Preparazione di impalcature renali decellularizzate nei ratti

Riepilogo

Questo protocollo introduce un metodo per sviluppare un'impalcatura utilizzando reni di ratto decellularizzati. Il protocollo include processi di decellularizzazione e ricellularizzazione per confermare la biodisponibilità. La decellularizzazione viene eseguita utilizzando Tritone X-100 e solfato di dodecil di sodio.

Abstract

L'ingegneria tissutale è una disciplina all'avanguardia in biomedicina. Le tecniche di coltura cellulare possono essere applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Le impalcature sono necessarie per facilitare la generazione di organi o tessuti tridimensionali utilizzando cellule staminali differenziate in vivo. In questa relazione descriviamo un nuovo metodo per lo sviluppo di impalcature vascolarizzate che utilizzano reni di ratto decellularizzati. In questo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di otto settimane, ed l'eparina è stata iniettata nel cuore per facilitare il flusso nei vasi renali, permettendo all'eparina di perfondersi nei vasi renali. La cavità addominale è stata aperta e il rene sinistro è stato raccolto. I reni raccolti sono stati perfusi per 9 ore usando detergenti, come Triton X-100 e solfato di dodecil di sodio, per decellularizzare il tessuto. Le impalcature renali decellularizzate sono state poi lavate delicatamente con l'1% di penicillina/streptomicina ed eparina per rimuovere detriti cellulari e residui chimici. Il trapianto di cellule staminali con le impalcature vascolari decellularizzate dovrebbe facilitare la generazione di nuovi organi. Pertanto, le impalcature vascolarizzate possono fornire una base per l'ingegneria tissutale degli innesti di organi in futuro.

Introduzione

Le tecniche di coltura cellulare sono applicate per la rigenerazione di tessuti e organi funzionali per sostituire gli organi matti o danneggiati. Il trapianto di organi allogenici è attualmente il trattamento più comune per danni irreversibili agli organi; tuttavia, questo approccio richiede l'uso di immunosoppressione per prevenire il rigetto dell'organo trapiantato. Inoltre, nonostante i progressi nell'immunologia dei trapianti, il 20% dei riceventi di trapianti può sperimentare un rigetto acuto entro 5 anni e, entro 10 anni dal trapianto, il 40% dei riceventi può perdere l'innesto trapiantato o morire¹.

I progres....

Protocollo

Questo studio è stato approvato dalla somministrazione della Pusan National University of Medicine ed è stato condotto in conformità con le linee guida etiche per l'uso e la cura degli animali. (certificato n. 2017-119). Prima di qualsiasi studio sugli animali, dovrebbe essere ottenuta l'approvazione istituzionale.
NOTA: Tutti gli strumenti/attrezzature chirurgiche e anestetiche e i reagenti raccomandati per una presentazione chirurgica di successo e l'imaging di organi addominali sono dettagliati nella tabella 1.

1. Procedure di preparazione per la raccolta dei reni del ratto

1. In preparazione all'intervento chi....

Risultati

La morfologia grossolana dei reni del ratto era rosso scuro(figura 1A). Dopo la decellularizzazione, il rene è diventato pallido e traslucido (Figura 1D). Il DNA genomico residuo è stato valutato con un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, in impalcature renali decellularizzate e confrontato con quello nei reni nativi (controllo). L'analisi quantitativa ha confermato che il DNA genomico tissutale è stato quasi eliminato dopo la decellularizza.......

Discussione

Vari protocolli sono stati utilizzati per la decellularizzazione di organi e altri tessuti. Il protocollo di decellularizzazione ottimale deve preservare l'architettura tridimensionale della matrice extracellulare (ECM). In generale, tali protocolli consistono nel lisciviare la membrana cellulare mediante elaborazione fisica o soluzioni ioniche, dissociare il citoplasma e il nucleo dall'ECM mediante lavorazione enzimatica o detergenti, quindi rimuovere i detriti cellulari dal tessuto³. I processi .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions	Becton Dickinson	305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis	Ethicon	9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)	Becton Dickinson	305145
3-0 PDS incision closure rat	Ethicon	Z316H
3-0 Prolene incision closure rat	Ethicon	8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat	Braintree Scientific	SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse	Ethicon	Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse	Ethicon	8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse	Braintree Scientific	SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue	Fine Science Tools	14058-09
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut	Fine Science Tools	13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft	Braintree Scientific	.023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps	Fine Science Tools	18052-01 (straight)
		18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin	Fine Science Tools	14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy	Fine Science Tools	15003-08