Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Resumen

Este protocolo describe el retiro de lípidos endógenos de alergénicos, y su reemplazo con ligands usuario-especificados con la CLAR de la invertir-fase juntada con el recocido termal. ³¹ El P-RMN y el dicroísmo circular permiten la confirmación rápida del retiro/del cargamento del ligand, y la recuperación de la estructura alergénica nativa.

Resumen

Muchos alérgenos importantes se unen a moléculas hidrofóbicas similares a lípidos, incluyendo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 y Fel d 1. Estos ligandos se retienen fuertemente y tienen el potencial de influir en el proceso de sensibilización, ya sea a través de la estimulación directa del sistema inmunológico o la alteración de las propiedades biofísicas de la proteína alergénica. Para controlar estas variables, se requieren técnicas para la eliminación de ligandos endógenos unidos y, si es necesario, la sustitución por lípidos de composición conocida. El alérgeno de cucaracha Bla g 1 encierra una gran cavidad hidrofóbica que se une a una mezcla heterogénea de lípidos endógenos cuando se purifica utilizando técnicas tradicionales. Aquí, describimos un método a través del cual estos lípidos se eliminan utilizando HPLC de fase inversa seguido de recocido térmico para producir Bla g 1 en su forma apo o recargado con una mezcla definida por el usuario de cargas de ácidos grasos o fosfolípidos. El acoplamiento de este protocolo con ensayos bioquímicos revela que las cargas de ácidos grasos alteran significativamente la termoestabilidad y la resistencia proteolítica de Bla g 1, con implicaciones aguas abajo para la tasa de generación de epítopos de células T y alergenicidad. Estos resultados destacan la importancia de los protocolos del retiro/de la recarga del lípido tales como el descrito adjunto al estudiar alergénicos de fuentes recombinantes y naturales. El protocolo es generalizable a otras familias de alérgenos incluyendo lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) y Uteroglobin (Fel d 1), proporcionando una valiosa herramienta para estudiar el papel de los lípidos en la respuesta alérgica.

Introducción

Un estudio de la base de datos de alérgenos revela que los alérgenos se encuentran en sólo el 2% de todas las familias de proteínas conocidas, lo que sugiere que las propiedades funcionales y biofísicas comunes contribuyen a la alergenicidad¹. De estas propiedades, la capacidad de unir cargas lipídicas parece estar fuertemente sobrerrepresentada entre los alérgenos, lo que sugiere que estas cargas pueden influir en el proceso de sensibilización^1. De hecho, se ha demostrado que el alérgeno de la nuez de Brasil Ber e 1 requiere co-administración con su lípido endógeno para realizar todo su potencial sensibilizante^2. Estos lípidos podrían potencialmente estimular el sistema inmune directamente como lo ilustran los alérgenos ácaros Der p 2 y Der p 7, los cuales comparten una fuerte homología estructural con las proteínas de unión a LPS^3,4,5. Sobre la base de esta observación se propuso que Derp 2 y Der p 7 podrían unirse a los lípidos bacterianos y estimular directamente el sistema inmune del huésped a través de la señalización mediada por TLR4, facilitando el proceso de sensibilización^5,6. También es posible que los lípidos endógenos unidos podrían alterar las propiedades biofísicas de las propias proteínas alergénicas. Por ejemplo, la capacidad de Sin a 2 (mostaza) y Ara h 1 (cacahuetes) para interactuar con vesículas fosfolípidas mejoró significativamente su resistencia a la degradación gástrica y endosomal^7,mientras que el ligando que se une al alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 alteró tanto la tasa de procesamiento endosomal como la diversidad de los péptidos resultantes^8. Esto es particularmente relevante para la alergenicidad dada la correlación que se ha observado entre la estabilidad, la generación de epítopos de células T y la alergenicidad para proteínas como Bet v 1 y Bla g 1; este último de los cuales será objeto de este trabajo^9,10.

Bla g 1 representa el miembro prototípico de la familia de proteínas de insectos alérgenos mayores (MA), y posee una estructura única compuesta por 12 hélices alfa anfipáticas que encierran una cavidad hidrofóbica anormalmente grande^9,11. La estructura cristalina de rayos X disponible de Bla g 1 muestra densidad de electrones dentro de esta cavidad consistente con ligandos de fosfolípidos o ácidos grasos unidos; una conjetura confirmada por ³¹P-RMN y espectrometría de masas. Estas cargas eran de naturaleza heterogénea y su composición dependía en gran medida de la fuente alergénica, observó diferentes perfiles lipídicos para bla g 1 recombinante expresado en E. coli y P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de su fuente natural de alérgenos (frass cucaracha) contenía predominantemente ácidos grasos dentro de su sitio de unión, con una mezcla de palmitato, oleato y estearato que se identifica como sus ligandos "naturales"^9,11. La capacidad de Bla g 1 para retener lípidos y ácidos grasos después de múltiples pasos de purificación dificulta los esfuerzos para estudiar la proteína de forma aislada. Por el contrario, se ha sugerido que los ligandos naturales palmitato, estearato y oleato de Bla g 1 (en adelante, nMix) juegan un papel clave tanto en su alergenicidad como en su función biológica nativa^9. Sin embargo, estos ligandos no están presentes en Bla g 1 obtenidos de fuentes recombinantes, por lo que es difícil evaluar esta hipótesis. Se han observado problemas similares para otros alérgenos de unión a lípidos como Bet v^{1 12,13}. Para facilitar el estudio sistemático de las interacciones lípido-alergénico hemos desarrollado un protocolo a través del cual los alérgenos pueden ser cuantitativamente despojados de sus lípidos endógeno unidos y reconstituidos en forma de Apo o cargados con ligandos específicos.

Los alérgenos se purifican más comúnmente de sus fuentes naturales o recombinantes mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Aquí, introducimos un paso de purificación adicional en forma de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) empleando una columna C18 de fase inversa a partir de la cual el alérgeno se ela en un disolvente orgánico similar a los protocolos desarrollados para proteínas de unión a ácidos grasos^14. La proteína resultante se somete entonces a un paso de recocido térmico en ausencia o presencia de ácidos grasos y/o fosfolípidos. Además de recuperar el pliegue nativo de Bla g 1, las temperaturas elevadas aumentan la solubilidad y accesibilidad de las cargas lipídicas, produciendo Bla g 1 en forma apo o uniformemente cargada con el ligando hidrofóbico deseado. ³¹ Los espectros de P-RMN de Bla g 1 purificados de esta manera confirmaron el retiro completo de ligands endógeno ligados y el reemplazo uniforme con los compuestos deseados, mientras que el dicroísmo circular confirmó la recuperación acertada del doblez de Bla g 1. La utilidad de este método se destaca en un trabajo reciente en el que se encontró que la unión a la carga mejora la termoestabilidad Bla g 1 y la resistencia proteolítica, alterando la cinética de la generación de epítopos de células T con posibles implicaciones para la sensibilización y la alergenicidad^9.

Protocolo

1. Bla g 1 clonación

1. Obtener el gen para el alérgeno de cucaracha Bla g 1.0101 (residuos 34-216), que representa una sola repetición del dominio MA. En aras de la simplicidad, Bla g 1 se utilizará a lo largo de la obra para representar esta sola repetición, en lugar de toda la transcripción de Bla g 1.0101.
2. Subclone el gene de Bla g 1 en el vector deseado. En este estudio, el gen que contiene una etiqueta de la S-transferasa del glutatión N-terminal (GST) acoplada a un sitio de la hendidura de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) fue insertado en un vector del pGEX para la expresión según lo descrito^{previamente 11.}
3. Transforme el vector Bla g 1 pGEX en células BL21 DE3 E. coli.
   1. Prepare una acción de 10 ng/μL del vector deseado.
   2. Combine 1 μL de 10 ng/μL de ADN con 50 μL de células BL21 DE3 según lo proporcionado por el fabricante.
   3. Incubar la mezcla BL21 DE3-DNA durante 30 min sobre hielo. Transferir a un baño de agua de 42 °C durante 1 min, luego transferir inmediatamente de nuevo en el hielo para una incubación adicional de 1 min.
   4. Añadir 200 μL de medios LB a las células e incubar durante 1 h adicional a 37 °C.
   5. Platee las células transformadas en placas de agar LB que contienen 100 mg/L de ampicilina y crezca a 37 °C durante la noche.

