Preparação de andaimes renais descelularizados em ratos

Resumo

Este protocolo introduz um método para desenvolver um andaime usando rins descelularizados. O protocolo inclui processos de descelularização e recelularização para confirmar a biodisponibilidade. A descelularização é realizada utilizando-se triton X-100 e sulfato de dodecyl de sódio.

Resumo

Engenharia de tecidos é uma disciplina de ponta na biomedicina. Técnicas de cultura celular podem ser aplicadas para a regeneração de tecidos e órgãos funcionais para substituir órgãos doentes ou danificados. Andaimes são necessários para facilitar a geração de órgãos ou tecidos tridimensionais usando células-tronco diferenciadas in vivo. Neste relatório, descrevemos um novo método para o desenvolvimento de andaimes vascularizados usando rins descelularizados. Os ratos Sprague-Dawley de oito semanas de idade foram usados neste estudo, e a heparina foi injetada no coração para facilitar o fluxo para os vasos renais, permitindo que a heparina perfunde para os vasos renais. A cavidade abdominal foi aberta, e o rim esquerdo foi coletado. Os rins coletados foram perfundidos por 9h usando detergentes, como Tritão X-100 e sulfato de dodecyl de sódio, para descelularizar o tecido. Os andaimes renais descelularizados foram então lavados suavemente com penicilina/estreptomicina de 1% e heparina para remover detritos celulares e resíduos químicos. Espera-se que o transplante de células-tronco com os andaimes vasculares descelularizados facilite a geração de novos órgãos. Assim, os andaimes vascularizados podem fornecer uma base para a engenharia tecidual dos enxertos de órgãos no futuro.

Introdução

Técnicas de cultura celular são aplicadas para a regeneração de tecidos e órgãos funcionais para substituir órgãos doentes ou danificados. O transplante de órgãos aogênicos é atualmente o tratamento mais comum para danos irreversíveis aos órgãos; no entanto, essa abordagem requer o uso de imunossupressão para evitar a rejeição do órgão transplantado. Além disso, apesar dos avanços na imunologia do transplante, 20% dos transplantados podem sofrer rejeição aguda dentro de 5 anos, e dentro de 10 anos após o transplante, 40% dos receptores podem perder o enxerto transplantado ou morrer¹.

Os avanços nas tecnologias de engenharia de tecidos têm rendido um novo paradigma para o transplante de novos órgãos sem rejeição imunológica usando células-tronco diferenciadas. Após a diferenciação de células-tronco, um andaime, chamado de matriz extracelular sintética, é necessário para facilitar a geração de órgãos tridimensionais e permitir que o novo tecido prospere dentro do receptor. Andaimes de órgãos nativos descelularizados têm vantagens, incluindo um ambiente mais eficaz para o estabelecimento de células e o aprimoramento da proliferação de células-tronco, embora esses mecanismos não tenham sido totalmente elucidados². Em particular, o rim é um órgão adequado para a geração de andaimes porque tem circulação abundante e um nicho para o estabelecimento de células-tronco. Além disso, devido à complexa estrutura do rim, é difícil regenerar artificialmente os rins para transplante de órgãos.

Neste relatório, introduzimos um método de desenvolvimento de andaimes vascularizados utilizando órgãos descelularizados em um modelo de rato para facilitar futuros estudos em animais para fins de engenharia de tecidos.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pela administração da Universidade Nacional de Medicina de Pusan e foi conduzido de acordo com diretrizes éticas para o uso e cuidado dos animais. (certificado nº 2017-119). Antes de qualquer estudo em animais, deve-se obter aprovação institucional.
NOTA: Todos os instrumentos/equipamentos cirúrgicos e anestésicos recomendados para apresentação cirúrgica bem sucedida e imagem de órgãos abdominais estão detalhados na Tabela 1.

1. Procedimentos de preparação para a colheita de rins de rato

1. Em preparação para a cirurgia, coloque ratos Sprague-Dawley de 8 semanas de idade (pesando 200-250 g) em uma almofada de aquecimento. Coloque uma sonda de termômetro retal no reto para monitorar a temperatura do núcleo.
2. Anestesiar o rato com uma mistura de 5% de gás isoflurane (indução: 5%, manutenção: 3%).
3. Para iniciar a operação, coloque o rato em uma posição supina após a administração da anestesia. Monte os quatro membros do rato na mesa de operação com fita adesiva.
4. Raspe e limpe o abdômen do doador com sabão germicidal. Aplique 2% de betadina por pelo menos 1-2 min, e limpe com uma solução de 70% de etanol. Repita esta sequência três vezes.
5. Cubra o campo operacional com uma cortina fenestrada estéril.
6. Faça uma incisão abdominal vertical e exponha o rim esquerdo, ureter, aorta abdominal e veia cava inferior.
7. Visualize e disseque o rim esquerdo, ureter, aorta abdominal e veia cava inferior pouco antes de cortar o pedículo.

