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Resumo

Este protocolo descreve a remoção de lipídios endógenos de alérgenos, e sua substituição por ligantes especificados pelo usuário através de HPLC de fase inversa, juntamente com ressarcimento térmico. 31 P-NMR e dicromaísmo circular permitem a confirmação rápida da remoção/carregamento de ligantes e a recuperação da estrutura de alergênicos nativos.

Resumo

Muitos alérgenos principais se ligam a moléculas hidrofóbicas semelhantes a lipídios, incluindo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Esses ligantes são fortemente retidos e têm o potencial de influenciar o processo de sensibilização, seja estimulando diretamente o sistema imunológico ou alterando as propriedades biofísicas da proteína alergênica. Para controlar essas variáveis, são necessárias técnicas para a remoção de ligantes endógenos e, se necessário, substituição por lipídios de composição conhecida. O alérgeno da barata Bla g 1 inclui uma grande cavidade hidrofóbica que une uma mistura heterogênea de lipídios endógenos quando purificado usando técnicas tradicionais. Aqui, descrevemos um método através do qual esses lipídios são removidos usando HPLC de fase reversa seguido de ressarcimento térmico para produzir Bla g 1 em sua forma Apo ou recarregado com uma mistura definida pelo usuário de ácido graxo ou cargas fosfolipídicas. Acoplamento deste protocolo com ensaios bioquímicos revela que as cargas de ácidos graxos alteram significativamente a termoestabilidade e a resistência proteolítica de Bla g 1, com implicações a jusante para a taxa de geração de epítopes de células T e alergenicidade. Esses resultados destacam a importância de protocolos de remoção/recarga lipídica, como o aqui descrito ao estudar alérgenos de fontes recombinantes e naturais. O protocolo é generalizável para outras famílias alérgenas, incluindo lipocalinas (Mus m 1), PR-10 (Aposta v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar o papel dos lipídios na resposta alérgica.

Introdução

Um levantamento do banco de dados de alérgenos revela que os alérgenos são encontrados em apenas 2% de todas as famílias de proteínas conhecidas, sugerindo que propriedades funcionais e biofísicas comuns contribuem para a alergenicidade1. Dessas propriedades, a capacidade de vincular cargas lipídicas parece estar fortemente super-representada entre os alérgenos, sugerindo que essas cargas podem influenciar o processo de sensibilização1. De fato, foi demonstrado que o alergênico Brazil Nut Ber e 1 requer coadministração com seu lipídio endógeno para realizar seu potencial de sensibilização plena2. Esses lipídios poderiam potencialmente estimular o sistema imunológico diretamente como ilustrado pelos alérgenos ácaros Der p 2 e Der p 7, ambos compartilhando uma forte homologia estrutural com proteínas de ligação LPS3,4,5. Com base nessa observação foi proposto que o Derp 2 e o Der p 7 poderiam ligar lipídios bacterianos e estimular diretamente o sistema imunológico hospedeiro através da sinalização mediada pelo TLR4, facilitando o processo de sensibilização5,6. Também é possível que lipídios endógenos ligados possam alterar as propriedades biofísicas das próprias proteínas alergênicas. Por exemplo, a capacidade de Sin a 2 (mostarda) e Ara h 1 (amendoim) de interagir com vesículas fosfolipítidas aumentou significativamente sua resistência à degradação gástrica e endossomal7,enquanto ligante ao alergênico principal do pólen de bétula Bet v 1 alterou tanto a taxa de processamento endosomal quanto a diversidade dos peptídeosresultantes 8. Isso é particularmente relevante para a alergenicidade dada a correlação observada entre estabilidade, geração de epítopes de células T e alergenicidade para proteínas como Bet v 1 e Bla g 1; este último será o tema deste trabalho9,10.

