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摘要

在免疫疗法和单细胞基因组分析时代，癌症生物学需要新颖的体外和计算工具，以便在适当的时空背景下研究肿瘤 - 免疫界面。我们描述了在2D和3D环境中利用肿瘤免疫微流体共培养的方案，与细胞功能的动态，多参数监测兼容。

摘要

复杂的疾病模型需要尖端工具，能够提供生理和病理相关、可操作的见解，并揭示原本看不见的过程。密切模拟体内场景的高级细胞测定正在成为可视化和测量影响癌症进展的双向肿瘤 - 宿主相互作用的新方法。在这里，我们描述了两种通用方案，在自然和治疗诱导的免疫监视下，在微设备中重现高度可控的2D和3D共培养，模拟肿瘤微环境（TME）的复杂性。在第1节中，提供了一个实验设置，通过明场延时显微镜监测贴壁肿瘤细胞和浮动免疫群体之间的串扰。作为一种应用场景，我们分析了抗癌治疗的效果，例如所谓的免疫原性癌细胞死亡诱导剂对免疫细胞募集和激活的影响。在第2部分中，3D肿瘤免疫微环境以竞争布局组装。通过长达72小时的荧光快照监测差异免疫浸润，以评估联合治疗策略。在这两种设置中，图像处理步骤都说明了提取过多的免疫细胞参数（例如，免疫细胞迁移和相互作用，对治疗剂的反应）。这些简单而强大的方法可以进一步定制，以模拟TME的复杂性，包括癌症，基质和免疫细胞亚型的异质性和可塑性，以及它们作为癌症进化驱动因素的相互作用。这些快速发展的技术与活细胞高内涵成像的兼容性可能导致大型信息数据集的生成，从而带来新的挑战。事实上，三角形"共培养/显微镜/高级数据分析"为精确的问题参数化铺平了道路，这可能有助于量身定制的治疗方案。我们预计，未来癌症免疫芯片与用于高通量处理的人工智能的整合将在利用预测和临床前工具的能力进行精确和个性化的肿瘤学方面向前迈出一大步。

引言

作为实验学科的不同医学分支的演变取决于在受控条件下操纵细胞群和器官功能的能力1。这种能力源于可测量模型的可用性，这些模型能够概括我们体内发生的过程。

在免疫治疗和单细胞基因组分析2的时代，癌症生物学需要利用新兴的体外和计算模型在适当的时空背景下研究肿瘤 - 免疫界面2，3。

肿瘤微环境4（TME）是一种复杂的组织，癌细胞与其他细胞（免疫细胞、基质细胞和内皮细胞）和非细胞（细胞外基质，ECM）成分不断相互作用并动态共同进化。这种复杂景观的动态性质决定了免疫细胞是作为恶性细胞的朋友还是敌人，从而强烈影响疾病进展和对治疗的反应。如今，肿瘤免疫学家、生物信息学家和系统生物学专家的巨大努力正在汇聚在一起，以解决癌症异质性5，6的临床意义，无论是在空间（即，在不同的肿瘤区域）还是在时间（即，在不同的肿瘤进展阶段）5，6，并在单细胞水平上表征癌症和免疫细胞表型和功能。作为这种协同作用的一个例子，先进的计算机视觉技术现在通常用于组织学样本中免疫浸润的空间映射7，8。

在实验模型的前端，桥接动物研究和传统的体外方法，微流体和共培养技术的进步提供了不同类别的微工程细胞模型，如类器官，微生理系统9，10，11（MPS）和器官芯片12，13，14 （OOC）。它们具有共同的特征，即放大细胞生态系统的"大局"视图，并扩大体外潜力以控制微环境因素，同时利用高内涵显微镜15和图像处理方法。

如今，最先进的MPS和OOC系统已经开始包括免疫学方面，在现有的组织和共培养物中结合不同亚型的免疫细胞，从而探索和测量各种过程，如炎症性疾病，伤口愈合，粘膜免疫以及对毒素或日常食品的反应16。TME芯片模型10，11，12，13，14，15，16，17也与可灌注微血管18，19，20，21集成在一起，已被开发用于研究细胞类型依赖性相互作用，物理和化学扰动以及细胞毒性活性浸润淋巴细胞22，以及临床相关的免疫调节剂23。

在这里，我们提供多功能协议，从芯片中的细胞加载到图像处理工具，以利用2D（第1节）和3D（第2节）设置16中的高级肿瘤免疫微流体共培养，与动态，多参数24 监测和细胞功能的可视化兼容。这是利用斐济免费软件及其工具箱25，26在样品管理和数据分析中保持易用性和灵活性的实现。

第1节中描述的微流体装置旨在进行贴壁癌症和浮动免疫细胞的2D共培养。该平台经过验证，可用于在存在基因突变27 和/或免疫缺陷28的情况下体外测量免疫细胞行为。在这里，我们通过利用基于Trackmate（斐济软件中实现的插件）的半自动方法，说明了在延时明场图像中跟踪免疫细胞的步骤。该程序能够提取免疫迁移 29 的运动学描述符和对靶向癌细胞的反应（即相互作用时间），无论是否用免疫原性细胞死亡诱导剂27处理。

重要的是，这些从时间序列图像中提取的参数可以用先进的数学机器进行处理。作为这种方法潜力的一个例子，我们的小组最近发表了一项基于随机过程和统计力学的数学方法的分析，以模拟细胞网络属性并提供免疫细胞行为的参数化描述（即，有偏差或不相关的随机游走，高度或不协调的运动30，31）。

第二部分中提供的3D设置基于共培养方案，以竞争方式重建嵌入两个凝胶区域中的更复杂的免疫功能TME，具有不同的细胞类型和药物组合。这里描述了图像处理步骤，以测量在不同时间点在基质胶内培养的人A375M黑色素瘤细胞中染色免疫细胞的浸润，以评估抗肿瘤剂组合32。选择A375M系，一种以高度转移表型为特征的A375P衍生细胞系来评估其在免疫细胞存在下的转移能力32。

所描述的模型可以完全符合不同的细胞源（小鼠和人类永生化或原代细胞系、类器官、异种移植物等）。在我们实验室最近的研究中，通过将高内涵视频显微镜与图像分析相结合，将竞争性 3D 布局应用于研究:i） 抗肿瘤（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）免疫反应，并剖析成纤维细胞在 HER2+ 乳腺癌片上模型中对曲妥珠单抗治疗耐药中的作用33;ii）骨髓细胞（即癌症相关巨噬细胞）在肿瘤逃避和T细胞募集机制中的作用34;iii）免疫治疗方案的功效，特别是基于干扰素α条件树突状细胞（IFN-DC），在胶原基质中用药物治疗的结肠癌细胞培养，并评估有效运动和随后的吞噬事件35;iv） 骨髓来源的嗜酸性粒细胞向 IL-33 处理或未处理的黑色素瘤细胞的趋化迁移36.

这些先进的模型可以作为观察窗口，了解免疫质地在癌症转移和耐药机制中的作用，但需要努力将研究结果转化为临床，缩小与基础研究的差距37。

作为一种新兴场景，利用自动化高内涵显微镜的强大功能与使用更具生理相关性的微系统相结合，为处理、处理和解释数百甚至数千千兆字节的多参数数据带来了新的潜在挑战，这些数据可以从单个实验活动中生成。这意味着OOC实验与基于人工智能38，39，40，41，42（AI）的算法直接联系，既可用于高级自动化分析，又可以生成特征，这些特征可以依次输入癌症免疫相互作用的计算机模型43，以及令人兴奋的新应用，例如预测药物筛选测定的开发44。

不断扩大的努力集中在疾病模型的设计以及优化策略上，以实施具有单细胞多组学读数的大规模扰动筛选。这无疑将有助于开发并有望在适当程度的方法标准化的同时，临床实施系统肿瘤免疫学芯片方法，以获得对免疫疾病和癌症传播机制的新见解。

研究方案

1. 贴壁细胞和浮动细胞 2D 共培养的芯片设计

注意:2D共培养布局（图1A-C）的特征在于三个腔室（100μm高），由两组微通道阵列（500 x 12 x 10μm3，L×W×H）互连。中间室形成两个封闭的死胡同隔室，其阻止在加载步骤2.5期间溢出到肿瘤部位的浮动免疫细胞。这种设备类型可用于单细胞（贴壁或浮动）运动和细胞间相互作用的实时二维测量16，27，28，30，31。典型的细胞迁移研究（从几小时到几天进行）将活细胞显微镜与图像处理算法45相结合，以便将获取的图像序列转换为数字特征25。基于迁移模式，可以估计几个生物物理指标，例如细胞的位移和速度，以及免疫细胞和靶细胞相互作用的持续时间24。

  1. 癌症和PBMC细胞的制备
    1. 癌细胞培养
      注意:MDA-MB-231三阴性[雌激素受体（ER）-，孕激素受体（PR）-和人表皮生长因子受体2（HER2）-]人乳腺腺癌细胞常规在罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基中生长，补充有10%（v / v）胎牛血清（FBS），2mM L-谷氨酰胺，100 IU mL−1青霉素G钠盐和100μgmL-1硫酸链霉素（生长培养基）， 在标准培养条件下（37°C和5%CO2）。
      1. 为了优化细胞培养生长，将MDA-MB-231细胞以1×106细胞mL-1的密度接种在75 cm2烧瓶中，密度为12至15 mL生长培养基。
      2. 当细胞达到75-80%的汇合时，丢弃生长培养基，用预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞以完全去除FBS，然后用预热的胰蛋白酶分离它们（在37°C下1至2分钟）。
      3. 加入生长培养基以灭活胰蛋白酶酶活性并收集分离的细胞。在室温（RT）下以1，100×g洗涤细胞两次5分钟。
      4. 通过台盼蓝染料排除测试对细胞计数载玻片中的细胞进行计数，然后重新接种它们以进行维持培养（解冻后不超过6代）或用于实验程序。
      5. 对于微流体实验，在 3 mL 生长培养基中的 6 孔板中接种 1 ×10 个 6 个细胞，并用 25 μM 多柔比星 （DOXO） 或等体积的 DOXO 溶剂 （PBS） 作为对照处理。
      6. 4至6小时后，用预热的PBS在室温下以1，100 x g 洗涤DOXO处理过的细胞两次5分钟。
      7. 如上所述计数DOXO处理和PBS处理的对照细胞（参见步骤1.1.1.5），并在微流体装置中与外周血单核细胞（PBMC）共培养。
    2. PBMC 隔离
      1. 在肝素化小瓶中收集健康志愿者的静脉全血（大约 10 mL），并通过倒置试管 2 至 4 次轻轻混合47。
      2. 用 PBS 以 1:1 的比例稀释血液，并在 50 mL 管中分层超过 10 mL 密度梯度培养基 Lymphoprep。
        注意:确保非常温和和缓慢地分层，让血液和淋巴细胞形成两个不同的层。
      3. 在4°C下以400×g离心管30分钟，无制动器。将形成四个不同的层:（i）顶部的血浆，（ii）含有PBMC的白色和混浊层，（iii）淋巴细胞和（iv）红细胞和粒细胞的沉淀。
      4. 用 2 mL 移液管轻轻吸出 PBMC，并立即重悬于温热的生长培养基中（与步骤 1.1.1 相同），并在室温下以 1，100 x g 洗涤两次 5 分钟。
      5. 如上所述计数颗粒状PBMC（见步骤1.1.1.5），并用于实验程序或冷冻以长期储存。
  2. 在2D芯片中电镀电池
    注意:本协议中未对PBMC进行染色。为了表征芯片上的特定表型，可以通过免疫磁珠选择分离免疫细胞亚群，用荧光细胞追踪器染色，与未标记的剩余部分重新混合，从而面对靶癌细胞，如 Vacchelli 等人 27 和 Racioppi 等人 34 中所述的芯片上实验中所述。
    1. 在开始共培养实验之前，为了便于添加试剂，通过氧等离子体处理激活储存的芯片几秒钟。立即用去离子水或PBS填充储液槽，以保持PDMS（聚二甲基硅氧烷）表面亲水，直到电镀步骤。
      注意:PDMS本质上是疏水性的，这可能会导致操作困难和微通道中气泡的截留。请参阅补充文件中的步骤 7，提供有关氧等离子体激活的详细信息。
    2. 在UV柜下灭菌20分钟，用新鲜PBS洗涤2-3次，然后与培养基孵育1小时。将芯片保存在培养箱中，直到执行电镀步骤。
    3. 从所有六个储液罐中取出多余的介质。注意避免从主培养室吸走培养基。
    4. 缓慢施用1×105个癌细胞重悬于左上角储液槽中的10-20μL生长培养基中，然后在下孔中（图1A，储液器1和2）。等待5分钟，让细胞粘附在肿瘤室中。一些细胞会沉淀并附着在储液器中。
      注:在通道开口旁边插入蜂窝悬浮液。该程序适用于MDA-MB-231癌细胞，其他细胞系将需要细胞密度优化。为了改善癌细胞附着，可以对表面（例如，聚-L-赖氨酸，纤连蛋白）进行涂层官能化。请参考先前发布的涂层步骤16、48、49、50的协议。
    5. 在右侧轻轻移取 1 × 106 PBMC 重悬于 50 μL 生长培养基中，放入孔 3 和 4 中（参见图 1A，储液槽 3 和 4）。
      注意:流动后，PBMC将分布到中间室中，形成一个"前部"，代表实验的起点。
    6. 用多达 100-150 μL 的生长培养基填充所有六个储液槽。在显微镜下检查细胞是否在培养室中正确分布，如图1D-E所示。最终体积可能因储层的大小而异。调整体积以在所有孔中相等。
    7. 在延时记录之前，将芯片放回培养箱中约1小时以稳定系统。每3天加入新鲜培养基，因为它可能会受到蒸发损失。
      注意:该系统与活/死细胞分析和条件培养基的动态多重细胞因子分泌分析兼容。对于趋化因子分析，通过从每个隔室的两个储液槽中收集培养基，可以获得多达 200-250 μL 等分的上清液。经典的 ELISA 和 Luminex 细胞因子分析测定需要约 50 μL 的上清液。请参阅其他实验室在OOC模型上进行细胞因子分析的51，52个研究示例。
  3. 延时获取未标记的癌症和免疫细胞
    注意:通常，3个芯片排列在单个显微镜载玻片上（2D芯片参见图1A，3D芯片参见图4B）。使用分配4张载玻片的载物台支架，共培养物适合通过自动高内涵显微镜进行监测，以分析大批量实验条件。芯片可以很容易地安装在厚度等于 1 mm 或 170 微米的载玻片上（塑料或玻璃盖玻片、6 孔光学底部多孔），以进行高分辨率共聚焦成像。
    1. 通过配备培养系统的视频显微镜设置记录未标记细胞的明场图像系列。
      注意:这里的时间序列数据集（时间窗口:48小时，帧速率:2分钟）是用荧光显微镜采集的，荧光显微镜配备了4倍物镜和CMOS 1.3M像素，经过优化以适应标准细胞培养箱。
    2. 在开始采集之前，将显微镜预热至少2小时以平衡至37°C和5%CO2。
    3. 通过将肿瘤和中央隔室之间的微通道阵列居中来选择观察窗口。这允许可视化免疫浸润的动态以及癌细胞接种区域内的相互作用。
    4. 调整癌症和免疫细胞的照明强度和焦点。
    5. 要启动延时采集，请根据实验和正在研究的细胞类型优化帧速率和持续时间。
      注意:必须优化成像条件，以避免过度的光曝光，同时保持良好的信噪比（SNR）。由于免疫细胞非常活跃，因此采集帧速率需要足够高，以跟踪感兴趣的动态过程并易于跟踪53。应该在跟踪算法、与所得数据集大小的兼容性以及观察到的细胞的活力、密度和运动性之间达成妥协。
    6. 在延时摄影结束时，使用 ImageJ 软件的导入图像序列和另存为功能将帧数据集转换为 25 fps 的未压缩视频文件。
      注意:生成的视频文件现在已准备好进行细胞跟踪分析。在这里，收集了RGB（1280x1024像素）图像，空间分辨率为1.33μm/像素。单视场 （FOV） 的 24 小时持续时间短片（3.5 GB 堆栈）由每个条件的 720 帧组成。
  4. 数据分析:Trackmate半自动提取未标记的免疫轨迹
    注意:在这里，使用TrackMate进行2D未标记延时图像中的免疫运动分析54，斐济/ImageJ软件包（https://imagej.nih.gov/ij/）中提供的开源工具箱。提供了几种算法来执行自动单粒子跟踪55（SPT）的斑点状结构。它们已被有效地应用于荧光图像，其中物体在具有高SNR的黑暗背景上是明亮的（即，亚分辨率荧光斑点，标记的交通囊泡，细胞核）1,25,56,57,58.防范酷刑小组委员会主要基于两个连续步骤。首先，对象在多个帧中具有识别的位置进行本地化（分割），如示意图所示图2.在第二阶段（粒子链接），检测到的斑点通过连续帧链接，以估计运动并以轨迹（图3).数值特征可以从每个提取的 X、Y、Z 坐标数组随时间推移计算出来。扩展文档在 中报告。54以及在线 （http://imagej.net/TrackMate），遵循 TrackMate 入门教程。可以立即检查过程的准确性，处理直观的图形用户界面（类似向导的GUI），使用户能够在每一步重新调整设置。以下部分简要描述了如何使用Trackmate进行图像处理和量化步骤，应用于可见光图像:
    1. 将全时视频/图像堆栈拖放到斐济工具栏上。
    2. 校准堆栈设置（图2A）。
      1. 检查维度并通过选择图像>属性来分配图像属性。填充长度单位、像素尺寸和帧间隔框。
        注意:要执行校准，请使用微通道的已知长度（500μm，图1C）并除以相应的测量长度（以像素为单位）。对于 2D 时间序列，请确保将输入 1 的 Z/T 字段交换为 z 切片和正确的影片帧数。如果未完成，跟踪mate定量输出和参数将以像素单位和时间帧报告。
    3. 图像的预处理。
      1. 为了增强免疫细胞与嘈杂背景的正确区分，请对明场图像进行预处理以补偿伪影。确保数据集由 8 位 TIFF 图像组成（亮度范围:0-255）。
        注意:不均匀的照明，低SNR和可见光图像中小碎片颗粒的污染可能会影响细胞跟踪过程的成功。在这里，时间序列数据集通过背景减法、亮度/对比度调整功能以及从原始图像中局部图像减去高斯模糊进行预处理。ImageJ 中还有其他不同的分析工具包可用于处理和分割相衬或明场图像，包括经验梯度阈值 （EGT）59。
    4. 第一个校准面板（图2A）
      1. 选择图像堆栈后，启动跟踪（插件>跟踪）。 修改/确认数据的维度和时间窗口（即像素宽度和帧间隔）。
        注意:TrackMate 会自动读取图像属性框，以校准的物理单位（即微米和分钟）给出最终跟踪结果。
      2. 定义感兴趣区域以计算免疫轨迹的提取，方法是手动插入值或在活动图像上绘制一个封闭区域，然后按"刷新源"按钮。为了提取全局免疫迁移路径，请分别选择微通道右侧（中央室，图1E）和左侧（肿瘤室，图1D）的矩形区域。要分析癌症和免疫热点之间的相互作用，请使用 ROI 工具绘制圆形子区域（转到编辑→选择→指定）。
        注意:首次在新的生物应用程序上运行此工具箱时，请花费必要的时间来优化重建轨道的设置。
        注意:对细胞轨迹（大约50-100个细胞）进行手动跟踪，以根据经验找到正确的配置，然后验证自动提取运动的可靠性作为基准。此外，最初在较小的区域工作，以轻松检查所选参数的准确性。
    5. 免疫斑点检测步骤（图2B）
      1. 选择默认的高斯拉普拉斯量 （LoG） 检测器。LoG探测器用于寻找明亮的，斑点状的圆形物体，并在针对中间光斑尺寸（直径5至20像素）调整的图像上应用高斯拉普拉斯滤波器。
      2. 在"估计斑点直径"（此处为 10-13 μm）中，输入一个略大于预期光斑大小的值。增加阈值（此处为 1-3 μm）值，直到在不删除对象特征的情况下减少额外的杂散背景斑点。低于阈值（基于质量指标）的检测将从后续分析中丢弃。选中中值滤波器和子像素定位框，以提高斑点检测的质量。
      3. 使用"预览"按钮可以查看并快速检查由洋红色圆圈覆盖在图像上的已识别免疫细胞。
        注意:检测过程中的错误将对链接过程产生相当大的影响。其他不需要的检测可以通过用户定义的过滤器（即，通过光斑强度、大小或位置）在后续菜单中进行校正。
    6. 对选择感到满意后，点击 下一页.
      注意:这些设置可能因实验设置和采集成像模式（例如，FOV，物镜放大倍率，明场或荧光图像），细胞类型（贴壁或浮动细胞），慢速或快速运动，细胞行为类型（相互作用或不相互作用）和观察区域的低/中/高密度而异。
    7. 继续并跳过初始阈值菜单。选择"超级堆栈处理器"窗口。
    8. 在聚光灯面板上设置滤镜（图2C）。
      1. 选择:统一颜色。如图2C所示，可以添加过滤器以保留带有特征值的标记点，以直方图显示，高于或低于可逆阈值。
    9. 跟踪器选择阶段（图3A）。选择简单 LAP 跟踪器，作为要求填充三个字段的粒子链接算法（在本例中，"链接最大距离":30-50 μm，"间隙闭合最大距离":25-50 μm，"间隙关闭最大帧间隙":4-6）。该检测器管理间隙关闭事件，仅根据它们各自的距离计算成本链接。
      注意:允许的最大链接距离限制了候选匹配点的空间搜索范围，对应于两个后续帧之间行进的最大允许位移（图 3D）。
      1. 当注意到高运动粒子的轨迹碎裂时，提供更大的最大位移值。
        注意: 如果帧到帧的移动大于给定的最大距离值，则不会连接两个链路。如果线段桥接两个不同的像元严重，请减小最大位移的值。
      2. 尝试重新连接缺失的点，改变"间隙闭合的最大距离"和"最大帧间隙"的值。
        注意: 这些参数处理非相邻帧中的间隙闭合事件。某些帧可能会出现斑点消失（即，失焦颗粒、细胞遗漏和在 FOV 中、噪声图像中的分割失败）。
        注意:要处理拆分或合并事件，请选择 LAP 链接器作为检测器，这会引入链接成本矩阵惩罚。
    10. 单击下一步运行跟踪计算。按下一步。
    11. 过滤轨迹面板（图 3B）。从下拉菜单中选择"跟踪 ID"或其他跟踪功能，更改免疫路径的颜色。此时，可以选择将交互式筛选器设置为功能，以提高结果的质量并重新访问该过程。
      注意:杂散点是由图像中的噪声和特征质量损失引起的。这将生成短片段，而感兴趣的单元格可以在许多帧上跟踪。
      1. 要删除短路径，请尝试根据它们包含的点数进行过滤。此外，使用轨迹位移、轨迹持续时间或最小/平均/最大速度等选项组合对轨迹进行排序，以从进一步的后期处理中排除错误或不需要的轨迹（相对于延时总持续时间而言帧较少或涉及脏或不移动的粒子）。
        注意:过滤器的选择可能因具体应用和生物系统而异。
    12. 检查"显示选项"界面中的所有轨迹，滚动浏览时间，并验证轨迹与单元迁移路径匹配的准确程度。下拉菜单提供斑点和路径的颜色代码，以便通过多种模式（例如动力学参数、强度、时间或空间位置）轻松可视化和过滤。
      注意:为了跟踪高密度培养物或高运动细胞，请提高采集帧速率，最大限度地减少连续时间间隔内行进的细胞位移。
    13. 手动更正分割和链接错误（图3E）。
      1. 为了进一步提高结果质量，在分析肿瘤-免疫相互作用ROI时，手动编辑斑点（碎片颗粒，静止细胞）并删除从检测到的肿瘤边界得出的错误轨迹。
      2. 首先，在 ImageJ 工具栏中选择 TrackMate 工具。要消除整个堆栈中的现有斑点，请按 shift 键并通过鼠标光标在目标点上创建一个 ROI 蒙版（在绿色圆圈中编辑），然后按 DEL 键。
      3. 要添加新光斑（如果由于斑点消失而丢失曲目），请按 A 键，将鼠标放在指向的位置。在此步骤之后重复轨道链接计算过程。
    14. 满意后，在"显示选项"面板中选择"分析"以生成三个文本文件（图 3C 和 3F）。"轨迹统计中的斑点"中的表格提供了免疫斑点的时空坐标（用相关帧和轨迹编号标记的细胞的 X-Y-Z 位置）。"轨迹统计中的链接"和"轨迹统计"包含与轨迹相关的信息:轨迹持续时间、检测到的间隙或点数、轨迹初始帧和停止帧等。保存并导出每个数据集。
      注意:单击结果窗口中的行时，将在延时视频中激活相应的点、链接或轨迹以进行目视检查。重复过滤步骤以选择/删除曲目。所有将来导出的数据都将更新。提示:在处理相互作用的ROI时，可以利用跟踪初始帧和停止帧以及跟踪持续时间值来计算癌症和免疫细胞之间的接触时间。
    15. 按"保存"按钮生成一个生成的 XML 文件，其中包含所有参数值、图像路径和及时点位置。"加载 TrackMate 文件"命令（插件>跟踪）分别恢复每个电影文件的整个过程会话。
    16. 移动到 GUI 的最后一个面板，称为"选择操作"。在列表中，使用 捕获叠加 > 执行 功能生成叠加了轨道的视频。提示:"绘制N点与时间的关系图"选项可用于计算ROI中免疫细胞的空间密度（图6B，右图）。
    17. 后处理分析和迁移统计
      1. 直接在 Trackmate 中分析原始位置数据或导出数据以计算综合动力学参数29（即总轨迹长度、欧氏距离、约束比、均方位移56、平均或瞬时轨迹速度、停滞系数、迁移角度分布、前向迁移指数、平均直线速度）以对免疫细胞迁移行为（例如，定向或扩散运动30、31）和对靶癌细胞的反应（例如，治疗与对照）。
        注意:其他有用的插件，如趋化性和迁移工具（http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/）提供了各种图形（例如，玫瑰图或扇形图，如图6所示）和统计测试，用于实验迁移和趋化性数据的高级分析和可视化。结合细胞跟踪和细胞分割算法24、25、45可以能够在单细胞水平（即细胞表面积、长轴和短轴长度以及细胞纵横比）上测量形态学指标。

2. 竞争性检测中的 3D 免疫功能癌症片上模型

注意:图4所示 的3D芯片设计由5个主要隔室组成:一个用于浮动免疫细胞摄入的中央隔室，两个用于将肿瘤细胞嵌入水凝胶基质（150-250μm高）中的侧区和培养基灌注室。免疫室和肿瘤室通过两组窄阵列微通道（200×12×10μm3，L×W×H，图4E）连接。规则的100μm间隔梯形等腰微柱（每个侧面凝胶区域约25-30个界面，图4C）在注射过程中作为限制凝胶溶液的屏障，利用表面张力和毛细管力60，61之间的平衡，并将肿瘤区域连接到两个横向附加介质室以设置凝胶 - 液体界面（图5）。3D竞争性检测的详细特征如图4所示。可以监测和量化免疫细胞向承载经过不同治疗的肿瘤细胞的两个水凝胶区室的优先迁移。特定的竞争布局可用于研究大量不同的癌症生物学表型（例如，耐药性与侵袭性，原发性或转移性，应答者与无应答者）。此外，凝胶包埋区域可以很容易地与不同的细胞群整合，以重建更多的异质性TME，包括基质成分（成纤维细胞，内皮细胞）23或模拟特定的免疫抑制环境34（例如巨噬细胞）以解剖耐药性和肿瘤逃避的机制。
注意:通过使用商业试剂盒进行活/死测定（例如，赛默飞世尔科技，Incucyte试剂），可以实施核和活性半胱天冬酶染色，以评估有丝分裂或凋亡死亡事件，如Nguyen等人33报道。

  1. 用细胞制备基质溶液并在设备中加载
    注意:在以下实验设置中，两个凝胶区域包含人A375M黑色素瘤细胞系的混合物，在基质溶液（例如基质胶）中生长，暴露于用作单一疗法或组合的治疗剂。这种设置使我们能够以竞争的方式评估两种药物组合相对于单一药物的疗效，并量化它们吸引PBMC的能力。
    1. 在实验前一天将基质溶液（例如基质胶）放在冰上放入4°C冰箱中解冻基质溶液（例如基质胶）。
      注意:请勿将产品暴露在多次冻融循环中，因为它会变得"结块"。其他合成或天然水凝胶方案可能适合在这种情况下使用。请参考33，34，35在胶原基质中制备癌细胞。
    2. 重悬 A375 人黑色素瘤细胞，在基质溶液 （2 mg mL-1） 中用活相容的 PKH67 绿色荧光细胞接头染色。在指示的情况下，以适当的剂量加入5-氮杂-2'-脱氧胞苷（DAC; 2.5μM），称为DAC和/或IFN-α2b，称为IFN，32。
      注意:与矩阵瓶规格表上的批次#相匹配。根据浓度计算补足2 mg mL-1所需的培养基体积 请根据您感兴趣的应用调整最佳蛋白质浓度和癌细胞悬液浓度。
    3. 小心上下移液，以避免产生气泡。混合时将微量离心管放在冰上，以防止任何不必要的聚合。
    4. 灭菌后，将设备放在冰上（使用冰桶和盖子），以避免在整个细胞加载过程中基质溶液固化。
    5. 使用冷吸头分别用 10 μL 微量移液器将两种 IFN 和 DAC/IFN 基质胶/肿瘤细胞混合物 （2-4 μL） 缓慢注入左右凝胶端口（图 5A）。轻轻按压，从一侧推动基质溶液，直到到达另一侧。
      注意:选择基质溶液的体积以避免溢出到相邻通道中。不要施加过大的移液压力，以防止溶液泄漏到培养基和中心通道中。如果在上样过程中凝胶路径沿通道堵塞，请尝试从另一个入口插入溶液，直到凝胶前沿相遇。从入口取出微量移液器时，请按住柱塞，否则负压会吸入基质溶液。
    6. 将设备置于培养箱中，直立位置，在37°C和5%CO2下放置30分钟，以使基质溶液凝胶化（图5B）。小心处理带有嵌入未聚合凝胶的芯片，以防止从凝胶通道泄漏。
    7. 同时，将 PKH67 标记的 PBMC（1x106 细胞）重悬于 10 μL 完全 DMEM（Dulbecco 改良的 Eagle 培养基）中。
    8. 基质凝胶后，在所有六个储液槽中用（50-100 μL）相同等分的培养基填充培养基通道，以防止凝胶在芯片中干燥。保持在培养箱中直到免疫细胞悬液接种。
      注意:在显微镜下检查凝胶中肿瘤细胞的正确和均匀分布以及聚合凝胶屏障的完整性。由于压力初始波动，混合物中的部分或不均匀的凝胶区域或气泡导致PBMC在实验开始时在凝胶培养基通道中过早流动。
    9. 从六个孔中吸出培养基，并将尖端放置在培养基通道的入口附近，以中等压力的PBMC细胞悬液轻轻注射。加载时间序列如图 5C 所示:
      1. PBMC在10 μL培养基中放入上中心孔中。
      2. 将 50-100 μL 培养基分别倒入横向通道的四个孔中。
      3. 40-90 μL培养基进入上中心孔。
      4. 50-100 μL 培养基进入下中心孔。
    10. 确保在显微镜下，PBMC分布在加载步骤后仍被限制在中央腔室中。（图7A）。
      注意:如果不是最佳，请根据需要调整浓度并使用原始芯片重复播种步骤。在计算计划实验条件的体积时，请参阅过量的芯片数量（15-20%），以考虑潜在的误差和调整。体积和浓度应根据具体应用进行优化。
    11. 将组装好的设备放置在培养箱中37°C和5%CO2的水平表面上，以进行随后的荧光成像采集。加载漂浮的免疫细胞后小心处理芯片。
      注意:通过每 2-3 天更换一次介质来补偿储液罐中体积的蒸发损失。对于趋化因子分析，可以从培养室的两个孔中抽吸多达100 μL，请参阅步骤1中的步骤2.7。
  2. 自动计数 ImageJ 中单通道荧光图像中募集的 PBMC
    注意:用于共聚焦高分辨率成像的经典免疫荧光方法可作为端点测量应用于片上操作。基本的染色程序包括细胞芯片上固定、透化、封闭、抗体结合、细胞核染色以及中间的洗涤步骤。浸润在嵌入癌症微环境的3D凝胶区域中的未标记免疫细胞可以在所需的时间点固定并染色以用于激活/耗尽/成熟的表达标志物（例如，对于CD8细胞，监测CD69，CD95，PD1，TIM3标志物）。在帕拉托等人中。35，使用安装在170μm厚的盖玻片上的装置，通过共聚焦显微镜评估SW620凋亡细胞的吞噬作用。添加片上抗人类HLA-DR-FITC Ab等分试样对IFN-DC进行染色。
    为了计算受到竞争信号挑战的浸润荧光染色活免疫细胞的程度，将通用图像分析工作流程设置如下（图 7D-G):
    1. 在特定时间终点，获取含有肿瘤细胞的左凝胶区域的相衬和红/绿通道荧光显微照片，分别暴露于单一或组合的药理学方案。
      注意:在细胞上样（0小时），48小时和孵育72小时后，EVOS-FL荧光显微镜捕获图像（图7A-B）。使用4x-10x放大倍率来获取中央室，微通道阵列以及包含A375加IFN和A375加DAC / IFN的两个并列侧通道。
      1. 执行采集操作时，请考虑要测量的参数，并避免要计数的特征饱和。最佳分割结果取决于所采集图像的性质，这是由于生物样品本身的可变性、染色质量以及用于用户导向应用的显微镜技术。
    2. 通过在斐济将荧光单通道数据（在本例中为红色= PBMC）拖入主窗口来加载荧光单通道数据（图7D）。复制图像以避免在选择预处理过滤器期间覆盖原始数据，直到最终分割。
      1. 如果图像是彩色图像 （RGB），请点击 图像 > 类型 8 或 16 位转换为灰度。检查转换时是否将 编辑>选项>转换为缩放。
    3. 通过清理噪声和伪影来预处理原始数据。
      1. 转到"处理>减去背景"菜单，方法是应用滚球算法来校正强度空间变化较大的不均匀噪声背景。将半径至少设置为最大前景粒子的大小。选择"预览"框进行试错过程以产生最佳结果。太小的值可能会错误地删除感兴趣的结构。
      2. 在"亮度和对比度"命令中，拖移"最小/最大"滑块以更改直方图中的强度范围。将"最大值"滑块向左移动以增加亮度，而不显示冲刷功能。将"最小值"幻灯片向右移动以增加图像的对比度，避免背景中不太明显的特征消失。单击应用以修复更改。
    4. 图像增强。
      1. 转到处理>过滤器并在图像上试验中值、高斯滤波器（图 7E）。
        注意:预滤波半径应适应图像噪声像素。非线性中值滤波器将像素值替换为邻居的中值，以减少盐和胡椒噪声。"高斯模糊"用于平滑数字图像，方法是将像素替换为周围像素的加权平均值。权重来自高斯概率分布，因此最接近的像素更具影响力。
      2. 可以选择使用勾选的预览框转到处理数学>伽玛>以增加对比度。
        注意:B&C面板中设置的强度在两个最小和最大限制之间缩放。值< 1.0 突出了低强度之间的差异，而> 1.0 的值则突出了高强度之间的差异。伽玛校正的功能是找到显示范围，显示最暗的物体，而不会使最亮的物体饱和。
    5. 创建二进制映像掩码。
      1. 转到图像>调整>阈值。确定阈值的最简单方法依赖于强度水平的直方图分析，如图7F所示。在下拉菜单中，使用不同的全局阈值方法（在我们的例子中，应用了 Otsu）。
      2. 在直方图面板中手动滚动或键入已知范围的像素强度，观察覆盖图像的红色图案的变化，该图案主要类似于实际单元格区域。重置按钮可删除叠加层。满意后，单击"应用"以生成映像的二进制版本。选中处理>二进制>选项以控制阈值图像的显示方式以及粒子分析器识别对象的方式。
    6. 使用菜单命令处理/二进制/流域粒子在阈值期间划分部分重叠或合并。分水岭通常可以通过添加一条 1 像素粗的线来准确地将它们分开。执行形态学操作，例如扩张或侵蚀操作，以从饱和度不足或过度饱和的像素中增加或删除像素。
      注意:有关更多信息，请参阅菜单命令部分或参考 MorphoLibJ，这是一个基于数学形态处理二进制数据的集成库。
    7. 定量图像特征说明。
      1. 获得令人满意的物体识别后，从分析>分析粒子中打开粒子分析器。颗粒可以通过其大小和圆度排除，以像素或校准的测量单位表示（在图像>属性下检查相对于显微镜设置的正确比例）。要包含所有内容，请将默认值 0 无穷大和圆度默认范围保持在 0.00 - 1.00（0 = 直线，1 = 完美圆）。
      2. 要过滤小的"噪点"像素或不感兴趣的特征，请设置最小和最大范围。勾选窗口字段中的包括孔、显示、轮廓和显示结果选项。"边缘上排除"将丢弃在图像边框上检测到的粒子。添加到管理器将获得的选择添加到 ROI管理器中，以便进一步分析，保留颗粒的位置信息。
        注意:在"ROI管理器"中，可以更正自动分割记录的输出（合并拆分单元格，拆分合并单元格）。使用斐济工具栏中的选择工具，在嵌入癌细胞的两个凝胶区域内选择ROI，以估计免疫浸润。
    8. 将获得的值导出到电子表格进行统计分析，如图7G所示。"结果"列出了相对于所识别的编号轮廓颗粒属性的数据表。"汇总"将打开一个窗口，其中包含图像的名称、总数和整个图像的其他信息。
      1. 转到分析>设置测量以包含各种参数。
    9. 可以选择地记录宏（通过选择">记录">"宏"），以自动执行处理工作流并节省对大型数据集的分析时间。
      1. 使用相同的处理程序分析相同区域的绿色荧光通道，以分析3D区域中肿瘤细胞的形态变化16

结果

肿瘤免疫浸润是宿主抗肿瘤反应的一个参数。肿瘤在浸润白细胞的组成、密度、位置和功能状态方面存在异质性，与癌细胞的相互作用可以成为预测病程和治疗反应的临床相关信息的基础。从这个意义上说，微流体技术可以用作补充和特权体外工具，以探索肿瘤的免疫质地，以及监测对抗癌疗法的反应。微流控测定、活细胞成像和跟踪软件的耦合可以建立可靠的定量方法，以量化免疫细胞在不同?...

讨论

所描述的方法试图设计一种通用方法，以可调节的复杂程度概括肿瘤免疫学领域的两个重要方面，这可以从采用更相关的体外模型中受益。第一个涉及肿瘤细胞群方面，其中处理单细胞特征可能会导致更好地描述异质性以及相关的生物学和临床意义，包括对治疗的抵抗力，对转移的治疗，干细胞和分化等级。故事的另一面是TME，包括非癌性成分（免疫和基质细胞，血管）和化学/物理景观（ECM成分...

披露声明

作者没有什么可透露的。AS得到了意大利Cancro Ricerca sul Cancro基金会（AIRC，Start-Up 2016 #18418）和意大利礼炮部长（RF_GR-2013-02357273）的支持。GS和FM由意大利癌症研究协会（AIRC）第21366号支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture materials 
50 mL tubesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-hypomethylating agent
6-well platesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506culture dishes
75 cm2 cell culture treated flaskCorning, New York, NY430641Uculture flasks
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochlorideMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0728LCulture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o MagnesiumEuroClone Spa, Milan, ItalyECB4004Lsaline buffer solution
Fetal Bovine SerumEuroClone Spa, Milan, ItalyECS0180Lancillary for cell culture
FicollGE-Heathcare17-1440-02separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometerNeubauerCell counter
Heparinized vialsThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAVials for venous blood collection
interferon alpha-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595recombinant human cytokine
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milan, ItalyECB3000Dancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation mediaCedarlane Labs, Burlington, CanadaSeparation of lymphocytes by density gradient centrifugation
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
MatrigelCorning, New York, NY354230growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA HTB-26human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X  EuroClone Spa, Milan, ItalyECB3001Dancillary for cell culture
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLred fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgreen fluorescent cell dye
RPMI-1640EuroClone Spa, Milan, ItalyECM2001LCulture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solutionThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061cell stain to assess cell viability
TrypsinEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0920Ddissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscopeThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Steril VBH 72 MPLaminar flow hood
Optical microscopeZeiss
Refrigerable centrifugeBeckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)Sigma AldrichA3648silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ MB W&A,  Germanyoptical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)Ibidi, Germany10812
Hydrogen Peroxide solution 30%Carlo Erba Reagents412081reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketoneCarlo Erba Reagents461945PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm Sail Brand7101substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mmTedpelladermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDaAllresist,GermanyAR-P. 679.04Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslipsIbidi, Germany10813substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron DopedGambetti Xenologia Srl, Italy30255
Propan-2-olCarlo Erba Reagents415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 resists developer
SU-8 3005Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0001Negative Photoresists
SU-8 3050Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0005Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%Carlo Erba Reagents410381reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDowsil, Dow Corning11-3184-01Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLsilanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litographyRaith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography systemEV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

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