察到不同的脂质特征，用于大肠杆菌和P.面食表达的重组Bla g 1。奇怪的是，Bla g 1从其天然过敏原源（蟑螂菌）中纯化，在其结合部位内主要含有脂肪酸，棕榈酸盐、油酸盐和凝固物的混合物被确定为其"天然"配体^9，11。Bla g 1 在多个净化步骤后保留脂质和脂肪酸的能力阻碍了孤立研究蛋白质的努力。相反，有人提出，Bla g 1（从今称为nMix）的天然棕榈酸盐、石板和油酸盐配体在其过敏性和原生生物功能⁹中起着关键作用。然而，这些配体在Bla g 1中并不存在，这些配体来自重组来源，因此很难评估这一假设。类似的问题已经观察到其他脂质结合过敏原，如Bet v 1^12，13。为了促进脂质-过敏原相互作用的系统研究，我们制定了一个协议，通过该协议，过敏原可以定量地剥离其内源性结合脂质，并以Apo形式或装载特定配体进行重组。

过敏原通常使用亲和力色谱和/或大小排除色谱从其自然或重组来源纯化。在这里，我们引入了额外的纯化步骤，以高性能液相色谱 （HPLC） 的形式使用反相 C18 列，从该柱中将过敏原稀释成类似于为脂肪酸结合蛋白¹⁴开发的协议的有机溶剂。因此，在脂肪酸和/或磷脂的缺乏或存在的情况下，产生的蛋白质将遭受热退化步骤。除了恢复原生 Bla g 1 折外，升高的温度还增加了脂质货物的溶解性和可访问性，在 Apo 形式中产生 Bla g 1 或均匀装载所需的疏水配体。 ³¹以这种方式净化的Bla g 1的P-NMR光谱确认完全去除内源性结合的配体，并统一更换所需的化合物，而圆形二分法则确认了Bla g 1褶皱的成功恢复。在最近一项工作中，发现货物结合可增强Bla g 1的热敏度和蛋白解电阻，改变T细胞表位生成的动力学，对感化和过敏^性9具有潜在影响。

研究方案

1. 布拉 g 1 克隆

1. 获得蟑螂过敏原Bla g 1.0101（残留物34-216）的基因，表示MA域的一次重复。为了简单起见，Bla g 1 将在整个工作中用于表示此单次重复，而不是整个 Bla g 1.0101 成绩单。
2. 将Bla g 1基因子将到所需的载体中。在这项研究中，含有 N - 末期谷胱甘肽 S - 转移酶（ GST ）标签的基因与烟草蚀刻病毒（ TEV ）蛋白酶部位入 pGEX 载体以表达如前所述^{11 。}
3. 将 Bla g 1 pGEX 向量转换为 BL21 DE3 大肠杆菌 细胞。
   1. 准备所需矢量的 10 ng/μL 库存。
   2. 将 10 ng/μL DNA 库存的 1μL 与制造商提供的 50 μL BL21 DE3 细胞混合。
   3. 在冰上孵化 BL21 DE3-DNA 混合物 30 分钟。转移到42°C的水浴1分钟，然后立即转移到冰上，再孵化1分钟。
   4. 将 200 μL 的 LB 介质添加到细胞中，并在 37 °C 下再孵育 1 小时。
   5. 将转化后的细胞放在含有 100 毫克/升安非他林的 LB-Agar 板上，并在 37 °C 的夜间生长。

2. 初始表达和净化

1. 接种 1 L 的 LB 介质，其中含有 100 毫克/L 安非他明，其中单个菌落的 BL21 DE3 细胞与 Bla g 1 向量一起转化，如 1.3 所述。在37°C的夜间生长。
2. 第二天，通过离心机在_6，000 x g 处收获细胞（OD 600 ~1.5），10分钟，并在含有100毫克/升安非他明的2升YT介质中再供收。允许细胞在 37 °C 时再生长 1 小时，达到_{OD 600} > 0.6。
3. 通过添加0.5 mM IPTG来诱导蛋白质表达。将细胞转移到 18 °C，并在一夜之间孵化。
4. 第二天，收获细胞如2.2所述。由此产生的细胞颗粒可以冻结并储存在-20 °C。
5. 在 50 毫升裂解缓冲器 （50 mM Tris-HCl pH 8.5， 100 mM NaCl） 中从 1 升培养物中获取的补液颗粒，其中含有 1 片蛋白酶抑制剂片（或等效剂）和 1μL 苯甲酸酶核糖酶。
6. 使用探针声波器（500 W， 20 kHz）的 Lyse 电池在 4 分钟内将功率设置为 30-50%，负荷周期为 50%。在声波化过程中将测定将测定保存在冰浴中
7. 离心解水在45，000 x g 20分钟。丢弃不溶性分数（颗粒）。
   1. 去除28微升的可溶性蛋白质。与 7 μL 的 5 倍 SDS-PAGE 缓冲区和存储 SDS-PAGE 分析相结合。在使用 TEV 孵化前后，重复此步骤，实现 GST 列的流过、洗涤和洗涤分数。
8. 将可溶性蛋白质（超纳坦）应用于在 PBS pH 7.4 中等效的谷胱甘肽树脂柱（总床积约约 10 mL）。
9. 使用 50 mL 的 PBS 洗掉任何未绑定蛋白质。
10. 使用含有 10 mM 的 PBS 的 50 mL 的 Elute GST-Bla g 1 减少谷胱甘肽。
11. 在 4 °C 或室温下在 4 °C 下用 0.2 kU TEV 蛋白酶孵化提升蛋白，或在 6 小时内消除 GST 标签。

3. 通过逆相HPLC去除内源性脂质

1. 收集裂开的 Bla g 1，然后使用离心滤光单元将其浓缩到 +2 mL，其分子重量截止< 10 kDa。
   1. 将<12 mL样品添加到浓缩器顶部，在回转桶转子中以5，000 x g 旋转10×15分钟。
      注意:样本体积和旋转速度将因特定过滤器和使用的转子类型而异。使用前请咨询制造商文档。
2. 将浓缩物加载到配备 C18 反相色谱列的 250 x 10 mm HPLC 系统上，该柱与 97% 缓冲 A（水、0.1% 三氟乙酸）和 3% 缓冲 B（丙酮三酯，0.1% 三氟乙酸）相等。
   注意:可以使用较小的柱子，但蛋白质可能需要使用多个周期来加载和稀释，以适应绑定容量的降低。选择列时，确保树脂珠的颗粒大小为< 5 μm，孔径为>200°，从而能够有效分离蛋白质大小的分子
   注意:三氟乙酸具有高度腐蚀性，应使用适当的PPE（即氮化手套、实验室外套和护目镜）在烟熏罩内分配。乙酮三甲虫具有中度毒性、挥发性和高度易燃性，应使用适当的PPE（即氮化物手套、实验室外套和护目镜）在烟熏罩内使用和配发。
3. Elute Bla g 1 使用 表 1 中显示的协议，流速为 1.5×4.0 mL/分钟。使用 280 nm 的荧光吸收来监测洗脱过程。
   1. 收集和池布拉g 1分数。Bla g 1 通常以 > 74% 缓冲区 B 或约 34-40 分钟的速度稀释。
      注意:根据流速或列大小，洗发时间略有不同。根据 A₂₈₀ 收集分数以获得最佳结果。

时间（最小）	缓冲区 A （%）	缓冲区 B （%）
0	97	3
10	97	3
25	35	65
55	5	95
65	5	95
70	97	3

表1:Bla g 1的弹性协议。表使用 C18 HPLC 列说明在 Bla g 1 隔离中使用的弹性梯度。

4. 将样品加入玻璃试管，填充试管不超过一半（约4毫升）。用石蜡膜盖住管子，用两个孔穿孔盖住盖子，以便通风。
   1. 准备一个单独的1mL的别名（测试阿里报价）。这将用于确定预期收益率。
5. 将样品放入 -80 °C 冰柜中 1 小时或浸入液氮中，冷冻样品并测试别名。在较晚的情况下，管必须连续旋转，以避免试管破裂，由于冻结时液体相的膨胀。
6. 使用除水器干燥由此产生的脱皮蛋白样本。干蛋白可在4°C下储存数月，存放在密封容器中。

4. 重组阿波和货物装载布拉 g 1

1. 确定预期的 Bla g 1 收益率。
   1. 在 5 mL 的再折叠缓冲区中重新使用同化、脱硫 （后 HPLC） 测试别名（50 mM HEPES pH 7.4，100 mM NaCl，2% DMSO）。
   2. 在水浴中加热混合物（500 mL 烧嘴，250 mL 水，在热板上搅拌棒）至 95 °C。涡流解决方案间歇性地孵化在 95 °C，速度为 0.5–1 小时。
   3. 去除热量，慢慢让水浴平衡到室温（~1小时）。如果需要，退化蛋白可在4°C过夜储存。
   4. 通过 0.22 μM 注射器过滤器通过已脱脂的 Bla g 1 脂混合物去除颗粒物。
   5. 缓冲区使用离心过滤器将过滤后的蛋白质 3 倍交换到 PBS pH 7.4 中，该离心滤清器具有 10 kDa 的切口，如 3.1 中所讨论的那样，用于去除残留的无脂肪酸和有机溶剂。
   6. 使用 BCA 检测或其他首选方法（如紫外线吸收）评估蛋白质浓度。使用此来确定剩余 Bla g 1 单体报价的预期收益率。
2. 重组阿波或货物装载布拉 g 1
   1. 如4.1.1所述，在重新折叠缓冲区中重新发送 Bla g 1 引用。
   2. 要生产 Apo-Bla g 1，重复步骤 4.1.2–4.1.6 以获得所需的收益。
   3. 要将 Bla g 1 装载脂肪酸，请在甲醇或 DMSO 中准备所需的脂肪酸货物的 20 mM 库存解决方案。 然后，跳转到步骤4.2.5。
   4. 要将 Bla g 1 与磷脂一起装载，在玻璃试管内准备一个 10 毫克/毫升的所需货物的氯仿库存。
      1. 蒸发氯仿以产生脂质薄膜。将 PBS 添加到试管中，以产生 20 mM 的最终磷脂浓度。
         注意:如果吸入或吞咽，氯仿是有害的。如果通风不足，请使用化学烟雾罩或使用呼吸器。处理时使用氮化物手套、实验室外套和护目镜。使用前请咨询MSDS。
      2. 通过加热脂质薄膜高于脂质货物的相过渡温度和漩涡，使其补充水分，直到溶液变成多云。请注意，可能需要声波完全补充和补充一些货物。
      3. 如果需要声波化，将试管放在浴缸声波器（100 W，42 kHz）中，并以最大功率声波化，直到货物被重新装上。或者，探针声波器（2.6 中描述）可以使用 10-20% 的功率和 50% 的关税周期。
         注意:声波采用高频声波，可能会损害听力。使用降噪 PPE（耳塞或消声器）。如果可能，将声波器放在声音抑制柜或室内。
   5. 根据在 4.1 中确定的预期产量，加入所需的脂肪酸或磷脂货物，使配体相对于 Bla g 1 的平地量增加 20 倍。本步骤中添加的有机溶剂总量不应超过 2%。漩涡混合。
      注:Bl 21 DE3细胞的1升通常产生~0.25~0.4微米蛋白质，相当于每管约400微米配体。
   6. 将4.1中描述的蛋白质与蛋白质进行退化。