Bla g 1 representa o membro prototípico da família de proteínas do inseto Major Allergen (MA), e possui uma estrutura única composta de 12 helices alfa anfípáticas que incluem uma cavidade hidrofóbica anormalmente grande9,11. A estrutura de cristal de raios-X disponível de Bla g 1 mostra densidade eletrônica dentro desta cavidade consistente com ligantes fosfolipídid ou ácidos graxos ligados; uma conjectura confirmada por 31P-NMR e espectrometria de massa. Essas cargas eram de natureza heterogênea e sua composição dependia fortemente da fonte alérgica, com diferentes perfis lipídicos observados para recombinante Bla g 1 expresso em E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de sua fonte de alérgeno natural (barata frass) continha ácidos predominantemente graxos dentro de seu local de ligação, com uma mistura de palmitato, oleato e estearato sendo identificado como seus ligantes "naturais"9,11. A capacidade de Bla g 1 de reter lipídios e ácidos graxos após múltiplas etapas de purificação dificulta os esforços para estudar a proteína isoladamente. Por outro lado, tem sido sugerido que os ligantes palmitato, estelato e oleate naturais de Bla g 1 (a partir de agora referido como nMix) desempenham um papel fundamental tanto em sua alergenicidade quanto na função biológica nativa9. No entanto, esses ligantes não estão presentes no Bla g 1 obtidos a partir de fontes recombinantes, dificultando a avaliação dessa hipótese. Problemas semelhantes foram observados para outros alérgenos de ligação lipídica, como Bet v 112,13. Para facilitar o estudo sistemático das interações lipídica-alergênicos desenvolvemos um protocolo através do qual os alérgenos podem ser quantitativamente despojados de seus lipídios endógenos ligados e reconstituídos em forma de Apo ou carregados com ligantes específicos.

Os alérgenos são mais comumente purificados de suas fontes naturais ou recombinantes usando cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de exclusão de tamanho. Aqui, introduzimos uma etapa adicional de purificação na forma de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) empregando uma coluna C18 de fase inversa da qual o alérgeno é elucido em um solvente orgânico semelhante aos protocolos desenvolvidos para proteínas de ligação de ácidos graxos14. A proteína resultante é então submetida a um passo de ressarcimento térmico na ausência ou presença de ácidos graxos e/ou fosfolipídios. Além de recuperar a dobra bla g 1 nativa, as temperaturas elevadas aumentam a solubilidade e a acessibilidade das cargas lipídicas, produzindo Bla g 1 na forma de Apo ou uniformemente carregada com o ligante hidrofóbico desejado. 31 Os espectros P-NMR de Bla g 1 purificados desta forma confirmaram a remoção completa de ligantes endógenos e substituição uniforme com os compostos desejados, enquanto o dicromaísmo circular confirmou a recuperação bem sucedida da dobra Bla g 1. A utilidade deste método é destacada em um trabalho recente no qual a vinculação de carga foi encontrada para aumentar a termestabilidade bla g 1 e resistência proteolítica, alterando a cinética da geração de epitope de células T com potenciais implicações para sensibilização e alergenicidade9.

Protocolo

1. Bla g 1 clonagem

  1. Obter gene para alergênico de barata Bla g 1.0101 (resíduos 34-216), representando uma única repetição do domínio MA. Por uma questão de simplicidade, Bla g 1 será usado durante todo o trabalho para representar essa única repetição, em vez de toda a transcrição bla g 1.0101.
  2. Subclone o gene Bla g 1 no vetor desejado. Neste estudo, o gene contendo uma tag de glutationa S-transferase (GST) n-terminal acoplado a um local de decote protease do vírus da estaca de tabaco (TEV) foi inserido em um vetor pGEX para expressão como descrito anteriormente11.
  3. Transforme o vetor Bla g 1 pGEX em células BL21 DE3 E. coli.
    1. Prepare um estoque de 10 ng/μL do vetor desejado.
    2. Combine 1 μL de 10 ng/μL de DNA com 50 μL de células BL21 DE3 fornecidas pelo fabricante.
    3. Incubar a mistura BL21 DE3-DNA por 30 minutos no gelo. Transfira para um banho de água de 42 °C por 1 min e, em seguida, transfira imediatamente de volta ao gelo para uma incubação adicional de 1 min.
    4. Adicione 200 μL de mídia LB às células e incubar por mais 1h a 37 °C.
    5. Emplaque as células transformadas em placas LB-Agar contendo 100 mg/L ampicillin e cresça a 37 °C durante a noite.

2. Expressão inicial e purificação

  1. Inocular 1 L de mídia LB contendo 100 mg/L ampicillin com uma única colônia de células BL21 DE3 transformadas com o vetor Bla g 1, conforme descrito em 1.3. Cresça a 37 °C durante a noite.
  2. No dia seguinte, as células de colheita (OD600 ~1,5) via centrifugação a 6.000 x g por 10 min e resuspend em 2 L de mídia YT 2x contendo 100 mg/L ampicillina. Permitir que as células cresçam por mais 1h a 37 °C a um OD600 > 0,6.
  3. Induzir expressão proteica através da adição de 0,5 mM IPTG. Transfira as células para 18 °C e incubar durante a noite.
  4. No dia seguinte, as células da colheita, conforme descrito em 2,2. A pelota de célula resultante pode ser congelada e armazenada a -20 °C.
  5. Pelota resuspend obtida a partir de 1 L de cultura em 50 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) contendo 1 comprimido inibidor de protease (ou equivalente) e 1 μL de nuclease benzonase.
  6. As células lyse usando um sônico de sonda (500 W, 20 kHz) fixaram 30-50% de potência por 4 minutos com um ciclo de responsabilidade de 50%. Mantenha o lise em um banho de gelo durante a sônicação
  7. Centrifugar lysate a 45.000 x g por 20 min. Descarte fração insolúvel (pelota).
    1. Remova 28 μL de proteína solúvel. Combine com 7 μL de buffer SDS-PAGE de 5x e armazene para análise SDS-PAGE. Repita esta etapa para as frações de fluxo, lavagem e eluição da coluna GST antes e depois da incubação com o TEV.
  8. Aplique proteínas solúveis (supernasce) a uma coluna de resina de glutationa (~10 mL volume total de cama) equilibrada em PBS pH 7.4.
  9. Lave as proteínas não ligadas usando 50 mL de PBS.
  10. Elute GST-Bla g 1 usando 50 mL de PBS contendo glutationa reduzida de 10 mM.
  11. Incubar proteína elucida com protease TEV de 0,2 kU durante a noite a 4 °C, ou temperatura ambiente por 6h para remover a tag GST.

3. Remoção lipídica endógena via HPLC de fase inversa

  1. Colete o Bla g 1 e concentre-o em ~2 mL usando uma unidade de filtro centrífugo com um corte de peso molecular de <10 kDa.
    1. Adicione < 12 mL de amostra ao topo do concentrador e gire a 5.000 x g por 10-15 min em um rotor de balde de balanço.
      NOTA: O volume da amostra e a velocidade de giro variam de acordo com o filtro específico e o tipo de rotor empregado. Consulte a documentação do fabricante antes de usar.
  2. Carregue o concentrado em um sistema HPLC de 250 x 10 mm equipado com uma coluna de cromatografia de fase reversa C18 equilibrada com 97% de tampão A (água, ácido trifluoroacético de 0,1%) e 3% tampão B (acetonitrilo, ácido trifluoroacético de 0,1%).
    NOTA: Podem ser utilizadas colunas menores, mas a proteína pode ter que ser carregada e elucidada usando vários ciclos para acomodar a capacidade de ligação reduzida. Ao selecionar uma coluna certifique-se de que as contas de resina têm um tamanho de partícula de < 5 μm e tamanho de poros de >200 Å para permitir a separação efetiva de moléculas do tamanho de proteínas
    ATENÇÃO: O ácido trifluoroacético é altamente corrosivo e deve ser dispensado dentro de um capô de fumaça usando EPI apropriado (ou seja, luvas de nitrito, jaleco e óculos). A acetonitrila é moderadamente tóxica, volátil e altamente inflamável, deve ser usada e dispensada dentro de um capô de fumaça usando EPI apropriado (ou seja, luvas de nitríis, jaleco e óculos).
  3. Elute Bla g 1 usando o protocolo mostrado na Tabela 1 a uma taxa de fluxo de 1,5-4,0 mL/min. Monitore o processo de elução usando a absorvância de fluorescência a 280 nm.
    1. Coletar e acumular Bla g 1 frações. Bla g 1 normalmente elutes em >74% tampão B, ou ~34-40 min.
      NOTA: O tempo de eluição varia ligeiramente dependendo da taxa de fluxo ou do tamanho da coluna. Colete frações com base em A280 para obter melhores resultados.
Tempo (Min)Buffer A (%)Tampão B (%)
0973
10973
253565
55595
65595
70973

Tabela 1: Protocolo de elução para Bla g 1. Tabela ilustrando o gradiente de elução empregado no isolamento do Bla g 1 utilizando uma coluna C18 HPLC.

  1. Aliquotar a amostra em tubos de teste de vidro, preenchendo nenhum tubo de ensaio mais do que a metade (~4 mL). Cubra tubos com filme de parafina e perfure a cobertura com dois orifícios para permitir a ventilação.
    1. Prepare uma alíquota separada de 1 mL (alíquota de teste). Isso será usado para determinar o rendimento esperado.
  2. Congele as amostras e teste aliquot colocando-as em um congelador de -80 °C por 1 h, ou imersão em nitrogênio líquido. No caso do posterior, o tubo deve ser girado continuamente para evitar a quebra do tubo de ensaio devido à expansão da fase líquida após o congelamento.
  3. Seque as amostras de proteínas delipidadas resultantes usando um liofilizador. A proteína seca pode ser armazenada a 4 °C por vários meses em um recipiente selado.

4. Reconstituição de Apo- e carga carregada Bla g 1

  1. Determine o rendimento de Bla g 1 antecipado.
    1. Alíquota de teste liofilizada, delipidada (pós-HPLC) em 5 mL de tampão de reabastecimento, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
    2. Aqueça a mistura em um banho de água (500 mL de béquer com 250 mL de água e mexa sobre um prato quente) a 95 °C. Soluções de vórtice intermitente e incubam a 95 °C por 0,5-1 h.
    3. Remova o calor e deixe lentamente o banho de água equilibrar-se à temperatura ambiente (~1 h). A proteína enalhada pode ser armazenada desta forma durante a noite a 4 °C, se necessário.
    4. Passe a mistura bla g 1-lipídica recados através de um filtro de seringa de 0,22 μM para remover material particulado.
    5. Tampão troque a proteína filtrada 3x em PBS pH 7.4 usando um filtro centrífuga com corte de 10 kDa como discutido em 3.1 para remover ácidos graxos livres residuais e solvente orgânico.
    6. Avalie a concentração proteica utilizando ensaio BCA ou outro método preferido, como a absorção UV. Use-o para determinar o rendimento antecipado para as alíquotas restantes de Bla g 1.
  2. Reconstituir Apo- ou carga carregada Bla g 1
    1. Resuspend Bla g 1 aliquots em tampão de reabastecimento como descrito em 4.1.1.
    2. Para produzir Apo-Bla g 1, repita as etapas 4.1.2-4.1.6 para obter o rendimento desejado.
    3. Para carregar Bla g 1 com ácidos graxos, prepare soluções de estoque de 20 mM da carga de ácido graxo desejada em metanol ou DMSO.  Em seguida, pule para a etapa 4.2.5.
    4. Para carregar Bla g 1 com fosfolipídios, prepare um estoque de 10 mg/mL da carga desejada em clorofórmio dentro de um tubo de teste de vidro.
      1. Evaporar o clorofórmio para produzir um filme lipídedo. Adicione PBS ao tubo de ensaio para produzir uma concentração fosfolipídida final de 20 mM.
        ATENÇÃO: O clorofórmio é prejudicial se inalado ou engolido. Use em uma capa de fumaça química ou empregue respirador se houver ventilação inadequada. Empregue luvas de nitrito, jaleco e óculos durante o manuseio. Consulte o CET previamente à contratação do financiamento.
