JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования биология рака требует новых in vitro и вычислительных инструментов для исследования опухолево-иммунного интерфейса в надлежащем пространственно-временном контексте. Мы описываем протоколы для использования опухолево-иммунных микрофлюидных кокультур в 2D и 3D условиях, совместимых с динамическим многопараметрическим мониторингом клеточных функций.

Аннотация

Сложные модели заболеваний требуют передовых инструментов, способных предоставить физиологически и патологически значимые, действенные идеи и раскрыть невидимые в противном случае процессы. Продвинутые клеточные анализы, близко имитирующие декорации in vivo, зарекомендовали себя как новые способы визуализации и измерения двунаправленного взаимодействия опухоли и хозяина, влияющего на прогрессирование рака. Здесь мы описываем два универсальных протокола для воссоздания высококонтролируемых 2D и 3D кокультур в микроустройствах, имитирующих сложность микроокружения опухоли (TME), при естественном и индуцированном терапией иммунонаблюдении. В разделе 1 представлена экспериментальная установка для мониторинга перекрестных помех между адгезивными опухолевыми клетками и плавающими иммунными популяциями с помощью покадровой микроскопии светлого поля. В качестве практического сценария мы анализируем влияние противораковых препаратов, таких как так называемые иммуногенные индукторы гибели раковых клеток, на рекрутирование и активацию иммунных клеток. В разделе 2 3D-иммунные к опухоли микросреды собраны в конкурентной компоновке. Дифференциальная иммунная инфильтрация контролируется с помощью флуоресцентных снимков продолжительностью до 72 часов для оценки комбинированных терапевтических стратегий. В обоих случаях проиллюстрированы этапы обработки изображений для извлечения множества параметров иммунных клеток (например, миграция и взаимодействие иммунных клеток, реакция на терапевтические агенты). Эти простые и мощные методы могут быть дополнительно адаптированы для моделирования сложности TME, охватывающей гетерогенность и пластичность подтипов раковых, стромальных и иммунных клеток, а также их взаимные взаимодействия как движущие силы эволюции рака. Соответствие этих быстро развивающихся технологий изображениям с высоким содержанием живых клеток может привести к созданию больших информативных наборов данных, что порождает новые проблемы. Действительно, треугольник «кокультуры/микроскопия/расширенный анализ данных» прокладывает путь к точной параметризации проблемы, которая может помочь в разработке индивидуальных терапевтических протоколов. Мы ожидаем, что будущая интеграция противораковых технологий на чипе с искусственным интеллектом для высокопроизводительной обработки станет большим шагом вперед в использовании возможностей в качестве прогностических и доклинических инструментов для точной и персонализированной онкологии.

Введение

Эволюция различных отраслей медицины как экспериментальных дисциплин зависела от способности манипулировать клеточной популяцией и функциями органов в контролируемых условиях1. Такая способность уходит своими корнями в наличие измеримых моделей, способных повторять процессы, происходящие в нашем организме.

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования 2 биология рака должна использовать преимущества новых in vitro и вычислительных моделей для исследования интерфейса опухоль-иммунитет в надлежащем пространственно-временном контексте 2,3.

Микроокружениеопухоли 4 (TME) представляет собой сложную ткань, в которой раковые клетки непрерывно взаимодействуют и динамически развиваются вместе с другими клеточными (иммунные, стромальные и эндотелиальные клетки) и неклеточными (внеклеточный матрикс, ECM) компонентами. Динамическая природа этого сложного ландшафта определяет, играют ли иммунные клетки роль друзей или врагов злокачественных клеток, тем самым сильно влияя как на прогрессирование заболевания, так и на реакцию на терапию. В настоящее время онкоиммунологи, биоинформатики и эксперты в области системной биологии прилагают большие усилия для изучения клинической значимости гетерогенности рака 5,6 либо в пространстве (т.е. в отдельных опухолевых областях), либо во времени (т.е. на разных стадиях прогрессирования опухоли)5,6, а также для характеристики фенотипа и функции рака и иммунных клеток на уровне отдельных клеток. В качестве примера этой синергии в настоящее время регулярно используются передовые методы компьютерного зрения для пространственного картирования иммунного инфильтрата в гистологических образцах 7,8.

Что касается экспериментальных моделей, то исследования на животных и традиционные методы in vitro, достижения в области микрофлюидики и методов совместного культивирования дают доступ к различным классам микроинженерных клеточных моделей, таких как органоиды, микрофизиологические системы 9,10,11 (MPS) и органы на чипе12,13,14 (ООК). У них есть общая черта, заключающаяся в том, чтобы увеличивать «общую картину» клеточных экосистем и расширять потенциал in vitro для контроля факторов микросреды, используя при этом микроскопию с высоким содержанием15 и подходы к обработке изображений.

В настоящее время современные системы МПС и ООК начали включать иммунологические аспекты, включая различные подтипы иммунных клеток в существующие ткани и кокультуры, чтобы исследовать и измерять различные процессы, такие как воспалительные заболевания, заживление ран, иммунитет слизистой оболочки и реакция на токсины или повседневные пищевые продукты16. Модели TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, также интегрированные с перфузируемыми микрососудами 18,19,20,21, были разработаны для исследования клеточно-тип-зависимых взаимодействий, физических и химических возмущений и цитотоксической активности инфильтрирующие лимфоциты22, а также клинически значимые иммуномодулирующие средства23.

Здесь мы предлагаем универсальные протоколы, начиная от загрузочных клеток в чипах и заканчивая инструментами обработки изображений, для использования передовых иммуноферментных микрофлюидных кокультур в 2D (раздел 1) и 3D (раздел 2)16, совместимых с динамическим, многопараметрическим24 мониторингом и визуализацией клеточных функций. Это достигается за счет сохранения простоты использования и гибкости как в управлении выборками, так и в анализе данных, используя преимущества бесплатного программного обеспечения Фиджи и его наборов инструментов25,26.

Микрофлюидное устройство, описанное в разделе 1, предназначено для проведения 2D-кокультур адгезивных раковых и плавающих иммунных клеток. Эта платформа была валидирована для измерения in vitro поведения иммунных клеток при наличии генетических мутаций27 и/или иммунодефицитов28. Здесь мы проиллюстрируем шаги по отслеживанию иммунных клеток в покадровых изображениях яркого поля, используя полуавтоматический метод, основанный на Trackmate (плагин, реализованный в программном обеспечении Фиджи). Эта процедура позволяет извлекать кинематические дескрипторы иммунной миграции 29 и ответа (т.е. времени взаимодействия) на раковые клетки-мишени, обработанные или не обработанные иммуногенными индукторами27 гибели клеток.

