脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

要約

このプロトコルは、アレルゲンからの内在性脂質の除去と、熱アニーリングと結合された逆相HPLCによるユーザ指定リガンドとの置換を記述する。 ³¹P-NMRおよび円形二色症はリガンドの除去/負荷の速い確認、およびネイティブアレルゲン構造の回復を可能にする。

要約

多くの主要なアレルゲンは、Mus m、Bet v 1、Der p 2、およびFel d 1を含む疎水性脂質様分子に結合します。これらのリガンドは強く保持されており、免疫系を直接刺激するか、アレルギー性タンパク質の生物物理学的性質を変化させることによって感作プロセスに影響を与える可能性を有する。これらの変数を制御するためには、内因性結合リガンドの除去と、必要に応じて既知の組成物の脂質と置換する技術が必要である。ゴキブリアレルゲンブラg1は、従来の技術を使用して精製した場合に内因性脂質の異種混合物を結合する大きな疎水性空洞を囲む。ここでは、逆相HPLCを用いてこれらの脂質を除去し、続いて熱アニーリングを行い、そのアポ形態でBla g 1を得るか、または脂肪酸またはリン脂質カルゴのユーザ定義混合物でリロードする方法について述べた。このプロトコルと生化学的アッセイを結合すると、脂肪酸貨物はBla g 1のサーモスタ性とタンパク質分解性を有意に変化させ、T細胞エピトープ生成およびアレルゲン性の速度に下流の影響を及ぼすことが明らかになった。これらの結果は、組換え源と天然源の両方からアレルゲンを研究する際にここに記載されているような脂質除去/リロードプロトコルの重要性を強調している。このプロトコルは、リポカリン(Mus m 1)、PR-10(Bet v 1)、MD-2(Der p 2)、ウトログロビン(Fel d 1)を含む他のアレルゲンファミリーに一般化可能であり、アレルギー反応における脂質の役割を研究するための貴重なツールを提供する。

概要

アレルゲンデータベースの調査では、アレルゲンは全ての既知のタンパク質ファミリーの2%にしか見つからないことが明らかになっており、一般的な機能的および生物的性質がアレルゲン性¹に寄与することを示唆している。これらの特性のうち、脂質貨物を結合する能力はアレルゲンの間で強く過剰に表現されているように見えるが、これらの貨物が感作プロセス¹に影響を与える可能性があることを示唆している。実際、ブラジルナッツアレルゲンBer e1は、その完全な感作電を実現するためにその内因性脂質との共投与を必要とすることが示されている^2.これらの脂質は、MITアレルゲンDer p2およびDer p 7によって示されるように免疫系を直接刺激する可能性があり、どちらもLPS結合タンパク質^3、4、5と強い構造相同性を共有する。この観察に基づいて、Derp2とDerp7は細菌脂質を結合し、TLR4媒介シグナル伝達を介して宿主免疫系を直接刺激し、感作プロセス^5,6を促進することが提案された。また、内因性に結合した脂質が、アレルギ....

プロトコル

1. ブラ g 1 クローニング

1. ゴキブリアレルゲンブラg1.0101(残基34-216)に対する遺伝子を得て、MAドメインの単一反復を表す。簡単にするために、Bla g 1は、Bla g 1.0101トランスクリプト全体ではなく、この単一の繰り返しを表すために、作業全体で使用されます。
2. 目的のベクターにBla g1遺伝子をサブクローニングする。本研究では、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位に結合したN末端グルタチオンS-トランスビターゼ(GST)タグを含む遺伝子を、前述の¹¹の発現のためにpGEXベクターに挿入した。
3. Bla g 1 pGEX ベクターを BL21 DE3 大腸菌 細胞に変換します。
   1. 目的のベクトルの10 ng/μLストックを準備します。
   2. メーカーが提供するBL21 DE3細胞の50 μLと10 ng/μL DNAストックの1 μLを組み合わせます。
   3. BL21 DE3-DNA混合物を氷上で30分間インキュベートします。42°Cの水浴に1分間移し、すぐに氷の上に戻して1分間のインキュベーションを行います。
   4. 200 μL の LB 培地を細胞に加え、37 °C でさらに 1 時間インキュベートします。
   5. 100 mg/L アンピシリンを含む L....

結果

アフィニティクロマトグラフィーを用いて、組換えGST-Bla g 1は高い純度(図1A)に容易に単離され、細胞培養の収率は〜2〜4mg/Lを産生する。4°CでTEVプロテアーゼを用いた一晩のインキュベーションは、GSTタグを除去するのに十分であり、〜24kDaで最終生成物を得る。なお、この場合、フロースルーおよび洗浄画分にかなりの量のGST-Bla g 1があり、グルタチオン樹脂結合能力を超えたこ.......

ディスカッション

本研究で説明したプロトコルは、ブラg1の脂質結合特性を体系的に研究するためにうまく応用されている。これにより、貨物結合性、サーモスク性、および内因性処理との間の相関が明らかになっており、後者は、免疫原性^に対する潜在的な意味を有する既知のT細胞エピトープの生成の減少と相関^{していた。}Bla g 1に加えて、Pru p 3およびBet v 1のよ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bla g 1 Gene	Genescript	N/a	Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor biotechnologies	N/a	Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC-1008
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Benzonase	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe	Varian	N/a
ChemStation for LC (Software)	Agilent	N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System	Labconco	7750000
Glutathione Resin	Genescript	L00206
Glutathione, Reduced	Fisher Scientific	BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD spectropolarimeter	Jasco	J-815
Millex Syringe Filter Unit	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe (Software)	Delaglio et al.	N/a	Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software)	Johnson et al.	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA Protein Assay	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump	Varian	VP-195
Sodium Cholate Hydrate	Sigma-Aldrich	C6445
Sodium Palmitate	Sigma-Aldrich	P9767
Sodium Stearate	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ (Software)	Varian	N/a