      2. Reidratar o filme lipídido aquecendo-o acima da temperatura de transição de fase da carga lipídica e vórtice até que a solução fique nublada. Observe que a sônica pode ser necessária para resuspensar e reidratar algumas cargas.
      3. Se for necessária a sônicação, coloque o tubo de ensaio no sonicador de banho (100 W, 42 kHz) e sonicato em potência máxima até que a carga seja resuspendida. Alternativamente, um sônico de sonda (descrito em 2.6) pode ser usado uma potência de 10 a 20% com um ciclo de missões de 50%.
        ATENÇÃO: A sônica emprega ondas sonoras de alta frequência que podem danificar a audição. Empregue EPI supressor de ruído (tampões de ouvido ou silenciador). Se possível, coloque o sonicator dentro do armário ou câmara de amortecimento de som.
    5. Adicione o ácido graxo desejado ou carga fosfolipídida para produzir um excesso molar de 20x de ligantes em relação a Bla g 1 com base no rendimento previsto determinado em 4.1. O volume total de solvente orgânico adicionado nesta etapa não deve exceder 2%. Vórtice para misturar.
      NOTA: 1 L de células Bl 21 DE3 normalmente produz ~0,25-0,4 nmol de proteína, correspondendo a ~400 μM ligante por tubo.
    6. Anneal a proteína como descrito em 4.1.

5. Confirmando a remoção/carregamento de carga fosfolipídida através de 31P-NMR

  1. Concentrar amostras de Apo ou carga carregada Bla g 1 a >100 μM usando uma unidade de filtro centrífugo conforme descrito em 3.1.
  2. Rehidratar referência fosfolipídida no buffer PBS para concentrações finais de 2, 1,5, 1, 0,5 e 0,25 mM.
  3. Amostras diluídos 1:1 com tampão de colado (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholate) para um volume total de ~600 μL.
    NOTA: O ecânlate é empregado nesta etapa para extrair e solubilizar totalmente lipídios da cavidade hidrofóbica Bla g 1. Isso garante que o ambiente químico ao redor dos grupos de cabeça fosfolipídid seja consistente entre diferentes amostras, permitindo sua avaliação quantitativa usando 31P-NMR. O uso de estoola pode ser substituído por clorofórmio/metanol, conforme descrito anteriormente15.
  4. Adquira espectros 1D 31P-NMR das amostras bla g 1 de colato solubilizadas e padrões fosfolipídid de referência usando uma sonda de banda larga.
    NOTA: Os 31espectres P-NMR apresentados neste trabalho foram obtidos utilizando-se um espectrômetro de 600 MHz. No entanto, estudos anteriores que empregam técnicas semelhantes sugerem que a sensibilidade aceitável pode ser alcançada em pontos fortes de campos tão baixos quanto 150-200 MHz15.
  5. Processe os dados resultantes usando o software apropriado16.
  6. Obtenha intensidades máximas usando o software de visualização NMR preferido17.
  7. Compare o espectro Bla g 1 31P-NMR com o obtido para as amostras de referência fosfolipípica para confirmar a remoção de ligantes endógenos e/ou ligação de ligantes desejados com base nas mudanças químicas dos picos visíveis (ou falta dele).
    1. Confirme a estequiometria de ligação completa comparando a intensidade máxima do espectro Bla g 1 com a dos padrões de referência fosfolipídid.

6. Confirmando Bla g 1 dobrável

  1. Prepare amostras de 0,5 μM de Bla g 1 no buffer de CD (100 mM KH2PO4, pH tampão 7.5). Carregue 2 mL da amostra em uma cuvette CD de 10 mm com barra de meximento magnética.
  2. Medir o espectro de CD de Bla g 1 para confirmar a reconstituição da estrutura secundária. Certifique-se de que a tensão Photomultiplier (PMT) não exceda as recomendações do fabricante (geralmente 1 kV).
    1. Meça o sinal de CD de 260-200 nm a 25 °C com um campo de dados de 0,2 nm e uma taxa de varredura de 20 nm/s com um tempo de integração de dados de 1 s.
  3. Aumente a temperatura na célula CD de 25 °C a 95 °C a uma taxa de 0,5 °C/min. Ative a barra de agitação magnética para garantir que a temperatura seja uniforme em toda a amostra.
  4. Monitore o CD a 222 nm, fazendo leituras a cada 2 °C.
  5. Ajuste os dados resultantes de uma curva boltzman de 2 estados para determinar a temperatura de fusão. Devido à alta estabilidade de Bla g 1, a temperatura de fusão (MT25) foi definida como a temperatura em que a proteína perdeu 25% de seu CD inicial a 222 nm.

Resultados

Usando cromatografia de afinidade, o GST-Bla g 1 recombinante foi prontamente isolado a um alto nível de pureza(Figura 1A),produzindo um rendimento de ~2-4 mg/L de cultura celular. A incubação noturna com protease TEV a 4 °C é suficiente para remover a tag GST, rendendo o produto final a ~24 kDa. Observe que, neste caso, há uma quantidade significativa de GST-Bla g 1 nas frações de fluxo e lavagem, sugerindo que a capacidade de ligação de resina glutathione foi excedida. O uso de mais resina ou...

Discussão

O protocolo descrito neste trabalho tem sido aplicado com sucesso para estudar sistematicamente as propriedades de ligação lipídica de Bla g 1. Isso revelou uma correlação entre ligação de carga, termestabilidade e processamento endossomal, sendo que este último foi correlacionado com a diminuição da geração de um epítope conhecido de células T com potenciais implicações para a imunogenicidade9,18. Além de Bla g 1, outros alérgenos como Pru p 3 ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e Dr. Robert London por sua ajuda e assistência durante este trabalho, juntamente com o Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards pelo uso de sua instrumentação e sua ajuda na geração das construções Bla g 1 empregadas neste estudo. Agradecemos a Andrea Adams pela ajuda com a espectrometria de massa, e o Dr. Eugene DeRose pela ajuda com a instrumentação do RMN. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramuros do NIH, Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bla g 1 Gene GenescriptN/aCustom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)Indoor biotechnologiesN/aCustom order
Agilent 1100 Series HPLC SystemAgilentG1315B, G1311A, G1322AUV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometerAgilentN/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitAmiconUFC-1008
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
BenzonaseSigma-AldrichE1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probeVarianN/a
ChemStation for LC (Software)AgilentN/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor CocktailRoche11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)Avanti Polar Lipids850365C
E. Coli BL21 DE3 CellsNew England BiolabsC2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry SystemLabconco7750000
Glutathione ResinGenescriptL00206
Glutathione, ReducedFisher ScientificBP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Fisher Scientific34060
Jasco  CD spectropolarimeterJascoJ-815
Millex Syringe Filter UnitEMD MilliporeSLGS033SS
NMRPipe (Software)Delaglio et al. N/aDelaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software)Johnson et al. N/aJohnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acidSigma-AldrichO1008
Pierce BCA Protein AssaySigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC ColumnAgilentSKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum PumpVarianVP-195
Sodium Cholate HydrateSigma-AldrichC6445
Sodium PalmitateSigma-AldrichP9767
Sodium StearateSigma-AldrichS3381
VnmrJ (Software)VarianN/a

Referências

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