Важно отметить, что эти параметры, извлеченные из изображений временных рядов, могут быть обработаны с помощью передового математического оборудования. В качестве примера потенциальности этого подхода наши группы недавно опубликовали анализ, основанный на математических методах стохастических процессов и статистической механики, для моделирования свойств клеточной сети и предоставления параметризованного описания поведения иммунных клеток (т.е. смещенного или некоррелированного случайного блуждания, высоко или нескоординированного движения30,31).

Настройка 3D, представленная во втором разделе, основана на протоколе совместного культивирования для воссоздания более сложных иммунокомпетентных TME, встроенных в две области геля с различными комбинациями типов клеток и лекарств в конкурентной манере. Здесь описаны этапы обработки изображений для измерения в различные моменты времени инфильтрации окрашенных иммунных клеток в клетки меланомы человека A375M, культивируемые в Matrigel, для оценки комбинаций противоопухолевых агентов32. Линия A375M, клеточная линия, полученная из A375P, характеризующаяся высокометастатическим фенотипом, была выбрана для оценки их метастатической способности в присутствии иммунных клеток32.

Описанные модели могут быть полностью совместимы с различными клеточными источниками (мышиные и человеческие иммортализированные или первичные клеточные линии, органоиды, ксенотрансплантаты и другие). В недавних исследованиях нашей лаборатории, сочетая видеомикроскопию с высоким содержанием с анализом изображений, конкурентный 3D-макет был применен для изучения: i) противоопухолевого (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, ADCC) иммунного ответа и анализа роли фибробластов в резистентности к терапии трастузумабом в моделях рака молочной железы HER2+ на чипе33; ii) действие миелоидных клеток (т.е. рак-ассоциированных макрофагов) в механизмах уклонения от опухоли и рекрутирования Т-клеток34; iii) эффективность иммунотерапевтических режимов, в частности, основанных на дендритных клетках, кондиционированных интерфероном α (ИФН-ДК), культивируемых с помощью обработанных лекарственными препаратами клеток рака толстой кишки в коллагеновых матрицах, а также для оценки эффективного движения и последующих событий фагоцитоза35; iv) хемотаксическая миграция эозинофилов, полученных из костного мозга, к клеткам меланомы, обработанным или необработаннымIL-33 36.

Эти передовые модели могут служить окнами наблюдения для понимания роли иммунной структуры в метастазировании рака и механизмах резистентности, но требуются усилия для перевода результатов в клиники, закрывая пробел с фундаментальными исследованиями37.

В качестве нового сценария использование возможностей автоматизированной микроскопии с высоким содержанием в сочетании с использованием более физиологически значимых микросистем открывает новые потенциальные проблемы для обработки, обработки и интерпретации сотен и даже тысяч гигабайт многопараметрических данных, которые могут быть получены в результате одной экспериментальной кампании. Это подразумевает прямую связь экспериментов OOC с алгоритмами на основе искусственного интеллекта 38,39,40,41,42 (ИИ) как для расширенного автоматизированного анализа, так и для генерации функций, которые, в свою очередь, могут питать in silico модели взаимодействия рака и иммунитета43, с захватывающими новыми приложениямина горизонте, такими как разработка прогностических скрининговых анализовлекарств 44.

Постоянно расширяющийся поток усилий сосредоточен на разработке моделей заболеваний вместе с оптимизацией стратегий реализации крупномасштабных экранов возмущений с одноклеточными мультиомиксными показаниями. Это, несомненно, поможет разработке и, надеюсь, клиническому внедрению, сопровождаемому соответствующей степенью стандартизации метода, систематического подхода онкоиммунологии на чипе, чтобы получить новое представление об иммунных нарушениях и механизмах распространения рака.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Дизайн чипа для адгезивных и плавающих клеток 2D-кокультур

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема 2D-культуры (рис. 1A-C) характеризуется тремя камерами (высотой 100 мкм), соединенными между собой двумя наборами микроканальных массивов (500 x 12 x 10мкм 3, Д×Ш×В). Промежуточная камера образует два закрытых тупиковых компартмента, которые блокируют плавающие иммунные клетки, переполняющие место опухоли на этапе загрузки 2.5. Этот тип устройства полезен для двумерных измерений подвижности отдельных клеток (как адгезивных, так и плавающих) в режиме реального времени, а также межклеточных взаимодействий 16,27,28,30,31. Типичное исследование миграции клеток (проводимое от нескольких часов до нескольких дней) сочетает в себе микроскопию живых клеток с алгоритмамиобработки изображений 45, чтобы перевести полученные последовательности изображений в числовые признаки25. На основе миграционных паттернов можно оценить несколько биофизических показателей, таких как смещение и скорость клеток, а также продолжительность взаимодействия иммунных клеток и клеток-мишеней24.

  1. Подготовка раковых клеток и клеток PBMC
    1. Культура раковых клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: MDA-MB-231 тройной отрицательный [рецептор эстрогена (ER)-, рецептор прогестерона (PR)- и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-] клетки аденокарциномы молочной железы человека обычно выращиваются в среде Мемориального института Розуэлл-Парк (RPMI) 1640 с добавлением 10% (v/v) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина, 100 МЕ натриевой соли пенициллина G 100 мл 1 и 100 мкг мл-1 стрептомицина сульфата (питательная среда), в стандартных условиях культивирования (37 °C и 5% CO2).
      1. Для оптимизации роста клеточных культур планшетируют клетки MDA-MB-231 вколбах размером 75 см 2 при плотности 1 × 106 клеток мл-1 в 12-15 мл питательной среды.
      2. Когда клетки достигнут 75-80% слияния, выбросьте питательную среду, промойте клетки предварительно подогретым фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чтобы полностью удалить FBS, а затем отделите их предварительно подогретым трипсином (1-2 минуты при 37 ° C).
      3. Добавьте питательную среду, чтобы инактивировать ферментативную активность трипсина и собрать отделившиеся клетки. Мойте клетки дважды в течение 5 минут при 1 100 x g при комнатной температуре (RT).
      4. Подсчитайте клетки на предметном стекле для подсчета клеток с помощью теста на исключение красителя Trypan Blue, а затем повторно засейте их либо для поддерживающей культуры (не более 6 пассажей от оттаивания), либо для экспериментальных процедур.
      5. Для микрофлюидных экспериментов засейте 1 × 10 6 клеток в 6-луночных планшетах в 3 мл питательной среды и обработайте либо 25 мкМ доксорубицином (DOXO), либо равным объемом растворителя DOXO (PBS) в качестве контроля.
      6. Через четыре-6 часов после этого дважды промойте клетки, обработанные DOXO, предварительно подогретым PBS в течение 5 минут при дозе 1,100 x g при RT.
      7. Подсчитайте контрольные клетки, обработанные DOXO и PBS, как указано выше (см. шаг 1.1.1.5), и установите кокультуру с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) в микрофлюидных устройствах.
    2. Изоляция PBMC
      1. Соберите венозную цельную кровь (примерно 10 мл) от здоровых добровольцев в гепаринизированные флаконы и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку 2-4 раза47.
      2. Разбавьте кровь 1:1 PBS и нанесите более 10 мл градиентной среды плотности Lymphoprep в пробирку объемом 50 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы делаете наслоение очень осторожно и медленно, чтобы кровь и лимфопреп образовали два отдельных слоя.
      3. Центрифужные пробирки в течение 30 минут при 400 x g при 4 °C в откидном ведре без тормозов. Образуются четыре отдельных слоя: (i) плазма наверху, (ii) белый и мутный слой, содержащий PBMC, (iii) лимфопреп и (iv) гранула эритроцитов и гранулоцитов.
      4. Осторожно аспирируйте PBMC с помощью пипетки объемом 2 мл и немедленно ресуспендируйте в теплой питательной среде (то же, что используется на этапе 1.1.1) и промывайте дважды в течение 5 минут при дозе 1,100 x g при RT.
      5. Подсчитайте гранулированные PBMC, как указано выше (см. этап 1.1.1.5), и либо используйте для экспериментальных процедур, либо заморозьте для длительного хранения.
  2. Покрытие ячеек в 2D-чипах
    ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC не окрашиваются в этом протоколе. Чтобы охарактеризовать специфические фенотипы на чипе, субпопуляции иммунных клеток могут быть выделены путем иммуномагнитного отбора шариков, окрашены флуоресцентными клеточными трекерами, повторно смешаны с немеченой оставшейся фракцией и, таким образом, противопоставлены раковым клеткам-мишеням, как сообщается в экспериментах на чипе, описанных в Vacchelli et al.27 и в Racioppi et al.34.
    1. Перед началом экспериментов по совместному культивированию и для облегчения добавления реагентов активируйте хранящиеся чипы кислородно-плазменной обработкой в течение нескольких секунд. Немедленно заполните резервуары деионизированной водой или PBS, чтобы поверхности PDMS (полидиметилсилоксан) оставались гидрофильными до этапов нанесения покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS по своей природе гидрофобна, что может привести к трудностям в работе и улавливанию пузырьков воздуха в микроканалах. См. шаг 7 в дополнительном файле, содержащем подробную информацию об активации кислородной плазмы.
    2. Стерилизовать под УФ-шкафом в течение 20 мин, промыть 2-3 раза свежим PBS, а затем инкубировать с питательными средами в течение 1 ч. Храните чипсы в инкубаторе до выполнения этапов гальванического покрытия.
    3. Изымайте лишние среды из всех шести резервуаров. Следите за тем, чтобы среда не всасывалась из основных камер культуры.
    4. Медленно применяют 1 × 105 раковых клеток, ресуспендированных в 10-20 мкл питательной среды в верхнем левом резервуаре, а затем в нижней лунке (рис. 1А, резервуары 1 и 2). Подождите 5 минут, чтобы клетки прилипли к опухолевой камере. Некоторые клетки осядут и прикрепятся в водоемах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте клеточную суспензию рядом с отверстиями каналов. Эта процедура применяется к раковым клеткам MDA-MB-231, другие линии потребуют оптимизации плотности клеток. Для улучшения прикрепления раковых клеток может быть выполнена функционализация покрытий поверхностей (например, поли-L-лизин, фибронектин). Пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными протоколами для этапов нанесения покрытия16, 48, 49, 50.
    5. С правой стороны осторожно пипетите 1 × 106 PBMC ресуспендируют в 50 мкл питательной среды в лунки 3 и 4 (см. рис. 1А, коллекторы 3 и 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После протекания PBMC будет распределяться в промежуточную камеру, создавая «фронт», который представляет собой отправную точку эксперимента.
    6. Заполните все шесть резервуаров до 100-150 мкл питательной среды. Под микроскопом проверьте, правильно ли распределены клетки в культуральных отсеках, как показано на рисунке 1D-E. Конечные объемы могут варьироваться в зависимости от размера резервуаров. Отрегулируйте объемы так, чтобы они были одинаковыми во всех скважинах.
    7. Поместите чипы обратно в инкубатор примерно на 1 час, чтобы стабилизировать систему перед покадровой записью. Добавляйте свежую среду каждые 3 дня, так как она может быть подвержена потерям при испарении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система совместима как с анализом живых/мертвых клеток, так и с динамическим мультиплексным профилированием секреции цитокинов из кондиционированных сред. Для хемокинового анализа до 200-250 мкл аликвот надосадочных веществ могут быть доступны путем сбора сред из двух резервуаров каждого отсека. Классические анализы ИФА и цитокинов Luminex требуют около 50 мкл надосадочных веществ. Пожалуйста, ознакомьтесь с 51,52 примерами исследований других лабораторий, выполняющих профилирование цитокинов на моделях OOC.
  3. Покадровое получение немеченых раковых и иммунных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 3 чипа расположены на одном предметном стекле микроскопа (см. Рисунок 1A для 2D-чипа и Рисунок 4B для 3D-чипа). Используя держатели ступеней, выделяющие 4 предметных стекла, кокультуры могут быть пригодны для мониторинга с помощью автоматизированной микроскопии с высоким содержанием для анализа больших партий экспериментальных условий. Чипы могут быть легко установлены на предметных стеклах толщиной 1 мм или 170 микрон (пластиковые или стеклянные покровные стекла, 6-луночные оптические донные мультилунки) для конфокальной визуализации высокого разрешения.
    1. Запись серии изображений немеченых клеток в ярком поле с помощью установки видеомикроскопии, оснащенной инкубационной системой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь наборы данных временных рядов (временное окно: 48 ч, частота кадров: 2 мин) были получены с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 4-кратным объективом и пикселями CMOS 1,3M, оптимизированными для размещения в стандартном инкубаторе клеточных культур.
    2. Перед началом сбора микроскопа прогрейте микроскоп не менее 2 ч до уравновешивания до 37 °C и 5%CO2.
    3. Выберите окно наблюдения, центрируя массив микроканалов между опухолью и центральным компартиментом. Это позволяет визуализировать динамику иммунной инфильтрации и взаимодействия внутри области, в которой высеваются раковые клетки.
    4. Отрегулируйте интенсивность освещения и фокусировку раковых и иммунных клеток.
    5. Для запуска покадровой съемки оптимизируйте частоту кадров и продолжительность времени в соответствии с экспериментом и типом исследуемой ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия съемки должны быть оптимизированы, чтобы избежать чрезмерной фотоэкспозиции, сохраняя при этом хорошее отношение сигнал/шум (SNR). Поскольку иммунные клетки очень подвижны, частота кадров сбора данных должна быть достаточно высокой, чтобы следить за интересующим динамическим процессом и обеспечивать легкое отслеживание53. Должен быть достигнут компромисс между алгоритмом отслеживания, совместимостью с размером результирующего набора данных и жизнеспособностью, плотностью и подвижностью наблюдаемых клеток.
    6. В конце интервальной съемки используйте функцию «Импортировать последовательность изображений» и «Сохранить как» программного обеспечения ImageJ, чтобы преобразовать набор данных кадра в несжатый видеофайл со скоростью 25 кадров в секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сгенерированный видеофайл теперь готов к анализу отслеживания ячеек. Здесь были собраны изображения RGB (1280x1024 пикселей) с пространственным разрешением 1,33 мкм/пиксель. Фильм продолжительностью 24 часа (стек 3,5 ГБ) с одним полем зрения (FOV) состоит из 720 кадров для каждого условия.
  4. Анализ данных: полуавтоматическое извлечение немеченых иммунных треков с помощью Trackmate
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь анализ подвижности иммунной системы в 2D-немаркированных покадровых изображениях проводится с помощью TrackMate54, набор инструментов с открытым исходным кодом, доступный в пакете программного обеспечения Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Предусмотрено несколько алгоритмов для автоматического отслеживания отдельных частиц55(СПТ) точечных структур. Они были эффективно применены к флуоресцентным изображениям, где объекты яркие на темном фоне с высоким отношением сигнал/шум (т.е. флуоресцентные пятна с низким разрешением, меченые дорожные везикулы, ядра)1,25,56,57,58. SPT в основном основан на двух последовательных шагах. Во-первых, объекты локализованы с идентифицированными позициями в нескольких кадрах (сегментация), как показано в схемеРисунок 2. На втором этапе (связывание частиц) обнаруженные пятна связываются в последовательных кадрах для оценки движения и реконструкции их траекторий в форме трека (Рисунок 3). Числовые признаки могут быть вычислены из каждого извлеченного массива координат X, Y, Z с течением времени. Расширенная документация представлена в54а также онлайн (http://imagej.net/TrackMate), следуя руководству по началу работы с TrackMate. Точность процесса может быть проверена немедленно, обрабатывая интуитивно понятный графический интерфейс пользователя (графический интерфейс, похожий на мастер), который позволяет пользователям на каждом этапе изменять настройки. В следующей части кратко показано, как использовать Trackmate для обработки изображений и этапов количественной оценки, применяемых к изображениям в видимом свете:
    1. Перетащите стек видео/изображений, работающий полный рабочий день, на панель инструментов Фиджи.
    2. Настройка калибровочного стека (рис. 2A).
      1. Проверьте размерность и назначьте свойства изображения, выбрав «Изображение> Свойства». Поля «Единица заполнения длины», «Размеры в пикселях» и «Интервал между кадрами».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения калибровки используйте известную длину микроканалов (500 мкм, рис. 1C) и разделите на соответствующую измеренную длину в пикселях. Для временных рядов 2D убедитесь, что поле Z/T поменяно местами, введя 1 в качестве z-среза и правильное количество кадров фильма. Если этого не сделать, количественные результаты и параметры Trackmate будут отображаться в пиксельных единицах и таймфреймах.
    3. Предварительная обработка изображений.
      1. Чтобы улучшить правильное различение иммунных клеток на шумном фоне, предварительно обработайте изображения яркого поля для компенсации артефактов. Убедитесь, что наборы данных состоят из 8-битных изображений TIFF (диапазон яркости: 0–255).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное освещение, низкое отношение сигнал/шум и загрязнение мелкими частицами мусора на изображениях в видимом свете могут поставить под угрозу успех процесса отслеживания клеток. Здесь наборы данных временных рядов предварительно обрабатываются с помощью вычитания фона, функции регулировки яркости/контрастности и локального вычитания размытия изображения по Гауссу из исходных изображений. В ImageJ доступны и другие наборы инструментов для анализа для обработки и сегментации фазово-контрастных изображений или изображений яркого поля, включая эмпирический порог градиента (EGT)59.
    4. Первая калибровочная панель (рис. 2A)
      1. Выбрав стек изображений, запустите Trackmate (Плагины>Отслеживание).  Пересмотреть/подтвердить размерность и временное окно данных (т. е. ширину пикселя и интервал кадра).
        ПРИМЕЧАНИЕ: TrackMate автоматически считывает данные в поле свойств изображения, чтобы дать окончательные результаты отслеживания в откалиброванных физических единицах (т.е. мкм и минутах).
      2. Определите интересующую область для вычисления извлечения иммунных треков, вручную вставив значения или нарисовав замкнутую область поверх активного изображения, а затем нажав кнопку «Обновить источник». Чтобы выделить глобальные пути иммунной миграции, выберите прямоугольные области соответственно с правой стороны микроканалов (центральная камера, рис. 1E) и слева (опухолевая камера, рис. 1D). Чтобы проанализировать взаимодействие между раком и иммунными горячими точками, нарисуйте круговые субрегионы с помощью инструментов ROI (перейдите в раздел «Редактирование» → «Выделение» → «Указать»).
        ПРИМЕЧАНИЕ: При первом запуске этого набора инструментов на новом биологическом приложении потратьте необходимое время на оптимизацию настроек для реконструкции дорожек.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ручное отслеживание траекторий ячеек (около 50-100 ячеек), чтобы эмпирически найти правильную конфигурацию и затем проверить в качестве эталона надежность автоматического извлечения движений. Кроме того, первоначально работайте на меньшей площади, чтобы легко проверить точность выбранных параметров.
    5. Этап обнаружения иммунных пятен (рис. 2B)
      1. Выберите детектор Лапласиана Гаусса (LoG) по умолчанию. Детектор LoG работает для поиска ярких, похожих на капли, округлых объектов и применения лапласианского фильтра Гаусса к изображению, настроенному на промежуточные размеры пятен (от 5 до 20 пикселей в диаметре).
      2. В поле «Расчетный диаметр большого двоичного объекта» (здесь 10–13 мкм) введите значение, немного превышающее ожидаемый размер пятна. Увеличивайте пороговое значение (здесь 1-3 мкм) до тех пор, пока не уменьшатся дополнительные паразитные фоновые пятна, возможно, без удаления элементов объекта. Обнаружения ниже порогового значения (на основе показателей качества) будут исключены из последующего анализа. Установите флажок для медианного фильтра и субпиксельной локализации, чтобы улучшить качество обнаружения пятен.
      3. Используйте кнопку «Предварительный просмотр» для просмотра и быстрого осмотра идентифицированных иммунных клеток, наложенных на изображения пурпурными кругами.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибки при обнаружении окажут значительное влияние на процесс связывания. Другие нежелательные обнаружения могут быть исправлены в последующих меню с помощью пользовательских фильтров (например, по интенсивности, размеру или положению пятна).
