Микрофлюидные модели совместной культуры для анализа иммунного ответа в микроокружениях опухолей in vitro

Резюме

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования биология рака требует новых in vitro и вычислительных инструментов для исследования опухолево-иммунного интерфейса в надлежащем пространственно-временном контексте. Мы описываем протоколы для использования опухолево-иммунных микрофлюидных кокультур в 2D и 3D условиях, совместимых с динамическим многопараметрическим мониторингом клеточных функций.

Аннотация

Сложные модели заболеваний требуют передовых инструментов, способных предоставить физиологически и патологически значимые, действенные идеи и раскрыть невидимые в противном случае процессы. Продвинутые клеточные анализы, близко имитирующие декорации in vivo, зарекомендовали себя как новые способы визуализации и измерения двунаправленного взаимодействия опухоли и хозяина, влияющего на прогрессирование рака. Здесь мы описываем два универсальных протокола для воссоздания высококонтролируемых 2D и 3D кокультур в микроустройствах, имитирующих сложность микроокружения опухоли (TME), при естественном и индуцированном терапией иммунонаблюдении. В разделе 1 представлена экспериментальная установка для мониторинга перекрестных помех между адгезивными опухолевыми клетками и плавающими иммунными популяциями с помощью покадровой микроскопии светлого поля. В качестве практического сценария мы анализируем влияние противораковых препаратов, таких как так называемые иммуногенные индукторы гибели раковых клеток, на рекрутирование и активацию иммунных клеток. В разделе 2 3D-иммунные к опухоли микросреды собраны в конкурентной компоновке. Дифференциальная иммунная инфильтрация контролируется с помощью флуоресцентных снимков продолжительностью до 72 часов для оценки комбинированных терапевтических стратегий. В обоих случаях проиллюстрированы этапы обработки изображений для извлечения множества параметров иммунных клеток (например, миграция и взаимодействие иммунных клеток, реакция на терапевтические агенты). Эти простые и мощные методы могут быть дополнительно адаптированы для моделирования сложности TME, охватывающей гетерогенность и пластичность подтипов раковых, стромальных и иммунных клеток, а также их взаимные взаимодействия как движущие силы эволюции рака. Соответствие этих быстро развивающихся технологий изображениям с высоким содержанием живых клеток может привести к созданию больших информативных наборов данных, что порождает новые проблемы. Действительно, треугольник «кокультуры/микроскопия/расширенный анализ данных» прокладывает путь к точной параметризации проблемы, которая может помочь в разработке индивидуальных терапевтических протоколов. Мы ожидаем, что будущая интеграция противораковых технологий на чипе с искусственным интеллектом для высокопроизводительной обработки станет большим шагом вперед в использовании возможностей в качестве прогностических и доклинических инструментов для точной и персонализированной онкологии.

Введение

Эволюция различных отраслей медицины как экспериментальных дисциплин зависела от способности манипулировать клеточной популяцией и функциями органов в контролируемых условиях¹. Такая способность уходит своими корнями в наличие измеримых моделей, способных повторять процессы, происходящие в нашем организме.

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования 2 биология рака должна использовать преимущества новых in vitro и вычислительных моделей для исследования интерфейса опухоль-иммунитет в надлежащем пространственно-временном контексте ^2,3.

протокол

1. Дизайн чипа для адгезивных и плавающих клеток 2D-кокультур

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема 2D-культуры (рис. 1A-C) характеризуется тремя камерами (высотой 100 мкм), соединенными между собой двумя наборами микроканальных массивов (500 x 12 x 10^{мкм 3}, Д×Ш×В). Промежуточная камера образует два закрытых тупиковых компартмента, которые блокируют плавающие иммунные клетки, переполняющие место опухоли на этапе загрузки 2.5. Этот тип устройства полезен для двумерных измерений подвижности отдельных клеток (как адгезивных, так и плавающих) в режи....

Результаты

Иммунная инфильтрация опухоли является параметром противоопухолевого ответа хозяина. Опухоли неоднородны по составу, плотности, расположению и функциональному состоянию инфильтрирующих лейкоцитов, взаимодействие которых с раковыми клетками может лежать в основе клинически значим?.......

Обсуждение

Описанные методы пытаются разработать общий подход к повторению, с модулируемой степенью сложности, двух важных аспектов в области онкоиммунологии, которые могут выиграть от принятия более актуальных моделей in vitro. Первый включает в себя сторону популяции опухолевых клеток, где устра?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator