Sıçanlarda Hücreden Sönmemiş Böbrek İskelelerinin Hazırlanması

Özet

Bu protokol, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak bir iskele geliştirmek için bir yöntem sunar. Protokol, biyoyararlanıcılığı doğrulamak için hücreden arındırma ve yeniden hücreleştirme süreçlerini içerir. Desellülerizasyon Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.

Özet

Doku mühendisliği biyotıpta son teknoloji bir disiplindir. Hastalıklı veya hasarlı organların yerine fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için hücre kültürü teknikleri uygulanabilir. Vivo olarak farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak üç boyutlu organ veya dokuların üretilmesini kolaylaştırmak için iskelelere ihtiyaç vardır. Bu raporda, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak damarlı iskeleler geliştirmek için yeni bir yöntem anlatıyoruz. Bu çalışmada sekiz haftalık Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı ve heparin böbrek damarlarına akışı kolaylaştırmak için kalbe enjekte edildi ve heparinin böbrek damarlarına nüfuz etmesini sağladı. Karın boşluğu açıldı ve sol böbrek toplandı. Toplanan böbrekler, dokuyu hücreden çıkarmak için Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat gibi deterjanlar kullanılarak 9 saat boyunca perfüzyona uğradı. Hücreden çıkarıcı böbrek iskeleleri daha sonra hücresel kalıntıları ve kimyasal kalıntıları gidermek için% 1 penisilin / streptomisinin ve heparin ile nazikçe yıkandı. Kök hücrelerin hücre dışılaştırılmış damar iskeleleri ile naklinin yeni organların üretilmesini kolaylaştırması beklanmaktadır. Böylece, damarlı iskeleler gelecekte organ greftlerinin doku mühendisliği için bir temel sağlayabilir.

Giriş

Hücre kültürü teknikleri, hastalıklı veya hasarlı organların yerini alacak fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için uygulanır. Allojenik organ nakli şu anda geri dönüşü olmayan organ hasarının en yaygın tedavisidir; ancak bu yaklaşım, nakledilen organın reddedilmesini önlemek için immünosupresyon kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, transplant immünolojislerindeki gelişmelere rağmen, nakil alıcılarının% 20'si 5 yıl içinde akut ret yaşayabilir ve transplantasyondan sonraki 10 yıl içinde, alıcıların% 40'ı nakledilen greftini kaybedebilir veya¹ölebilir.

Doku mühendisliği teknolojilerindeki gelişmeler, farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak bağışıklık reddi olmadan yeni organların nakli için yeni bir paradigma ortaya koymuştur. Kök hücre farklılaşmasından sonra, üç boyutlu organların üretilmesini kolaylaştırmak ve yeni dokunun alıcı içinde gelişmesini sağlamak için sentetik hücre dışı matris adı verilen bir iskeleye ihtiyaç vardır. Hücre dışılaştırılmış yerli organlardan gelen iskeleler, hücrelerin kurulması ve kök hücre çoğalmasının artırılması için daha etkili bir ortam da dahil olmak üzere avantajlara sahiptir, ancak bu mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır². Özellikle böbrek, bol dolaşıma ve kök hücre kuruluşu için bir nişe sahip olduğu için iskele üretimi için uygun bir organdır. Ek olarak, böbreğin karmaşık yapısı nedeniyle, organ nakli için böbrekleri yapay olarak yenilemek zordur.

Bu raporda, doku mühendisliği amacıyla gelecekteki hayvan çalışmalarını kolaylaştırmak için bir sıçan modelinde hücreden sönmemiş organlar kullanarak damarlı iskeleler geliştirme yöntemini tanıtıyoruz.

Protokol

Bu çalışma Pusan Ulusal Tıp Üniversitesi yönetimi tarafından onaylanmış ve hayvanların kullanımı ve bakımı için etik kurallara uygun olarak yapılmıştır. (sertifika no. 2017-119). Herhangi bir hayvan çalışması öncesinde kurumsal onay alınmalıdır.
NOT: Karın organlarının başarılı cerrahi sunumu ve görüntülenmesi için önerilen tüm cerrahi ve anestezik aletler/ekipmanlar ve reaktifler Tablo 1'deayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Sıçan böbreklerinin toplanması için hazırlık prosedürleri

1. Ameliyata hazırlanırken, 8 haftalık Sprague-Dawley sıçanlarını (200-250 g ağırlığında) bir ısınma yastığına yerleştirin. Çekirdek sıcaklığını izlemek için rektum içine bir rektal termometre probu yerleştirin.
2. Sıçanı% 5 izofluran gazı karışımı ile uyuşturun (indüksiyon: % 5, bakım: % 3).
3. Operasyona başlamak için, anestezinin verilmesinden sonra sıçanı bir supine pozisyonuna yerleştirin. Sıçanın dört uzuvlarını bantla ameliyat masasına monte edin.
4. Donör sıçanın karnını mikrop öldürücü sabunla tıraş edin ve temizleyin. En az 1-2 dakika boyunca% 2 betadin uygulayın ve% 70 etanol çözeltisi ile silin. Bu sırayı üç kez tekrarlayın.
5. Ameliyat alanını steril bir fenestratlı örtü ile örtün.
6. Dikey bir karın kesiği yapın ve sol böbreği, üretteri, abdominal aortu ve alt vena kavayı ortaya çıkarın.
7. Pedileyi kesmeden hemen önce sol böbreği, üretteri, abdominal aortu ve alt vena kavayı görselleştirin ve parçalara ayırın.