5. 通过 ³¹P-NMR 确认磷脂货物拆卸/装载

1. 使用 3.1 中描述的离心滤清器单元浓缩 Apo- 或装货 Bla g 1 至 >100 μM 的浓缩样品。
2. PBS 缓冲区中的补充水分参考磷脂最终浓度为 2、1.5、1、0.5 和 0.25 mM。
3. 用胆碱缓冲器（100 mM Tris pH 8.0，100m NaCl，10%w/v 胆碱）稀释样品1:1，总容量约600微l。
   注意:在这一步骤中，Cholate 用于从 Bla g 1 疏水腔中充分提取和溶解脂质。这确保了磷脂头组周围的化学环境在不同样品之间保持一致，从而允许使用³¹P-NMR 进行定量评估。胆碱的使用可以替代氯仿/甲醇，如前^所述15。
4. 使用宽带探头获取胆碱化 Bla g 1 样本的 1D ³¹P-NMR 光谱和参考磷脂标准。
   注:本作品中呈现的³¹P-NMR 光谱是使用 600 MHz 光谱仪获得的。然而，先前采用类似技术的研究表明，在低至150-200 MHz 15的场强度下，可以达到可接受的灵敏度。
5. 使用适当的软件处理生成的数据¹⁶.
6. 使用首选的 NMR 查看软件¹⁷获得峰值的特性。
7. 将 Bla g ^{1 31}P-NMR 光谱与磷脂参考样品获得的光谱进行比较，以确认根据可见山峰的化学移位（或缺乏）去除内源性绑定配体和/或绑定所需的配体。
   1. 通过比较 Bla g 1 频谱的峰值强度和磷脂参考标准的峰值强度来确认完全结合的固态测量。

6. 确认 Bla g 1 折叠

1. 在 CD 缓冲区中准备 0.5 μM Bla g 1 样本（100 mM KH₂PO_4，缓冲区 pH 7.5）。将样品的 2 mL 加载到带磁搅拌棒的 10 mm CD 小面包中。
2. 测量 Bla g 1 的 CD 频谱，以确认二级结构的重组。确保光倍增压器 （PMT） 电压不超过制造商建议（一般为 1 kV）。
   1. 测量 CD 信号从 260–200 nm 在 25 °C 与数据间距 0.2 nm 和扫描速率为 20 nm/s 与数据集成时间 1 s.
3. 以 0.5 °C/分钟的速度将 CD 单元中的温度从 25 °C=95 °C 升高。激活磁搅拌棒，以确保整个样品的温度均匀。
4. 在222纳米时监视CD，每2°C读数。
5. 将生成的数据与 2 状态博尔茨曼曲线配合，以确定熔化温度。由于Bla g 1的高稳定性，熔化温度（MT_25）被定义为蛋白质在222纳米时失去初始CD的25%的温度。

结果

使用亲和色谱法，重组的 GST-Bla g 1 很容易被隔离到高纯度 （图1A），产生 +2+4 毫克/升的细胞培养产量。在 4 °C 下与 TEV 蛋白酶进行隔夜孵化足以去除 GST 标签，最终产品为 +24 kDa。请注意，在这种情况经和洗涤分数中有大量 GST - Bla g 1 ，这表明谷胱甘肽树脂绑定容量已超出。使用更多的树脂或样品加载和洗脱的多个周期可以为这个问题提供补救措施。

将 Bla g 1 应...

讨论

本工作中描述的协议已成功地应用于系统地研究 Bla g 1 的脂质结合特性。这揭示了货物结合、恒温和内分泌处理之间的相关性，后者与已知T细胞表位的产生减少有关，对免疫原性^9、18有潜在影响。除了 Bla g 1 之外，其他过敏原（如保诚 p 3 和 Bet v 1）已证明在使用标准亲和力和大小排除色谱方法^{13、19、20、21、22}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bla g 1 Gene	Genescript	N/a	Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor biotechnologies	N/a	Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC-1008
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Benzonase	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe	Varian	N/a
ChemStation for LC (Software)	Agilent	N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System	Labconco	7750000
Glutathione Resin	Genescript	L00206
Glutathione, Reduced	Fisher Scientific	BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD spectropolarimeter	Jasco	J-815
Millex Syringe Filter Unit	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe (Software)	Delaglio et al.	N/a	Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software)	Johnson et al.	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA Protein Assay	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump	Varian	VP-195
Sodium Cholate Hydrate	Sigma-Aldrich	C6445
Sodium Palmitate	Sigma-Aldrich	P9767
Sodium Stearate	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ (Software)	Varian	N/a