    6. Когда вы будете удовлетворены выбором, нажмите «Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки могут варьироваться в зависимости от экспериментальной установки и методов получения изображений (например, поле зрения, увеличение объектива, яркопольные или флуоресцентные изображения), типа клеток (адгезивные или плавающие клетки), от медленной или быстрой подвижности, типа клеточного поведения (взаимодействующие или нет) и низкой/средней/высокой плотности в области наблюдения.
    7. Продолжите и пропустите меню Initial Thresholding. Выберите окно Hyperstack Displayer.
    8. Установите фильтры на панели спотов (рис. 2C).
      1. Выберите: Однородный цвет. Фильтры, как показано на рисунке 2C, могут быть добавлены для сохранения помеченных пятен со значениями признаков, отображаемых на гистограмме, выше или ниже обратимого порога.
    9. Этап выбора трекера (рис. 3А). Выберите трекер Simple LAP, так как алгоритм связывания частиц запрашивает три поля для заполнения (в данном случае «Максимальное расстояние связывания»: 30-50 мкм, «Максимальное расстояние закрытия зазора»: 25-50 мкм, «Максимальное закрытие зазора кадра»: 4-6). Этот детектор управляет событиями закрытия пробелов, при этом расчет привязки затрат производится исключительно на основе их соответствующего расстояния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально допустимое расстояние связи ограничивает диапазон пространственного поиска потенциальных совпадающих точек, соответствующий максимально допустимому смещению, пройденному между двумя последующими кадрами (рис. 3D).
      1. Обеспечивают большие значения максимального смещения при обнаружении фрагментации треков высокоподвижных частиц.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Два звена не будут соединены, если перемещение от кадра к кадру больше, чем заданное максимальное значение расстояния. Если сегменты плохо соединяют две разные ячейки, уменьшите значение максимального смещения.
      2. Попробуйте заново соединить недостающие места, варьируя значения «максимального расстояния для закрытия зазора» и «максимального зазора кадра».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры имеют дело с событиями закрытия разрыва в несмежных кадрах. Для некоторых кадров может произойти точечное исчезновение (например, частицы не в фокусе, ячейки, оставленные и находящиеся в поле зрения, сбои сегментации в зашумленном изображении).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки событий разделения или слияния выберите компоновщик LAP в качестве детектора, который вводит штрафы за матрицу затрат на связывание.
    10. Нажмите кнопку Далее, чтобы запустить расчет отслеживания. Нажмите Далее.
    11. Панель фильтрации треков (рис. 3B). Измените цвет иммунных путей, выбрав в раскрывающемся меню «Идентификатор трека» или другие функции трека. На этом этапе выберите, по желанию, чтобы установить интерактивные фильтры функциональными, чтобы улучшить качество результата и вернуться к процедуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Паразитные пятна возникают из-за шума на изображении и потери качества изображения. Это приведет к созданию коротких сегментов, в то время как интересующие ячейки можно будет отслеживать во многих кадрах.
      1. Чтобы удалить короткие контуры, попробуйте отфильтровать их, исходя из количества пятен, которые они содержат. Кроме того, можно сортировать дорожки, используя комбинацию таких параметров, как «Смещение дорожки», «Длительность дорожки» или «Минимальная/средняя/максимальнаяскорость», чтобы исключить ложные или нежелательные дорожки (с меньшим количеством кадров по отношению к общей продолжительности интервальной съемки или с грязными или недвижущимися частицами) из дальнейшей постобработки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор фильтров может варьироваться в зависимости от конкретного применения и биологической системы.
    12. Изучите все дорожки в интерфейсе параметров отображения, прокрутите время и проверьте, насколько точно треки соответствуют путям миграции ячеек. Выпадающее меню содержит цветовые коды для пятен и траекторий для удобной визуализации и фильтрации по нескольким модальностям (например, кинетические параметры, интенсивность, временное или пространственное положение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для отслеживания культур высокой плотности или высокоподвижных клеток увеличьте частоту кадров сбора данных, минимизируя смещение клеток, перемещаемое через последовательные промежутки времени.
    13. Ручное исправление ошибок сегментации и связывания (рис. 3E).
      1. Чтобы еще больше повысить качество результатов, редактируйте пятна (частицы мусора, неподвижные клетки) вручную и удаляйте ошибочные следы, полученные из обнаруженных границ опухоли при анализе ROI опухолево-иммунного взаимодействия.
      2. Сначала выберите инструмент TrackMate на панели инструментов ImageJ. Чтобы удалить существующее пятно по всему стеку, нажмите клавишу Shift и создайте курсором мыши маску ROI над целевым пятном (отредактированным в зеленом круге), а затем нажмите клавишу DEL.
      3. Для добавления нового пятна (в случае отсутствия треков из-за исчезновения пятен) нажмите клавишу A, наведя мышь на указанное место. Повторите процесс вычисления связывания дорожек после этого шага.
    14. Когда все будет готово, выберите «Анализ» на панели «Параметры отображения», чтобы создать три текстовых файла (рис. 3C и 3F). В таблице «Пятна в статистике треков» приведены пространственно-временные координаты иммунных пятен (X-Y-Z положения клеток, помеченных соответствующим фреймом и номером трека). «Ссылки в статистике треков» и «Статистика треков» содержат информацию относительно треков: длительность трека, количество обнаруженных пробелов или пятен, начальный и стоп-кадр трека и т.д. Сохранение и экспорт для каждого набора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на строку в окнах результатов в покадровой видеосъемке активируется соответствующая точка, ссылка или трек для визуального осмотра. Повторите шаги фильтрации, чтобы выбрать/удалить треки. Все будущие экспортируемые данные будут обновлены. СОВЕТ: Значения начального и стоп-кадра и длительности отслеживания можно использовать для расчета времени контакта между раком и иммунными клетками при обработке рентабельности инвестиций.
    15. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы создать результирующий XML-файл, содержащий все значения параметров, путь к изображениям и позиции пятен во времени. Команда ''Load TrackMate file'' (Плагины> Tracking) восстанавливает весь сеанс процесса для каждого файла фильма в отдельности.
    16. Перейдите к последней панели графического интерфейса под названием «Выбрать действие». В списке используйте наложение захвата > функцию «Выполнить», чтобы создать видео с наложенными дорожками. СОВЕТ: Опция «График N-точек в зависимости от времени» может быть использована для вычисления пространственной плотности иммунных клеток в ROI (рис. 6B, правая панель).
    17. Постпроцессинговый анализ и миграционная статистика
      1. Анализируйте необработанные данные о местоположении непосредственно в Trackmate или экспортируйте данные для расчета комплексных кинетических параметров29 (т. е. общей длины траектории, евклидова расстояния, коэффициента удержания, смещения в среднем квадрате56, средней или мгновенной скорости пути, коэффициента остановки, распределения углов миграции, индекса прямой миграции, средней скорости по прямой) для классификации поведения миграции иммунных клеток (например, направленного или диффузионного движения30, 31) и реакция на раковые клетки-мишени (например, лечение по сравнению с контролем).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные полезные плагины, такие как The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/), предоставляют различные графики (например, графики розы или сектора, как показано на рисунке 6) и статистические тесты для расширенного анализа и визуализации экспериментальных данных миграции и хемотаксиса. Сочетание алгоритмов24,25,45 отслеживания клеток и сегментации клеток может позволить измерять морфологические показатели на уровне одной клетки (т.е. площадь поверхности клетки, длину большой и малой осей и соотношение сторон клетки).