2. Expresión inicial y purificación

1. Inocular 1 L de medios LB que contengan 100 mg/L de ampicilina con una sola colonia de células BL21 DE3 transformadas con el vector Bla g 1 como se describe en 1.3. Crecer a 37 °C durante la noche.
2. Al día siguiente, coseche las células (OD₆₀₀ ~1,5) vía la centrifugación en 6.000 x g por 10 minutos y resuspend en 2 L de 2 medios YT que contienen 100 mg/L ampicilina. Permita que las células crezcan durante 1 h adicional a 37 °C a un OD₆₀₀ > 0.6.
3. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de 0,5 mM de IPTG. Transferir las células a 18 °C e incubar durante la noche.
4. Al día siguiente, las células de la cosecha como se describe en 2.2. El pellet celular resultante puede congelarse y almacenarse a -20 °C.
5. Pellet de resuspend obtenido de 1 L de cultivo en 50 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) que contiene 1 comprimido inhibidor de proteasa (o equivalente) y 1 μL de bencosa nucleasa.
6. Celdas Lyse usando un sonicador de sonda (500 W, 20 kHz) configurado a 30-50% de potencia durante 4 minutos con un ciclo de trabajo del 50%. Mantenga el lysate en un baño de hielo durante la sonicación
7. Centrifugadora de lisate en 45.000 x g durante 20 min. Deseche la fracción insoluble (pellet).
   1. Eliminar 28 μL de proteína soluble. Combine con 7 μL de búfer SDS-PAGE 5x y almacene para el análisis SDS-PAGE. Repita este paso para las fracciones de flujo, lavado y elución de la columna GST antes y después de la incubación con TEV.
8. Aplicar proteínas solubles (sobrenadante) a una columna de resina de glutatión (~10 mL de volumen total del lecho) equilibrada en PBS pH 7.4.
9. Lave cualquier proteína no ligada usando 50 mL de PBS.
10. Elute GST-Bla g 1 usando 50 mL de PBS que contenía 10 milímetros redujo el glutatión.
11. Incubar la proteína eluida con 0,2 kU de TEV proteasa durante la noche a 4 °C, o a temperatura ambiente durante 6 h para eliminar la etiqueta GST.

3. Eliminación endógena de lípidos a través de HPLC de fase inversa

1. Recoja el Bla g 1 escindido y concéntrelo a ~ 2 mL utilizando una unidad de filtro centrífuga con un corte de peso molecular de <10 kDa.
   1. Agregue <12 mL a la parte superior del concentrador y gire a 5,000 x g durante 10-15 min en un rotor de cubo oscilante.
      NOTA: El volumen de la muestra y la velocidad de giro variarán según el filtro específico y el tipo de rotor empleado. Consulte la documentación del fabricante antes de su uso.
2. Cargue el concentrado en un sistema de HPLC de 250 x 10 mm equipado con una columna de cromatografía de fase inversa C18 equilibrada con un tampón A al 97% (agua, ácido trifluoroacético al 0,1%) y un tampón B al 3% (acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%).
   NOTA: Se pueden utilizar columnas más pequeñas, pero la proteína puede tener que cargarse y eluerse utilizando varios ciclos para acomodar la capacidad de unión reducida. Al seleccionar una columna, asegúrese de que las perlas de resina tengan un tamaño de partícula de < 5 μm y un tamaño de poro de >200 Å para permitir la separación efectiva de moléculas del tamaño de una proteína
   PRECAUCIÓN: El ácido trifluoroacético es altamente corrosivo y debe dispensarse dentro de una campana extractora de humos utilizando el EPP apropiado (es decir, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas). El acetonitrilo es moderadamente tóxico, volátil y altamente inflamable, debe usarse y dispensarse dentro de una campana extractora de humos usando epp apropiado (es decir, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas).
3. Elute Bla g 1 utilizando el protocolo mostrado en la Tabla 1 a un caudal de 1,5–4,0 mL/min. Monitoree el proceso de elución utilizando la absorbancia de fluorescencia a 280 nm.
   1. Recoger y agrupar Bla g 1 fracciones. Bla g 1 normalmente elue a >74% tampón B, o ~34–40 min.
      Nota: El tiempo de elución variará ligeramente dependiendo de la velocidad de flujo o el tamaño de la columna. Recoger fracciones basadas en A₂₈₀ para obtener los mejores resultados.

Tiempo (Min)	Búfer A (%)	Búfer B (%)
0	97	3
10	97	3
25	35	65
55	5	95
65	5	95
70	97	3

Tabla 1: Protocolo de elución para Bla g 1. Tabla que ilustra el gradiente de elución empleado en el aislamiento de Bla g 1 utilizando una columna de HPLC C18.

4. Alícuota la muestra en tubos de ensayo de vidrio, sin llenar ningún tubo de ensayo más de la mitad del camino (~ 4 mL). Cubra los tubos con película de parafina y perfore la cubierta con dos agujeros para permitir la ventilación.
   1. Prepare una alícuota separada de 1 mL (alícuota de prueba). Esto se utilizará para determinar el rendimiento esperado.
5. Congele las muestras y pruebe la alícuota colocándolas en un congelador de -80 °C durante 1 h, o inmersión en nitrógeno líquido. En el caso de los últimos, el tubo debe girarse continuamente para evitar la rotura del tubo de ensayo debido a la expansión de la fase líquida al congelarse.
6. Seque las muestras de proteínas deslipidadas resultantes con un liofilizador. La proteína seca puede almacenarse a 4 °C durante varios meses en un recipiente sellado.

4. Reconstitución de Bla g 1 cargado de apo y carga

1. Determinar el rendimiento anticipado de Bla g 1.
   1. Alícuota de prueba re-liofilizada, deslipidada (post-HPLC) en 5 mL de tampón de refolding, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
   2. Calentar la mezcla en un baño de agua (500 mL de casto con 250 mL de agua y remover la barra sobre una placa caliente) a 95 °C. Las soluciones de vórtice se incuban de forma intermitente e incuban a 95 °C durante 0,5–1 h.
   3. Retire el calor y deje que lentamente el baño de agua se equilibre a temperatura ambiente (~ 1 h). La proteína recocida se puede almacenar en esta forma durante la noche a 4 °C si es necesario.
   4. Pase la mezcla recocida de Bla g 1-lípido a través de un filtro de jeringa de 0,22 μM para eliminar el material particulado.
   5. Intercambio tampón de la proteína filtrada 3x en PBS pH 7.4 utilizando un filtro centrífugo con 10 kDa de corte como se discute en 3.1 para eliminar los ácidos grasos libres residuales y el disolvente orgánico.
   6. Evalúe la concentración de la proteína usando el análisis de BCA u otro método preferido tal como absorbancia ULTRAVIOLETA. Utilícese para determinar el rendimiento previsto para las alícuotas bla g 1 restantes.
2. Reconstituir Apo- o carga cargada Bla g 1
   1. Resuspend Bla g 1 alícuotas en tampón de refolding como se describe en 4.1.1.
   2. Para producir Apo-Bla g 1, repita los pasos 4.1.2–4.1.6 para obtener el rendimiento deseado.
   3. Para cargar Bla g 1 con ácidos grasos, prepare soluciones de 20 mM de la carga de ácidos grasos deseada en metanol o DMSO.  Entonces, salte al paso 4.2.5.
   4. Para cargar Bla g 1 con fosfolípidos, prepare una acción de 10 mg/mL de la carga deseada en cloroformo dentro de un tubo de ensayo de vidrio.
      1. Evapore el cloroformo para producir una película lipídica. Agregue PBS al tubo de ensayo para producir una concentración final de fosfolípidos de 20 mM.
         PRECAUCIÓN: El cloroformo es dañino si se inhala o se ingiere. Use en una campana extractora de humos químicos o emplee un respirador si hay ventilación inadecuada disponible. Emplear guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas al manipular. Consulte MSDS antes de su uso.
      2. Rehidrate la película lipídica calentándola por encima de la temperatura de transición de fase de la carga lipídica y vórtice hasta que la solución se vuelva turbia. Tenga en cuenta que la sonicación puede ser necesaria para resuspend completamente y rehidratar algunas cargas.
      3. Si se requiere sonicación, coloque el tubo de ensayo en el sonicador de baño (100 W, 42 kHz) y sonicar a la máxima potencia hasta que la carga se resuspended. Alternativamente, un sonicador de sonda (descrito en 2.6) se puede utilizar un 10-20% de potencia con un 50% ciclo de trabajo.
         PRECAUCIÓN: Sonicación emplea ondas de sonido de alta frecuencia que pueden dañar la audición. Emplear EPP supresores de ruido (tapones para los oídos o silenciadores). Si es posible, coloque el sonicador dentro del gabinete o cámara de amortiguación de sonido.
   5. Añadir la carga deseada de ácidos grasos o fosfolípidos para producir un exceso molar de ligandos de 20x en relación con Bla g 1 basado en el rendimiento anticipado determinado en 4.1. El volumen total de disolvente orgánico añadido en esta etapa no debe superar el 2%. Vórtice para mezclar.
      NOTA: 1 L de bl 21 células DE3 típicamente produce ~ 0.25–0.4 nmol proteína, correspondiente a ~ 400 μM ligando por tubo.
   6. Recocido de la proteína como se describe en 4.1.

5. Confirmación de la eliminación/carga de la carga de fosfolípidos a través de ³¹P-RMN

1. Concentre muestras de Bla g 1 a >100 μM cargados de apo o carga utilizando una unidad de filtro centrífuga como se describe en 3.1.
2. Fosfolípido de referencia de rehidrato en tampón de PBS a concentraciones finales de 2, 1,5, 1, 0,5 y 0,25 mM.
3. Diluya las muestras 1:1 con tampón de colal (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% p/v colal) a un volumen total de ~600 μL.
   NOTA: Cholate se emplea en este paso para extraer completamente y solubilizar los lípidos de la cavidad hidrofóbica Bla g 1. Esto asegura que el ambiente químico que rodea a los grupos de cabezas de fosfolípidos es consistente entre diferentes muestras, lo que permite su evaluación cuantitativa utilizando ³¹P-RMN. El uso de colato puede sustituirse por cloroformo/metanol como se describió anteriormente¹⁵.
4. Adquiera espectros 1D ³¹P-NMR de las muestras de Bla g 1 colalato-solubilizadas y los estándares de fosfolípidos de referencia utilizando una sonda de banda ancha.
   NOTA: Los ³¹espectros P-NMR presentados en este trabajo se obtuvieron utilizando un espectrómetro de 600 MHz. Sin embargo, estudios anteriores que emplean técnicas similares sugieren que se puede lograr una sensibilidad aceptable en intensidades de campo tan bajas como 150-200 MHz^15.
5. Procesar los datos resultantes utilizando el software apropiado¹⁶.
6. Obtenga las intensidades máximas usando el software preferido de la visión^{del RMN 17.}
7. Compare los espectros Bla g ^{1 31}P-NMR con los obtenidos para las muestras de referencia de fosfolípidos para confirmar la eliminación de ligandos endógenos unidos y/o la unión de los ligandos deseados en función de los cambios químicos de los picos visibles (o la falta de ellos).
   1. Confirme la estequiometría de unión completa comparando la intensidad máxima del espectro Bla g 1 con la de los estándares de referencia de fosfolípidos.

6. Confirmando bla g 1 plegamiento

1. Preparar muestras de 0,5 μM de Bla g 1 en tampón CD (100 mM KH₂PO_4,tampón pH 7,5). Cargue 2 mL de la muestra en una cubeta de CD de 10 mm con barra de agitación magnética.
2. Mida el espectro de CD de Bla g 1 para confirmar la reconstitución de la estructura secundaria. Asegúrese de que el voltaje del fotomultiplicador (PMT) no exceda las recomendaciones del fabricante (generalmente 1 kV).
   1. Mida la señal de CD de 260–200 nm a 25 °C con un paso de datos de 0,2 nm y una velocidad de exploración de 20 nm/s con un tiempo de integración de datos de 1 s.
3. Aumente la temperatura en la celda CD de 25 °C a 95 °C a una velocidad de 0,5 °C/min. Active la barra de agitación magnética para asegurarse de que la temperatura sea uniforme en toda la muestra.
4. Monitor CD a 222 nm, tomando lecturas cada 2 °C.
5. Ajuste los datos resultantes a una curva de Boltzman de 2 estados para determinar la temperatura de fusión. Debido a la alta estabilidad de Bla g 1, la temperatura de fusión (MT₂₅₎se definió como la temperatura a la que la proteína ha perdido el 25% de su CD inicial a 222 nm.

Resultados

Mediante cromatografía de afinidad, el GST-Bla g 1 recombinante se aisló fácilmente a un alto nivel de pureza(Figura 1A),produciendo un rendimiento de ~2-4 mg/L de cultivo celular. La incubación durante la noche con proteasa tev a 4 °C es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final a ~ 24 kDa. Tenga en cuenta que en este caso hay una cantidad significativa de GST-Bla g 1 en las fracciones de flujo y lavado, lo que sugiere que se superó la capacidad de unión de la resina...

Discusión

El protocolo descrito en este trabajo se ha aplicado con éxito para estudiar sistemáticamente las propiedades de unión lipídicas de Bla g 1. Esto reveló una correlación entre la unión a la carga, la termoestabilidad y el procesamiento endosomal, el último de los cuales se correlacionó con la disminución en la generación de un epítopo de células T conocido con posibles implicaciones para la inmunogenicidad^9,18. Además de Bla g 1, se ha demostrado que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bla g 1 Gene	Genescript	N/a	Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor biotechnologies	N/a	Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC-1008
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Benzonase	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe	Varian	N/a
ChemStation for LC (Software)	Agilent	N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System	Labconco	7750000
Glutathione Resin	Genescript	L00206
Glutathione, Reduced	Fisher Scientific	BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD spectropolarimeter	Jasco	J-815
Millex Syringe Filter Unit	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe (Software)	Delaglio et al.	N/a	Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software)	Johnson et al.	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA Protein Assay	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump	Varian	VP-195
Sodium Cholate Hydrate	Sigma-Aldrich	C6445
Sodium Palmitate	Sigma-Aldrich	P9767
Sodium Stearate	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ (Software)	Varian	N/a