Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Method Article
Ce protocole introduit une méthode pour développer un échafaudage utilisant les reins de rat décellulaires. Le protocole comprend des processus de décellularisation et de recellularisation pour confirmer la biodisponibilité. La décellularisation est réalisée à l’aide de Triton X-100 et de dodécyl sulfate de sodium.
Le génie tissulaire est une discipline de pointe en biomédecine. Des techniques de culture cellulaire peuvent être appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. Des échafaudages sont nécessaires pour faciliter la génération d’organes ou de tissus tridimensionnels à l’aide de cellules souches différenciées in vivo. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode originale pour développer des échafaudages vascularisés utilisant les reins decellularized de rat. Huit semaines-vieux rats de Sprague-Dawley ont été utilisés dans cette étude, et l’héparine a été injectée dans le coeur pour faciliter l’écoulement dans les navires rénaux, permettant à l’héparine de perfuser dans les navires rénaux. La cavité abdominale a été ouverte, et le rein gauche a été rassemblé. Les reins collectés ont été perfusés pendant 9 h utilisant des détergents, tels que Triton X-100 et le sulfate de dodécyle de sodium, pour décellulariser le tissu. Des échafaudages décellulaires de rein ont été alors doucement lavés avec 1% de pénicilline/streptomycine et d’héparine pour enlever les débris cellulaires et les résidus chimiques. On s’attend à ce que la transplantation de cellules souches avec les échafaudages vasculaires décellulaires facilite la génération de nouveaux organes. Ainsi, les échafaudages vascularisés peuvent fournir une base pour l’ingénierie tissulaire des greffes d’organe à l’avenir.
Les techniques de culture cellulaire sont appliquées pour la régénération des tissus et organes fonctionnels afin de remplacer les organes malades ou endommagés. La transplantation d’organes allogéniques est actuellement le traitement le plus courant pour les dommages irréversibles aux organes; cependant, cette approche exige l’utilisation de l’immunosuppression pour empêcher le rejet de l’organe transplanté. De plus, malgré les progrès de l’immunologie de la transplantation, 20% des greffés peuvent subir un rejet aigu dans les 5 ans, et dans les 10 ans suivant la transplantation, 40% des receveurs peuvent perdre leur greffe transplantée ou mourir1.
Les progrès des technologies d’ingénierie tissulaire ont donné lieu à un nouveau paradigme pour la transplantation de nouveaux organes sans rejet immunitaire à l’aide de cellules souches différenciées. Après la différenciation des cellules souches, un échafaudage, appelé matrice extracellulaire synthétique, est nécessaire pour faciliter la génération d’organes tridimensionnels et permettre au nouveau tissu de prospérer chez le receveur. Les échafaudages d’organes natifs décellulaires présentent des avantages, notamment un environnement plus efficace pour l’établissement de cellules et l’amélioration de la prolifération des cellules souches, bien que ces mécanismes n’aient pas été entièrement élucularisés2. En particulier, le rein est un organe approprié pour la génération d’échafaudages car il a une circulation abondante et une niche pour l’établissement de cellules souches. De plus, en raison de la structure complexe du rein, il est difficile de régénérer artificiellement les reins pour la transplantation d’organes.
Dans ce rapport, nous introduisons une méthode de développer des échafaudages vascularisés utilisant les organes decellularized dans un modèle de rat pour faciliter de futures études animales à des fins d’ingénierie tissulaire.
Cette étude a été approuvée par l’administration de l’Université nationale de médecine de Pusan et a été menée conformément aux directives éthiques pour l’utilisation et les soins des animaux. (certificat no 2017-119). Avant toute étude sur les animaux, l’approbation de l’établissement doit être obtenue.
NOTA : Tous les instruments, équipements et réactifs chirurgicaux et anesthésiques recommandés pour une présentation chirurgicale et une imagerie réussies des organes abdominaux sont détaillés dans le tableau 1.
1. Procédures de préparation pour la récolte des reins de rat
2. Perfusion transcardique
3. Récolte et décellularisation des reins
La morphologie brute des reins de rat était rouge foncé (figure 1A). Après la décellularisation, le rein est devenu pâle et translucide(figure 1D). L’ADN génomique résiduel a été évalué à l’utilisation d’une trousse commerciale conformément aux instructions du fabricant, dans des échafaudages rénaux décellulaires et comparé à celui des reins natifs (témoins). L’analyse quantitative a confirmé que l’ADN génomique des tissus était p...
Divers protocoles ont été utilisés pour la décellularisation des organes et d’autres tissus. Le protocole de décellularisation optimal devrait préserver l’architecture tridimensionnelle de la matrice extracellulaire (ECM). En général, de tels protocoles consistent à lyser la membrane cellulaire par traitement physique ou par solutions ioniques, à dissocier le cytoplasme et le noyau de l’ECM par traitement enzymatique ou détergents, puis à éliminer les débris cellulaires du tissu3.
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Cette étude a été soutenue par une subvention de l’Institut de recherche biomédicale de l’hôpital universitaire national de Pusan.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
18052-03 (curved) | |||
Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon