İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Özet

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

Özet

Karmaşık hastalık modelleri, fizyolojik ve patolojik olarak alakalı, eyleme geçirilebilir içgörüler sunabilen ve aksi takdirde görünmez süreçleri ortaya çıkarabilen son teknoloji araçlar gerektirir. İn vivo manzarayı yakından taklit eden gelişmiş hücre tahlilleri, kanserin ilerlemesini etkileyen çift yönlü tümör-konakçı etkileşimini görselleştirmek ve ölçmek için yeni yollar olarak kendilerini ortaya koymaktadır. Burada, doğal ve terapiye bağlı immünosürveyans altında, tümör mikroçevresinin (TME) karmaşıklığını taklit ederek, mikrocihazlarda yüksek oranda kontrol edilebilir 2D ve 3D ko-kültürleri yeniden oluşturmak için iki çok yönlü protokolü açıklıyoruz. Bölüm 1'de, yapışkan tümör hücreleri ile yüzen bağışıklık popülasyonları arasındaki çapraz etkileşimi, parlak alan hızlandırılmış mikroskopi ile izlemek için deneysel bir ortam sağlanmıştır. Uygulamalı bir senaryo olarak, immünojenik kanser hücresi ölüm indükleyicileri olarak adlandırılan anti-kanser tedavilerinin bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve aktivasyonu üzerindeki etkilerini analiz ediyoruz. Bölüm 2'de, 3D tümör immün mikro ortamlar rekabetçi bir düzende monte edilmiştir. Diferansiyel immün infiltrasyon, kombinasyon terapötik stratejilerini değerlendirmek için 72 saate kadar floresan anlık görüntüleri ile izlenir. Her iki ortamda da, görüntü işleme adımları, çok sayıda bağışıklık hücresi parametresini (örneğin, bağışıklık hücresi göçü ve etkileşimi, terapötik ajanlara yanıt) çıkarmak için gösterilmiştir. Bu basit ve güçlü yöntemler, kanser, stromal ve immün hücre alt tiplerinin heterojenliğini ve plastisitesini kapsayan TME'nin karmaşıklığını ve ayrıca kanser evriminin itici güçleri olarak karşılıklı etkileşimlerini simüle etmek için daha da uyarlanabilir. Hızla gelişen bu teknolojilerin canlı hücreli yüksek içerikli görüntüleme ile uyumluluğu, büyük bilgilendirici veri kümelerinin oluşturulmasına yol açarak yeni zorluklar ortaya çıkarabilir. Gerçekten de, "ortak kültürler / mikroskopi / gelişmiş veri analizi" üçgeni, özel olarak hazırlanmış terapötik protokollere yardımcı olabilecek kesin bir problem parametrizasyonuna giden yolu belirler. Yüksek verimli işleme için kansere karşı bağışıklık kazanmış çip üzerindeki yapay zeka ile gelecekteki entegrasyonunun, hassas ve kişiselleştirilmiş onkoloji için öngörücü ve klinik öncesi araçlar olarak yeteneklerden yararlanmada ileriye doğru büyük bir adım atmasını bekliyoruz.

Giriş

Farklı tıp dallarının deneysel disiplinler olarak evrimi, kontrollü koşullar altında hücre popülasyonunu ve organ fonksiyonlarını manipüle etme yeteneğine bağlı olmuştur¹. Bu yeteneğin kökleri, vücudumuzda meydana gelen süreçleri özetleyebilen ölçülebilir modellerin mevcudiyetinde yatmaktadır.

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme 2 çağında, kanser biyolojisinin, tümör-immün arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için ortaya çıkan in vitro ve hesaplamalı modellerden yararlanması gerekir ^2,3.

Protokol

1. Yapışkan ve yüzen hücreler için çip tasarımı 2D ortak kültürler

NOT: 2B ortak kültür düzeni (Şekil 1A-C), iki mikrokanal dizisi seti (500 x 12 x 10 μm³, L×G×H) ile birbirine bağlanmış üç odacıkla (100 μm yüksekliğinde) karakterize edilir. Ara oda, yükleme adımı 2.5 sırasında tümör bölgesine taşan yüzen bağışıklık hücrelerini bloke eden iki kapalı çıkmaz bölme oluşturur. Bu cihaz tipi, tek hücreli (yapışkan veya yüzen) hareketliliğin ve hücre-hücre etkileşimlerinin 16,27,28,30,31 gerçek zamanlı çift boyutlu ölçümleri için k....

Sonuçlar

Tümör immün infiltrasyonu, konakçı anti-tümör yanıtının bir parametresidir. Tümörler, infiltrasyon yapan lökositlerin bileşimi, yoğunluğu, lokalizasyonu ve fonksiyonel durumu bakımından heterojendir ve kanser hücreleri ile etkileşimler, hastalığın seyrini ve tedaviye yanıtı tahmin etmek için klinik olarak ilgili bilgilerin altında yatabilir. Bu anlamda, mikroakışkan teknolojiler, tümörlerin bağışıklık konstrüksiyonunu keşfetmek ve antikanser tedavilerine yanıtı izlemek için tamaml.......

Tartışmalar

Açıklanan yöntemler, onko-immünoloji alanında, daha ilgili in vitro modellerin benimsenmesinden yararlanabilecek iki önemli yönü, modüle edilebilir karmaşıklık derecesiyle özetlemek için genel bir yaklaşım tasarlamaya çalışmaktadır. Birincisi, tek hücre özelliklerinin ele alınmasının, heterojenliğin daha iyi tanımlanmasına ve tedaviye direnç, metastaza propulsiyon, kök hücre ve farklılaşma derecesi dahil olmak üzere ilişkili biyolojik ve klinik öneme yol açabileceği tümör hücresi .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator