在大鼠中准备去细胞化肾脏脚手架

摘要

该协议引入了使用去细胞化的鼠肾开发脚手架的方法。该协议包括去细胞化和再细胞化过程，以确认生物可用性。脱细胞化使用三顿X-100和硫酸钠进行。

摘要

组织工程是生物医学领域的前沿学科。细胞培养技术可用于功能组织和器官的再生，以取代患病或受损的器官。需要脚手架，以便于在体内使用分化干细胞产生三维器官或组织。在这份报告中，我们描述了一种使用去细胞化的老鼠肾脏开发血管化脚手架的新方法。这项研究使用了8周大的斯普拉格-道利大鼠，肝素被注射到心脏，以方便流入肾脏血管，使肝素渗透到肾脏血管中。腹腔被打开，左肾被收集。收集的肾脏使用洗涤剂，如Triton X-100和硫酸钠，以去细胞化组织，灌注了9小时。然后用1%青霉素/链霉素和肝素轻轻清洗去除细胞碎片和化学残留物。用去细胞化血管脚手架移植干细胞有望促进新器官的产生。因此，血管化脚手架可能为将来器官移植组织工程奠定基础。

引言

细胞培养技术应用于功能组织和器官的再生，以取代患病或受损的器官。同源器官移植是目前最常见的不可逆转器官损伤治疗方法:然而，这种方法需要使用免疫抑制，以防止移植器官的排斥。此外，尽管移植免疫学有所进展，但20%的移植接受者可能在5年内出现急性排斥，在移植后10年内，40%的接受者可能失去移植移植或死亡^1。

组织工程技术的进步为移植新器官带来了新的范式，无需使用分化干细胞进行免疫排斥。干细胞分化后，需要一种称为合成细胞外基质的脚手架，以促进三维器官的生成，使新的组织在受体内茁壮成长。来自去细胞化原生器官的脚手架具有优势，包括建立细胞和增强干细胞增殖的更有效的环境，尽管这些机制尚未完全阐明^2。特别是，肾脏是脚手架生成的合适器官，因为它具有丰富的循环和干细胞建立的利基。此外，由于肾脏结构复杂，很难人工再生肾脏进行器官移植。

在本报告中，我们介绍了一种利用大鼠模型中去细胞化器官开发血管化脚手架的方法，以促进未来用于组织工程目的的动物研究。

研究方案

这项研究得到了釜山国立医科大学的批准，是按照动物使用和护理的道德准则进行的。（2017-119号证书）。在进行任何动物研究之前，应获得机构批准。
注:建议成功进行腹部器官手术演示和成像的所有手术和麻醉器/设备和试剂均详见表1。

1. 大鼠肾脏收获的准备程序

1. 在准备手术时，将8周大的斯普拉格-道利大鼠（重200-250克）放在暖垫上。在直肠中放置直肠温度计探头以监测核心温度。
2. 用5%的异氟烷气体混合物麻醉大鼠（诱导:5%，维护:3%）。
3. 要开始手术，在麻醉后将大鼠置于苏平位置。用胶带将老鼠的四肢放在手术台上。
4. 用杀菌肥皂剃光和清洁供体大鼠的腹部。使用2%的β丁至少1-2分钟，用70%的乙醇溶液擦拭。重复此序列三次。
5. 用无菌的芬斯特化窗帘覆盖手术场。
6. 做一个垂直的腹部切口，并暴露左肾，输尿管，腹主动脉，和劣质静脉卡瓦。
7. 在切割足疗之前，可视化和解剖左肾、输尿管、腹部主动脉和劣质静脉卡瓦。

2. 心肌透注

1. 手术前，准备灌注液。
   1. 每只大鼠制作50mL的灌注溶液。
   2. 将 1 倍 PBS 与大约 10 个 U/mL 肝素混合（1 25 kU 瓶将产生 2.5 升 PBS+Hep）。
   3. 将 8% 的副甲醛与 1 倍 PBS 混合等量，使 4% PFA/1xPBS 解决方案。
      注:8%的PFA在水中可以储存在4°C长达2个月。但是，PBS 中稀释的 4% PFA 仅稳定 1 周，为 4 °C。 使稀释新鲜。
2. 疯狂地伸展垂直腹部切口。切割时一定要把剪刀从器官上拔开，以免损坏内脏。
3. 继续切口通过肋骨笼，然后通过抬起胸骨切开隔膜。
4. 将松动的皮肤皮瓣固定在外，通过用钳子撕裂任何结缔组织来释放心脏。
   注意: 不要用剪刀来释放心脏 ，这可能导致不必要的出血。
5. 打开磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 线，确保线在将针头放入左心室之前流动。用钝钳轻轻握住心脏，并用血压器控制针头。针头的插入不应超过1/4英寸。
   注意:插入大于 1/4 英寸可能导致组织另一侧穿孔。
6. 在用针头和血浆支撑心脏的同时，找到合适的中庭，用虹膜切除术剪刀穿过心脏。将血化体放在大鼠身上，确保针头仍位于心脏内。
   注意:如果切口足够，则应在体腔内有血液，因为流入大鼠的PBS压力会缓解。
7. 小心地解开前脚和皮肤皮瓣。
8. 如果肾脏和肝脏中仍有可见的血液，请继续灌注 PBS 4 分钟或更长时间。

3. 肾脏采集和去细胞化

1. 用腹部主动脉和劣质静脉卡瓦收获左肾。
2. 利盖特尿管，胸动脉，优越的静脉卡瓦，和腹部主动脉的分支。
3. 将器官在杜尔贝科的 PBS （DPBS） 中保持水分，放在 10 厘米的培养皿中。
4. 用23量表导管调节腹部主动脉和劣质静脉卡瓦。要去除残留血液，请将淋巴与围骨泵连接起来，然后用 DPBS （500 mL） 和 16 U/mL 肝素清洗 90 分钟，速度为 5 rpm，速度为 37 °C。
5. 要去细胞化肾脏，用1%的Triton X-100（1 L）香水肾脏3小时，然后用0.75%钠硫酸钠（SDS）溶液（2升）6小时，恒定压力为40毫米汞。
   注:肾脏将在8小时后变得透明。
6. 要去除残留的 SDS，在蒸馏水中（6 L）中用 1% 青霉素将样品灌注 18 小时（过夜），然后用无菌 DPBS （500 mL） 和 16 U/mL 肝素灌注 90 分钟。

结果

老鼠肾的总形态是深红色（图1A）。去细胞化后，肾脏变得苍白和半透明（图1D）。残余基因组DNA根据制造商的说明，在去细胞化的肾脏脚手架中，并与本地肾脏（对照）进行比较，用商业套件进行评估。定量分析证实，组织基因组DNA在去细胞化后几乎被消灭。在14个病例中，控制的平均DNA含量为115.05 ng/μL，去细胞化脚手架的平均DNA含量为1.96 ng/μL。总?...

讨论

各种协议已用于器官和其他组织的去细胞化。最佳的去细胞化协议应保留细胞外基质 （ECM） 的三维结构。一般来说，这种协议包括通过物理处理或离子溶液对细胞膜进行溶解，通过酶处理或洗涤剂将细胞质和细胞核从ECM中分离出来，然后从组织³中去除细胞碎片。物理过程包括刮伤、溶液搅拌、压力梯度、捕捉冻结、非热永久电波和超临界流体^2。组织或器官外...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions	Becton Dickinson	305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis	Ethicon	9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)	Becton Dickinson	305145
3-0 PDS incision closure rat	Ethicon	Z316H
3-0 Prolene incision closure rat	Ethicon	8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat	Braintree Scientific	SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse	Ethicon	Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse	Ethicon	8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse	Braintree Scientific	SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue	Fine Science Tools	14058-09
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut	Fine Science Tools	13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft	Braintree Scientific	.023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps	Fine Science Tools	18052-01 (straight)
		18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin	Fine Science Tools	14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy	Fine Science Tools	15003-08