2. Perfusão transcárvia

1. Antes da cirurgia, prepare a solução de perfusão.
   1. Faça 50 mL de solução de perfusão por rato.
   2. Misture 1x PBS com aproximadamente 10 U/mL de heparina (1 frasco de 25 kU fará 2,5 L de PBS+Hep).
   3. Misture volumes iguais de 8% de paraformaldeído com 1x PBS para fazer a solução PFA/1xPBS de 4%.
      NOTA: 8% de PFA feito na água pode ser armazenado a 4 °C por até 2 meses. No entanto, 4% de PFA diluído em PBS só é estável por 1 semana a 4 °C. Faça a diluição fresca.
2. Estenda a incisão abdominal vertical cranialmente. Certifique-se de retirar a tesoura dos órgãos ao cortar para evitar danificar os órgãos internos.
3. Continue a incisão através da caixa torácica, e depois corte através do diafragma levantando o esterno.
4. Tire o retalho solto da pele para fora do caminho, e liberte o coração rasgando qualquer tecido conjuntivo com as fórceps.
   ATENÇÃO: Não use a tesoura para libertar o coração e isso pode resultar em sangramento indesejado.
5. Abra a linha salina tamponada com fosfato (PBS) e certifique-se de que a linha está fluindo antes de colocar a agulha no ventrículo esquerdo. Segure o coração suavemente com fórceps sem cortes, e use um hemostat para controlar a agulha. A agulha deve ser inserida não mais do que 1/4 polegada.
   NOTA: A inserção superior a 1/4 polegada pode resultar em perfuração para o outro lado do tecido.
6. Enquanto sustenta o coração com a agulha e o hemostat, localize o átrio direito e corte-o com uma tesoura de iridectomia. Descanse o hemostat sobre o corpo do rato, e certifique-se de que a agulha ainda está posicionada dentro do coração.
   NOTA: Se o corte for suficiente, deve haver sangue na cavidade corporal, pois a pressão do PBS que flui para o rato é aliviada.
7. Despreocupe cuidadosamente os pés dianteiros e a aba da pele.
8. Continue perfundiando PBS por 4 minutos ou mais se ainda houver sangue visível no rim e fígado.

3. Colheita e descelularização de rins

1. Colher o rim esquerdo com a aorta abdominal e veia cava inferior.
2. Ligate o ureter, aorta torácica, veia cava superior, e ramos da aorta abdominal.
3. Mantenha o órgão hidratado na PBS de Dulbecco (DPBS) em uma placa de Petri de 10 cm.
4. Cannulate a aorta abdominal e a cava vena inferior com um cateter calibre 23. Para remover o sangue residual, conecte a cânula com uma bomba peristáltica e lave com DPBS (500 mL) e heparina de 16 U/mL por 90 min a uma taxa de 5 rpm a 37 °C.
5. Para descelularizar o rim, perfunde o rim com 1% Triton X-100 (1 L) por 3 h e depois com solução de sulfato de dodecyl de sódio de 0,75% (SDS) solução (2 L) por 6h a uma pressão constante de 40 mmHg.
   NOTA: O rim ficará transparente após 8h.
6. Para remover sds residuais, perfundir a amostra com penicilina de 1% em água destilada (6 L) por 18 h (durante a noite) e, em seguida, com DPBS estéreis (500 mL) e 16 U/mL heparina por 90 min.

Resultados

A morfologia bruta dos rins de rato era vermelho escuro(Figura 1A). Após a descelularização, o rim ficou pálido e translúcido(Figura 1D). O DNA genômico residual foi avaliado com um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante, em andaimes renais descelularizados e comparado com o dos rins nativos (controle). A análise quantitativa confirmou que o DNA genômico tecidual foi quase eliminado após a descelularização. De 14 casos, o conteúdo ...

Discussão

Vários protocolos têm sido utilizados para a descelularização de órgãos e outros tecidos. O protocolo ideal de descelularização deve preservar a arquitetura tridimensional da matriz extracelular (ECM). Em geral, tais protocolos consistem em lise da membrana celular por meio de processamento físico ou soluções iônicas, dissociando o citoplasma e o núcleo do ECM por processamento enzimático ou detergentes, e, em seguida, removendo detritos celulares do tecido³. Os processos físicos in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions	Becton Dickinson	305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis	Ethicon	9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)	Becton Dickinson	305145
3-0 PDS incision closure rat	Ethicon	Z316H
3-0 Prolene incision closure rat	Ethicon	8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat	Braintree Scientific	SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse	Ethicon	Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse	Ethicon	8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse	Braintree Scientific	SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue	Fine Science Tools	14058-09
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut	Fine Science Tools	13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft	Braintree Scientific	.023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps	Fine Science Tools	18052-01 (straight)
		18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin	Fine Science Tools	14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy	Fine Science Tools	15003-08