2. Transkardiyal perfüzyon

1. Ameliyattan önce perfüzyon çözeltisini hazırlayın.
   1. Sıçan başına 50 mL perfüzyon çözeltisi yapın.
   2. 1x PBS'i yaklaşık 10 U/mL heparin ile karıştırın (1 25 kU şişe 2,5 L PBS +Hep yapacaktır).
   3. %4 PFA/1xPBS çözümünü yapmak için 1x PBS ile %8'lik eşit hacimlerde paraformaldehit karıştırın.
      NOT: Suda yapılan %8 PFA 2 aya kadar 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, PBS'de seyreltilmiş% 4 PFA sadece 4 ° C'de 1 hafta boyunca stabildir. Seyreltme taze olsun.
2. Dikey karın kesisini kranially olarak uzatın. İç organlara zarar vermemek için keserken makası organlardan çektiğinizden emin olun.
3. Kesiği göğüs kafesinden devam ettirin ve ardından sternumu kaldırarak diyaframı kesin.
4. Derinin gevşek kapağını yoldan çekin ve herhangi bir bağ dokusunups ile yırtarak kalbi serbest bırakın.
   DİkKAT: Kalbi serbest bırakmamak için makası kullanmayın ve bu istenmeyen kanamalara neden olabilir.
5. Fosfat tamponlu salin (PBS) hattını açın ve iğneyi sol ventriküle yerleştirmeden önce hattın aktığından emin olun. Kalbi künt tokmaklarla hafifçe tutun ve iğneyi kontrol etmek için bir hemostat kullanın. İğne en fazla 1/4 inç sokulmalıdır.
   NOT: 1/4 inçten büyük ekleme, dokunun diğer tarafına delik açabilir.
6. İğne ve hemostat ile kalbi desteklerken, sağ kulakçığı bulun ve iridektomi makası ile içinden kesin. Hemostat farenin vücuduna yaslanın ve iğnenin hala kalbin içine yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
   NOT: Kesik yeterliyse, PBS'den sıçana akan basınç hafiflemiş olduğu için vücut boşluğunda kan olmalıdır.
7. Ön ayakları ve cilt kapağını dikkatlice sabitle.
8. Böbrek ve karaciğerde hala kan görünüyorsa PBS'ye 4 dakika veya daha uzun süre perfüzyona devam edin.

3. Böbrek hasadı ve hücreden arındırma

1. Sol böbreği abdominal aort ve inferior vena kava ile hasat edin.
2. Üretter, torasik aort, üstün vena kava ve abdominal aortu dallarını ligat.
3. Dulbecco'nun PBS'sinde (DPBS) 10 cm'lik petri kabında organı nemli tutun.
4. Abdominal aort ve inferior vena kavayı 23 Gauge kateter ile yalıtın. Artık kanı çıkarmak için kanülleri peristaltik bir pompaya bağlayın ve DPBS (500 mL) ve 16 U/mL heparin ile 37 °C'de 5 rpm hızında 90 dakika yıkayın.
5. Böbreği desellülerize etmek için, böbreği 3 saat boyunca% 1 Triton X-100 (1 L) ve daha sonra 40 mmHg sabit basınçta 6 saat boyunca% 0.75 sodyum dodecyl sülfat (SDS) çözeltisi (2 L) ile perfuse edin.
   NOT: Böbrek 8 saat sonra şeffaf hale gelecektir.
6. Artık SDS'yi çıkarmak için, numuneyi damıtılmış suda (6 L) %1 penisilin ile 18 saat (geceleme) ve ardından steril DPBS (500 mL) ve 16 U/mL heparin ile 90 dakika boyunca perfuse edin.

Sonuçlar

Sıçan böbreklerinin brüt morfolojisi koyu kırmızıydı (Şekil 1A). Hücreden arındırma sonrası böbrek soluk ve yarı saydam hale geldi(Şekil 1D). Kalıntı genomik DNA, üreticinin talimatlarına göre, hücreden sönmemiş böbrek iskelelerinde ve yerli böbreklerdeki (kontrol) ile karşılaştırıldığında ticari bir kit ile değerlendirildi. Kantitatif analiz, doku genomik DNA'sının hücreden arındırıldıktan sonra neredeyse ortadan kaldı...

Tartışmalar

Organların ve diğer dokuların hücreden arındırılması için çeşitli protokoller kullanılmıştır. En uygun hücre dışılaştırma protokolü, hücre dışı matrisin (ECM) üç boyutlu mimarisini korumalıdır. Genel olarak, bu tür protokoller hücre zarının fiziksel işleme veya iyonik çözeltilerle lizin edilmesi, sitoplazma ve çekirdeğin enzimatik işleme veya deterjanlarla ECM'den ayrıştırması ve daha sonra hücresel kalıntıların dokudan çıkarılmasından oluşur³. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions	Becton Dickinson	305217
10-0 ethilon for vessel anastomosis	Ethicon	9032G
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters)	Becton Dickinson	305145
3-0 PDS incision closure rat	Ethicon	Z316H
3-0 Prolene incision closure rat	Ethicon	8832H
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat	Braintree Scientific	SUT-S 110
4-0 PDS incision closure mouse	Ethicon	Z773D
4-0 Prolene incision closure mouse	Ethicon	8831H
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse	Braintree Scientific	SUT-S 106
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue	Fine Science Tools	14058-09
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12001-13
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut	Fine Science Tools	13018-14
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft	Braintree Scientific	.023" × .038”
Schwartz microserrefine vascular clamps	Fine Science Tools	18052-01 (straight)
		18052-03 (curved)
Surgical Scissors to cut skin	Fine Science Tools	14002-12
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy	Fine Science Tools	15003-08