2. 3D-иммунокомпетентная модель рака на чипе в конкурентном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция 3D-чипа, изображенная на рисунке 4, состоит из 5 основных отсеков: центрального для приема плавающих иммунных клеток, двух боковых областей для встраивания опухолевых клеток в гидрогелевые матрицы (высотой 150-250 мкм) и камер перфузии среды. Иммунная и опухолевая камеры соединены двумя наборами узких массивов микроканалов (200×12×10мкм 3, L×W×H, рис. 4E). Обычно трапециевидные равнобедренные микростолбы с интервалом 100 мкм (около 25-30 границ раздела для каждой боковой области геля, рис. 4C) работают как барьеры для удержания раствора геля во время инъекции, используя баланс между поверхностным натяжением и капиллярными силами60,61 и соединяя опухолевые области с двумя боковыми дополнительными медиакамерами, чтобы установить границу раздела гель-жидкость (рис. 5). Подробные характеристики конкурентного 3D-анализа показаны на рисунке 4. Предпочтительная миграция иммунных клеток к двум гидрогелевым компартментам, содержащим опухолевые клетки, которые подверглись различным методам лечения, может контролироваться и количественно оцениваться. Конкретная конкурентная схема может быть применена для исследования множества различных фенотипов биологии рака (например, лекарственно-устойчивые против агрессивных, первичные или метастатические, респондеры против нереспондеров). Кроме того, области, встроенные в гель, могут быть легко интегрированы с различными клеточными популяциями для воссоздания более гетерогенных TME, включая стромальные компоненты (фибробласты, эндотелиальные клетки)23 или для моделирования специфических иммуносупрессивных сред34 (например, макрофагов) для рассечения механизмов лекарственной устойчивости и уклонения от опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерное и активное окрашивание каспазы с использованием коммерческих наборов для анализов живых/мертвых (например, реагентов Thermo Fisher Scientific, Incucyte) может быть реализовано для оценки событий митотической или апоптотической смерти, как сообщается в Nguyen et al.33.

  1. Приготовление матричного раствора с ячейками и загрузка в прибор
    ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих экспериментальных условиях две области геля содержат смеси клеточных линий меланомы человека A375M, выращенных в матричном растворе (например, Matrigel), подвергнутых воздействию терапевтических агентов, используемых в качестве монотерапии или в комбинации. Эта настройка позволила нам оценить эффективность комбинации двух препаратов по отношению к одному в конкурентной манере и количественно оценить их способность привлекать PBMC.
    1. Разморозьте бульон матричного раствора (например, Matrigel), поместив его на лед в холодильник с температурой 4 ° C за день до эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте продукт многократным циклам замораживания-оттаивания, так как он становится «комковатым». Другие протоколы синтетических или натуральных гидрогелей могут быть подходящими для использования в этих условиях. Пожалуйста, обратитесь к 33,34,35 для подготовки раковых клеток в коллагеновых матрицах.
    2. Ресуспендировать клетки меланомы человека A375, окрашенные совместимым с живыми флуоресцентным клеточным линкером PKH67 Green в матричном растворе (2 мг мл-1). Там, где это указано, добавляют 5-аза-2'-дезоксицитидин (DAC; 2,5 мкМ), называемый DAC, и/или ИФН-α2b, называемый ИФН, в соответствующих дозах32.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопоставьте лот # в спецификации матричной бутылки. На основе концентрации рассчитайте объем среды, необходимый для получения до 2 мг мл-1 Пожалуйста, отрегулируйте оптимальную концентрацию белка и концентрацию суспензии раковых клеток в соответствии с интересующим вас приложением.
    3. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Держите микроцентрифужную пробирку на льду во время смешивания, чтобы предотвратить нежелательную полимеризацию.
    4. После стерилизации поместите устройства на лед (используя ведро со льдом и крышку), чтобы избежать затвердевания матричного раствора в течение всей процедуры загрузки клеток.
    5. Медленно вводите две смеси ИФН и ЦАК/ИФН матригеля / опухолевых клеток (2-4 мкл) в левый и правый порт геля соответственно с помощью микропипетки объемом 10 мкл с помощью холодных наконечников (рис. 5A). Слегка надавите, чтобы протолкнуть матричный раствор с одной стороны, пока не достигнет противоположной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем матричного раствора был выбран таким образом, чтобы избежать перелива в соседние каналы. Не оказывайте чрезмерного давления пипетки, чтобы предотвратить утечку раствора в среду и центральные каналы. Если во время загрузки путь геля заблокирован вдоль канала, попробуйте ввести раствор с другого входного отверстия до тех пор, пока фронты геля не встретятся. При извлечении микропипетки из входных отверстий придерживайте поршень, иначе отрицательное давление будет асспирировать матричный раствор.
    6. Поместите устройство в инкубатор в вертикальное положение при 37 °C и 5% CO2 на 30 минут, чтобы обеспечить гелеобразование матричного раствора (рис. 5B). Осторожно обрабатывайте стружку встроенным неполимеризованным гелем, чтобы предотвратить утечку из гелевого канала.
    7. Тем временем ресуспендируют меченные PKH67 PBMC (1x106 клеток) в 10 мкл полного DMEM (модифицированная среда Дульбекко Орла).
    8. После матричного гелеобразования заполните каналы среды (50-100 мкл) одной и той же аликвотой питательной среды во всех шести резервуарах, чтобы предотвратить высыхание геля в стружке. Держать в инкубаторе до высева суспензии иммунных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом правильное и однородное распределение опухолевых клеток в геле и целостность полимеризованных гелевых барьеров. Частично или неоднородные гелеобразные области или пузырьки в смеси приводят к преждевременному течению PBMC в каналах гелевых сред в начальной точке эксперимента из-за начальных колебаний давления.
    9. Аспирируйте среду из шести лунок и расположите наконечник рядом с входом в канал среды, чтобы осторожно впрыскивать суспензию ячейки PBMC умеренного давления. Временная последовательность загрузки показана на рисунке 5C:
      1. PBMC в среде 10 мкл в верхнюю центральную лунку.
      2. 50-100 мкл среды в каждую из четырех лунок боковых каналов.
      3. 40-90 мкл среды в верхнюю центральную лунку.
      4. 50-100 мкл среды в нижнюю центральную лунку.
    10. Под микроскопом убедитесь, что распределение PBMC остается ограниченным в центральной камере после этапа загрузки. (Рисунок 7А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не оптимально, при необходимости отрегулируйте концентрацию и повторите этапы посева, используя нетронутую стружку. При расчете объемов для планируемых условий эксперимента ориентируйтесь на избыточное количество микросхем (15-20%), чтобы учесть возможные погрешности и корректировки. Объемы и концентрации должны быть оптимизированы в соответствии с конкретным применением.
    11. Поместите собранные устройства на ровную поверхность в инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2 для последующего получения флуоресцентной визуализации. Бережно обращайтесь с чипсами после загрузки иммунных клеток, которые плавают.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсируйте потери объемов испарения в резервуарах путем замены сред каждые 2-3 дня. Для профилирования хемокинов можно отсасывать до 100 мкл из каждой из двух лунок культуральных отсеков, см. шаг 2.7 на этапе 1.
  2. Автоматизированный подсчет рекрутированных PBMC на одноканальных флуоресцентных изображениях в ImageJ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Классические методы иммунофлуоресценции для конфокальной визуализации с высоким разрешением могут быть применены к операциям на кристалле в качестве конечных измерений. Основная процедура окрашивания включает фиксацию клеток на чипе, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител, окрашивание ядер с промывкой между ними. Немеченые иммунные клетки, инфильтрированные в области 3D-гелей со встроенным микроокружением рака, могут быть зафиксированы в желаемые моменты времени и окрашены для экспрессии маркеров активации/истощения/созревания (например, для клеток CD8, мониторинг маркеров CD69, CD95, PD1, TIM3). В Parlato et al.35фагоцитоз апоптотических клеток SW620 оценивали методом конфокальной микроскопии с использованием устройств, установленных на покровных стеклах толщиной 170 мкм. ИФН-ДК окрашивали с добавлением античеловеческих аликвот HLA-DR-FITC Ab.
    Чтобы рассчитать степень инфильтрации флуоресцентно окрашенных живых иммунных клеток, подвергающихся воздействию конкурентных сигналов, общий рабочий процесс анализа изображений устанавливается следующим образом (Рисунок 7D-Г):
    1. Получение, в определенных конечных точках времени, фазового контраста и красных/зеленых каналов флуоресцентных микрофотографий левой и правой областей геля, содержащих опухолевые клетки, соответственно подвергшихся воздействию одного или комбинаций фармакологических режимов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь изображения были получены флуоресцентным микроскопом EVOS-FL после загрузки клеток (0 ч), через 48 ч и через 72 ч инкубации (рис. 7A-B). 4-10-кратное увеличение было использовано для получения центральной камеры, микроканальных матриц и двух сопоставленных боковых каналов, содержащих A375 плюс ИФН и A375 плюс ЦАП/ИФН.
      1. При выполнении операций сбора данных учитывайте параметры для измерения и избегайте насыщения подсчитываемых объектов. Оптимальные результаты сегментации зависят от характера полученных изображений из-за изменчивости самих биологических образцов, качества окрашивания и методов микроскопии, используемых для приложений, ориентированных на пользователя.
    2. Загрузите флуоресцентные одноканальные данные (в данном случае красный = PBMC) на Фиджи, перетащив их в главное окно (рис. 7D). Дублируйте изображение, чтобы избежать перезаписи необработанных данных во время выбора фильтров предварительной обработки до окончательной сегментации.
      1. Если изображение является цветным изображением (RGB), нажмите «Изображение > тип 8 или 16 бит», чтобы преобразовать его в оттенки серого. Убедитесь, что для параметра «Параметры редактирования >» > «Преобразованиеs» установлено масштабирование при преобразовании.
    3. Предварительная обработка необработанных данных путем очистки от шума и артефактов.
      1. Перейдите в меню «Обработать» > «Вычесть фон», применив алгоритм катящегося шара для коррекции неравномерного шумового фона с большими пространственными вариациями интенсивности. Установите радиус не менее чем на размер самой большой частицы переднего плана. Установите флажок «Предварительный просмотр» для процедуры проб и ошибок, чтобы получить оптимальные результаты. Слишком малые значения могут привести к неправильному удалению интересующих структур.
      2. В команде «Яркость и контрастность» перетащите ползунки «Минимум/Максимум», чтобы изменить диапазон интенсивности на гистограмме. Сдвиньте ползунок «Максимум» влево, чтобы увеличить яркость без функций размытия. Переместите слайд «Минимум» вправо, чтобы увеличить контрастность изображения, избегая исчезновения менее заметных элементов на заднем плане. Нажмите кнопку Применить, чтобы исправить изменения.
    4. Улучшение изображения.
      1. Перейдите в раздел Process > Filters и поэкспериментируйте с медианными, гауссовскими фильтрами на изображениях (рис. 7E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус предварительной фильтрации должен быть адаптирован к пикселям шума изображения. Нелинейный медианный фильтр заменяет значение пикселя медианным значением соседей, чтобы уменьшить шум соли и перца. «Размытие по Гауссу» используется для сглаживания цифрового изображения путем замены пикселей средневзвешенным значением окружающих пикселей. Веса взяты из гауссовского распределения вероятностей, поэтому ближайшие пиксели более влиятельны.
      2. При желании перейдите в раздел «Обработать» > «Математика» > «Гамма» с отмеченным флажком «Предварительный просмотр», чтобы увеличить контрастность.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность, установленная на панели B&C, масштабируется между двумя минимальными и максимальными пределами. Значения < 1,0 подчеркивают различия между низкой интенсивностью, в то время как значения > 1,0 подчеркивают различия между высокими интенсивностями. Гамма-коррекция функциональна для определения диапазона отображения, показывая самые тусклые объекты, не насыщая самые яркие.
    5. Создание двоичной маски изображения.
      1. Перейдите в раздел «Изображение» > «Настроить порог >». Наиболее простой метод определения пороговых значений основан на гистограммном анализе уровней интенсивности, как показано на рисунке 7F. В выпадающем меню поиграйте с различными методами глобального порога (в нашем случае применяется Otsu).
      2. Вручную прокрутите или введите известный диапазон интенсивности пикселей на панелях гистограммы, наблюдайте за изменением красного узора, накладывающегося на изображение, которое в основном напоминает фактическую область ячейки. Кнопка «Сброс» удаляет наложение. Когда все будет удовлетворено, нажмите «Применить», чтобы создать двоичную версию изображения. Установите флажок Process > Binary > Options, чтобы управлять отображением изображений с пороговыми значениями и идентификацией объектов анализатором частиц.
    6. Используйте команду меню Process/Binary/Watershed Articles, чтобы разделить частично перекрывающиеся или объединенные частицы во время порогового значения. Водораздел часто может точно разрезать их на части, добавив линию толщиной 1 пиксель. Выполняйте морфологические операции, такие как операции расширения или эрозии, для увеличения или удаления пикселей из-под или перенасыщенных пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации см. раздел Команды меню или обратитесь к MorphoLibJ, интегрированной библиотеке, основанной на математической морфологии для обработки двоичных данных.
    7. Описание функции количественного изображения.
      1. Получив удовлетворительное распознавание объектов, откройте анализатор частиц в разделе «Анализ» > «Анализ частиц». Частицы могут быть исключены по их размеру и цикличности, выраженным в пикселях или в калиброванной единице измерения (проверьте правильность шкалы относительно настроек микроскопа в разделе «Свойства изображения>»). Чтобы включить все, оставьте диапазон по умолчанию 0-бесконечность и цикличность по умолчанию на 0,00–1,00 (0 = прямая линия, 1 = идеальный круг).
      2. Чтобы отфильтровать мелкие «шумовые» пиксели или неинтересные объекты, установите минимальный и максимальный диапазон. Установите флажок «Включить отверстия», «Показать», «Контур» и «Отобразить результаты» в поле окна. Исключить по краям отбрасывает частицы, обнаруженные на границах изображения. Добавить в Manager добавляет полученный выбор в менеджер ROI для дальнейшего анализа, сохраняя информацию о положении частицы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В «Менеджере ROI» можно исправить автоматическую сегментацию записанных выходных данных (слияние разделенных ячеек, разделение объединенных ячеек). С помощью инструментов выделения на панели инструментов Фиджи выберите ROI внутри обеих областей геля, в которые встроены раковые клетки, чтобы оценить иммунную инфильтрацию.
    8. Экспортируйте полученные значения в электронную таблицу для выполнения статистического анализа, как показано на рисунке 7G. В разделе «Результаты» приводится таблица данных, относящаяся к идентифицированным пронумерованным очерченным свойствам частиц. «Резюмировать» открывает окно с названием изображения, общим количеством и другой информацией для всего изображения.
      1. Перейдите в раздел «Анализ» > «Установить измерения», чтобы включить широкий спектр параметров.
    9. При необходимости запишите макрос (выбрав Подключаемые модули > Макросы > Запись), чтобы автоматизировать рабочий процесс обработки и сэкономить время на анализ больших наборов данных.
      1. Используйте ту же процедуру обработки для анализа зеленого флуоресцентного канала в тех же областях для анализа морфологических изменений опухолевых клеток в 3D-областях16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Иммунная инфильтрация опухоли является параметром противоопухолевого ответа хозяина. Опухоли неоднородны по составу, плотности, расположению и функциональному состоянию инфильтрирующих лейкоцитов, взаимодействие которых с раковыми клетками может лежать в основе клинически значим?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанные методы пытаются разработать общий подход к повторению, с модулируемой степенью сложности, двух важных аспектов в области онкоиммунологии, которые могут выиграть от принятия более актуальных моделей in vitro. Первый включает в себя сторону популяции опухолевых клеток, где устра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам раскрывать нечего. AS поддерживается Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) и Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS и FM поддерживаются Итальянской ассоциацией исследований рака (AIRC) No 21366 для G.S.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture materials 
50 mL tubesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-hypomethylating agent
6-well platesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506culture dishes
75 cm2 cell culture treated flaskCorning, New York, NY430641Uculture flasks
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochlorideMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0728LCulture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o MagnesiumEuroClone Spa, Milan, ItalyECB4004Lsaline buffer solution
Fetal Bovine SerumEuroClone Spa, Milan, ItalyECS0180Lancillary for cell culture
FicollGE-Heathcare17-1440-02separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometerNeubauerCell counter
Heparinized vialsThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAVials for venous blood collection
interferon alpha-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595recombinant human cytokine
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milan, ItalyECB3000Dancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation mediaCedarlane Labs, Burlington, CanadaSeparation of lymphocytes by density gradient centrifugation
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
MatrigelCorning, New York, NY354230growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA HTB-26human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X  EuroClone Spa, Milan, ItalyECB3001Dancillary for cell culture
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLred fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgreen fluorescent cell dye
RPMI-1640EuroClone Spa, Milan, ItalyECM2001LCulture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solutionThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061cell stain to assess cell viability
TrypsinEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0920Ddissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscopeThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Steril VBH 72 MPLaminar flow hood
Optical microscopeZeiss
Refrigerable centrifugeBeckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)Sigma AldrichA3648silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ MB W&A,  Germanyoptical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)Ibidi, Germany10812
Hydrogen Peroxide solution 30%Carlo Erba Reagents412081reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketoneCarlo Erba Reagents461945PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm Sail Brand7101substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mmTedpelladermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDaAllresist,GermanyAR-P. 679.04Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslipsIbidi, Germany10813substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron DopedGambetti Xenologia Srl, Italy30255
Propan-2-olCarlo Erba Reagents415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 resists developer
SU-8 3005Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0001Negative Photoresists
SU-8 3050Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0005Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%Carlo Erba Reagents410381reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDowsil, Dow Corning11-3184-01Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLsilanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litographyRaith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography systemEV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

Ссылки

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282(2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235(2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639(2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737(2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450(2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093(2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664(2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217(2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985(2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789(2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014(2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16(2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены