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要約

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin vitroおよび計算ツールを必要としています。2Dおよび3D設定での腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するためのプロトコルについて説明し、細胞機能の動的マルチパラメトリックモニタリングと互換性があります。

要約

複雑な疾患モデルには、生理学的および病理学的に関連する実用的な洞察を提供し、他の方法では目に見えないプロセスを明らかにすることができる最先端のツールが必要です。in vivoの風景を厳密に模倣した高度な細胞アッセイは、がんの進行に影響を与える双方向の腫瘍と宿主の相互作用を視覚化および測定するための新しい方法としての地位を確立しています。ここでは、自然および治療誘発性の免疫監視下で、腫瘍微小環境(TME)の複雑さを模倣して、マイクロデバイスで高度に制御可能な2Dおよび3D共培養を再現するための2つの汎用性の高いプロトコルについて説明します。セクション1では、明視野タイムラプス顕微鏡によって、接着性腫瘍細胞と浮遊免疫集団との間のクロストークを監視するための実験設定が提供されます。応用シナリオとして、免疫原性がん細胞死誘導剤などの抗がん治療が免疫細胞の動員と活性化に及ぼす影響を解析します。セクション2では、3D腫瘍免疫微小環境が競争力のあるレイアウトで組み立てられています。免疫浸潤の違いは、組み合わせ治療戦略を評価するために、最大72時間の蛍光スナップショットによって監視されます。両方の設定において、多数の免疫細胞パラメータ(例えば、免疫細胞の移動および相互作用、治療薬への応答)を抽出するための画像処理ステップが図示される。これらのシンプルで強力な方法は、がん、間質細胞、免疫細胞のサブタイプの不均一性と可塑性、およびがん進化のドライバーとしてのそれらの相互相互作用を含むTMEの複雑さをシミュレートするようにさらに調整できます。これらの急速に進化する技術を生細胞ハイコンテントイメージングに準拠させることは、大規模な有益なデータセットの生成につながり、新たな課題をもたらす可能性があります。実際、「共培養/顕微鏡/高度なデータ分析」という三角形は、オーダーメイドの治療プロトコルを支援する可能性のある正確な問題パラメータ化への道筋を設定します。将来的には、がん免疫オンチップと人工知能を統合してハイスループット処理を行うことで、精密でパーソナライズされた腫瘍学のための予測および前臨床ツールとしての能力を活用する上で大きな一歩が相乗効果を発揮できると期待しています。

概要

実験分野としての医学のさまざまな分野の進化は、制御された条件下で細胞集団と臓器機能を操作する能力に依存してきました1。そのような能力は、私たちの体で起こっているプロセスを再現できる測定可能なモデルの可用性にルーツがあります。

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代2において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するために、新しいin vitroおよび計算モデルを利用する必要があります2,3。

腫瘍微小環境4(TME)は、がん細胞が継続的に相互作用し、他の細胞(免疫細胞、間質細胞、内皮細胞)および非細胞(細胞外マトリックス、ECM)成分と動的に共進化する複雑な組織です。この複雑な状況の動的な性質は、免疫細胞が悪性細胞の味方または敵として果たすかどうかを決定し、したがって、疾患の進行と治療への反応の両方に強く影響します。今日、腫瘍免疫学者、バイオインフォマティシャン、およびシステム生物学の専門家による多大な努力が集まって、空間(すなわち、異なる腫瘍領域)および時間(すなわち、異なる腫瘍進行段階)5,6のいずれかにおける癌の不均一性の臨床的意義5,6に対処し、単一細胞レベルで癌および免疫細胞の表現型および機能を特徴付けるために収束しています。この相乗効果の一例として、高度なコンピュータビジョン技術が、組織学的試料における免疫浸潤物の空間マッピングのために現在日常的に使用されている7、8。

実験モデルの最前線では、動物実験と従来のin vitro法を橋渡しし、マイクロフルイディクスと共培養技術の進歩により、オルガノイド、マイクロ生理学的システム9,10,11(MPS)、臓器オンチップ12,13,14などのさまざまなクラスのマイクロエンジニアリング細胞モデルにアクセスできます。 (OOC)。彼らは、細胞生態系の「全体像」のビューを拡大し、ハイコンテント顕微鏡15と画像処理アプローチを活用しながら、微小環境要因を制御するin vitroの可能性を拡大するという共通の特徴を共有しています。

今日、最先端のMPSおよびOOCシステムは、炎症性疾患、創傷治癒、粘膜免疫、毒素や日常の食品への反応などのさまざまなプロセスを調査および測定するために、既存の組織および共培養に免疫細胞のさまざまなサブタイプを組み込む免疫学的側面を含み始めています16。TMEオンチップモデル10、11、12、13、14、15、16、17は、灌流性マイクロ血管18、19、20、21とも統合されており、細胞型依存性相互作用、物理的および化学的摂動、および細胞毒性活性を調べるために開発されました。浸潤リンパ球22、ならびに臨床的に関連する免疫調節剤23。

ここでは、チップへの細胞のロードから画像処理ツールに至るまで、2D(セクション1)および3D(セクション2)設定16での高度な腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するための汎用性の高いプロトコルを提供し、細胞機能の動的マルチパラメトリック24モニタリングおよび視覚化と互換性があります。これは、フィジーのフリーウェアソフトウェアとそのツールボックス25,26を利用して、サンプル管理とデータ分析の両方で使いやすさと柔軟性を維持しながら達成されます。

セクション1で説明したマイクロ流体デバイスは、付着性癌と浮遊免疫細胞の2D共培養を実行するように設計されています。このプラットフォームは、遺伝子変異27 および/または免疫不全28の存在下での免疫細胞の挙動のin vitro測定のために検証されました。ここでは、Trackmate(フィジーのソフトウェアに実装されているプラグイン)に基づく半自動方式を利用して、タイムラプス明視野画像で免疫細胞を追跡する手順を説明します。この手順は、免疫原性細胞死誘導因子 27 で処理されたか否かを標的とする癌細胞に対する免疫遊走29および応答(すなわち、相互作用時間)の運動学的記述子の抽出を可能にする。

重要なことに、時系列画像から抽出されたこれらのパラメータは、高度な数学機械で処理できます。このアプローチの可能性の例として、私たちのグループは最近、確率過程と統計力学からの数学的方法に基づく分析を発表し、細胞ネットワークの特性をモデル化し、免疫細胞の挙動のパラメータ化された説明を提供します(すなわち、偏ったまたは無相関のランダムウォーク、高度にまたは協調していない運動30,31)。

2番目のセクションで提供される3D設定は、共培養プロトコルに基づいており、細胞タイプと薬物の異なる組み合わせで2つのゲル領域に埋め込まれたより複雑な免疫適格TMEを競合的に再現します。ここでは、画像処理ステップは、異なる時点で、マトリゲル内で培養されたヒトA375Mメラノーマ細胞における染色免疫細胞の浸潤を測定し、抗腫瘍剤組合せ32を評価するために説明する。A375M株は、高度に転移性の表現型を特徴とするA375P由来細胞株であり、免疫細胞の存在下でのそれらの転移能を評価するために選択された32。

記載されたモデルは、異なる細胞源(マウスおよびヒト不死化または初代細胞株、オルガノイド、異種移植片など)に完全に準拠することができる。私たちの研究室の最近の研究では、ハイコンテントビデオ顕微鏡と画像分析を組み合わせることにより、競合する3Dレイアウトを適用して調査しました:i)抗腫瘍(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、ADCC)免疫応答と解剖HER2+ 乳がんオンチップモデル33;ii)腫瘍回避およびT細胞の動員のメカニズムにおける骨髄系細胞(すなわち、癌関連マクロファージ)の作用34;iii)コラーゲンマトリックス中の薬物処理された結腸癌細胞とともに培養されたインターフェロンα馴化樹状細胞(IFN-DC)に基づく免疫療法レジームの有効性、および効率的な運動とその後の食作用イベントを評価する35;iv)IL−33処置または未処置のメラノーマ細胞36に向かう骨髄由来好酸球の走化性遊走。

これらの高度なモデルは、がんの転移と耐性メカニズムにおける免疫コンテクスチャーの役割を理解するための観察ウィンドウとして役立つ可能性がありますが、調査結果を臨床に変換し、基礎研究とのギャップを埋めるための努力が必要です37。

新たなシナリオとして、自動化されたハイコンテント顕微鏡の力と、より生理学的に関連性のあるマイクロシステムの使用を組み合わせることで、1つの実験キャンペーンから生成できる数百、さらには数千ギガバイトのマルチパラメトリックデータの処理、処理、解釈に新たな潜在的な課題が生じています。これは、OOC実験と人工知能38,39,40,41,42(AI)ベースのアルゴリズムとの直接的なリンクを意味し、高度な自動分析と、癌と免疫の相互作用のインシリコモデルを順番にフィードできる機能の生成43、予測薬物スクリーニングアッセイの開発などのエキサイティングな新しいアプリケーション44。

拡大し続ける取り組みの流れは、疾患モデルの設計と、単一細胞マルチオミクス読み出しを備えた大規模な摂動スクリーンを実装するための戦略の最適化に焦点を当てています。これは間違いなく、免疫疾患と癌の播種メカニズムに関する新しい洞察を得るための体系的な腫瘍免疫学オンチップアプローチの開発と、できれば適切な程度の方法の標準化を伴う臨床実装に役立つでしょう。

プロトコル

1. 接着細胞と浮遊細胞の2D共培養のためのチップ設計

注:2D共培養レイアウト(図1A-C)は、2セットのマイクロチャネルアレイ(500 x 12 x 10 μm 3、L×W×H)によって相互接続された3つのチャンバー(高さ100 μm)によって特徴付けられます。中間チャンバーは、負荷ステップ2.5の間に腫瘍部位にオーバーフローする浮遊免疫細胞をブロックする2つの閉じた行き止まりコンパートメントを形成します。このデバイスタイプは、単一細胞(接着性または浮遊性のいずれか)の運動性、および細胞間相互作用のリアルタイム二次元測定に役立ちます16、27、28、30、31。典型的な細胞遊走研究(数時間から数日実施)は、取得した画像配列を数値的特徴に変換するために、生細胞顕微鏡と画像処理アルゴリズム45を組み合わせる25。遊走パターンに基づいて、細胞の変位および速度、ならびに免疫細胞および標的細胞相互作用の持続時間など、いくつかの生物物理学的指標を推定することができる24。

  1. がんおよびPBMC細胞の調製
    1. がん細胞培養
      注:MDA-MB-231トリプルネガティブ[エストロゲン受容体(ER)-、プロゲステロン受容体(PR)-、およびヒト上皮成長因子受容体2(HER2)-]ヒト乳房腺癌細胞は、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU mL-1ペニシリンGナトリウム塩および100 μg mL-1硫酸ストレプトマイシン(増殖培地)を添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で日常的に増殖されます。 標準培養条件下(37°Cおよび5%CO2)。
      1. 細胞培養増殖を最適化するために、MDA-MB-231細胞を12〜15mLの増殖培地中で1×10個の細胞mL-1の密度で75cm2フラスコにプレートする。
      2. 細胞がコンフルエントの75〜80%に達したら、増殖培地を廃棄し、予温したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄してFBSを完全に除去し、次に予温したトリプシンで剥離します(37°Cで1〜2分)。
      3. 増殖培地を添加してトリプシン酵素活性を不活性化し、剥離した細胞を回収します。室温(RT)で1,100 x gで5分間細胞を2回洗浄します。
      4. Trypan Blue色素排除試験によって細胞計数スライド内の細胞をカウントし、維持培養(解凍から6継代以内)または実験手順のためにそれらを再播種します。
      5. マイクロ流体実験では、3 mLの増殖培地中の6ウェルプレートに1×106細胞を播種し、コントロールとして25 μMドキソルビシン(DOXO)または等容量のFOXO溶媒(PBS)で処理します。
      6. 4〜6時間後、DOXO処理した細胞を予熱したPBSで2回洗浄し、RTで1,100 x gで5分間洗浄します。
      7. 上記のようにDOX処理およびPBS処理されたコントロール細胞をカウントし(ステップ1.1.1.5を参照)、マイクロ流体デバイス内の末梢血単核球(PBMC)との共培養を設定します。
    2. PBMC アイソレーション
      1. 健康なボランティアから静脈全血(約10 mL)をヘパリン化バイアルに集め、チューブを2〜4回反転させて穏やかに混ぜます47。
      2. 血液をPBSで1:1に希釈し、50 mLチューブに10 mLの密度勾配培地Lymphoprepを層状にします。
        注:血液とリンパ球が2つの異なる層を形成するように、非常に穏やかかつゆっくりと重ね合わせを行うようにしてください。
      3. ブレーキなしのスイングアウトバケットで4°Cで400 x gで30分間遠心チューブ。4つの異なる層が形成されます:(i)上部の血漿、(ii)PBMCを含む白くて曇った層、(iii)リンパ球、および(iv)赤血球と顆粒球のペレット。
      4. PBMCを2 mLピペットで穏やかに吸引し、すぐに温かい増殖培地(ステップ1.1.1で使用したもの)に再懸濁し、RTで1,100 x gで5分間2回洗浄します。
      5. 上記のようにペレットPBMCを数え(ステップ1.1.1.5を参照)、実験手順に使用するか、長期保存のために凍結します。
  2. 2Dチップでのセルのメッキ
    メモ: PBMC はこのプロトコルでは染色されません。オンチップで特定の表現型を特徴付けるために、免疫細胞サブポピュレーションを免疫磁気ビーズ選択によって単離し、蛍光細胞トラッカーで染色し、標識されていない残りの画分と再混合し、したがって標的癌細胞と対峙させることができる(オンチップ実験で報告されているように、Vacchelli et al.27およびRacioppi et al.34)。
    1. 共培養実験を開始する前に、試薬の添加を容易にするために、酸素プラズマ処理によって保存されたチップを数秒間活性化します。すぐにリザーバーに脱イオン水またはPBSを満たし、めっきステップまでPDMS(ポリジメチルシロキサン)表面の親水性を維持します。
      注意: PDMSは本質的に疎水性であるため、操作やマイクロチャネルへの気泡の閉じ込めが困難になる可能性があります。酸素プラズマの活性化に関する詳細を提供する補足ファイルのステップ7を参照してください。
    2. UVキャビネット下で20分間滅菌し、新鮮なPBSで2〜3回洗浄した後、培地で1時間インキュベートします。めっき工程を行うまでチップをインキュベーターに保管してください。
    3. 6つのリザーバーすべてから余分な培地を取り出します。メインの培養室から培地を吸い上げないように注意してください。
    4. 1〜20 μLの増殖培地に再懸濁した1×105個のがん細胞を左上のリザーバーにゆっくりと適用し、次に下のウェルに塗布します(図1A、リザーバー1および2)。細胞が腫瘍室に付着するまで5分間待ちます。いくつかの細胞は沈降し、貯水池に付着します。
      注意: チャネル開口部の横にセルラー懸濁液を挿入します。この手順はMDA-MB-231癌細胞に適用され、他の系統は細胞密度の最適化を必要とするであろう。癌細胞の付着を改善するために、表面のコーティング機能化(例えば、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン)を行うことができる。コーティングステップ16、48、49、50については、以前に公開されたプロトコルを参照してください。
    5. 右側で、1×10個の6 PBMCを50 μLの成長培地に再懸濁してウェル3および4に穏やかにピペッティングします(図1A、リザーバー3および4を参照)。
      注:流れた後、PBMCは中間チャンバーに分配し、実験の開始点を表す「フロント」を作成します。
    6. 6つのリザーバーすべてに最大100〜150 μLの成長培地を充填します。顕微鏡下で、図1D-Eに示すように、細胞が培養コンパートメントに正しく分布していることを確認します。最終的な容量は、貯水池のサイズによって異なります。すべてのウェルで等しくなるように容量を調整します。
    7. チップをインキュベーターに約1時間戻し、タイムラプス記録の前にシステムを安定させます。蒸発損失を受ける可能性があるため、3日ごとに新しい培地を追加します。
      注:このシステムは、生細胞/死細胞分析と、馴化培地からの動的マルチプレックスサイトカイン分泌プロファイリングの両方と互換性があります。ケモカイン分析の場合、各コンパートメントの2つのリザーバーから培地を収集することにより、最大200〜250 μLの上清アリコートにアクセスできます。従来のELISAおよびLuminexサイトカインプロファイリングアッセイでは、約50 μLの上清が必要です。OOCモデルでサイトカインプロファイリングを実施している他の研究室の研究の51,52の例をご覧ください。
  3. 非標識がんおよび免疫細胞のタイムラプス取得
    注:通常、3つのチップが1つの顕微鏡スライドに配置されます(2Dチップについては図1A、3Dチップについては図4Bを参照)。4枚のスライドを割り当てるステージホルダーを使用して、共培養は、実験条件の大規模なバッチを分析するために自動化されたハイコンテント顕微鏡法によるモニタリングに適しています。チップは、厚さ1mmまたは170ミクロンのスライド(プラスチックまたはガラスカバースリップ、6ウェル光学底部マルチウェル)に簡単に取り付けることができ、高解像度の共焦点イメージングが可能です。
    1. インキュベーションシステムを備えたビデオ顕微鏡セットアップを使用して、ラベルのない細胞の明視野画像シリーズを記録します。
      注:ここでは、時系列データセット(時間枠:48時間、フレームレート:2分)を、標準的な細胞培養インキュベーターに収まるように最適化された4倍の対物レンズとCMOS 1.3Mピクセルを備えた蛍光顕微鏡で取得しました。
    2. 顕微鏡を少なくとも2時間温めて、37°Cと5%CO2に平衡化してから取得を開始します。
    3. 腫瘍と中央コンパートメントの間のマイクロチャネルアレイを中央に配置することにより、観察ウィンドウを選択します。これにより、免疫浸潤の動態やがん細胞が播種される領域内の相互作用を可視化することができます。
    4. がんや免疫細胞の照度と焦点を調整します。
    5. タイムラプス取得を開始するには、実験と研究中の細胞タイプに応じてフレームレートと時間を最適化します。
      注意: 良好な信号対雑音比(SNR)を維持しながら、過度の露光を避けるために、イメージング条件を最適化する必要があります。免疫細胞は非常に運動性であるため、獲得フレームレートは、対象の動的プロセスに従い、容易な追跡を可能にするのに十分高い必要がある53。追跡アルゴリズム、結果のデータセットのサイズとの互換性、および観察された細胞の生存率、密度、および運動性の間で妥協点に達する必要があります。
    6. タイムラプスの最後に、ImageJソフトウェアの[画像シーケンスのインポート]と[名前を付けて保存]機能を使用して、フレームデータセットを25fpsの非圧縮ビデオファイルに変換します。
      注:生成されたビデオファイルは、セルトラッキング分析の準備が整いました。ここでは、RGB(1280x1024ピクセル)画像を1.33μm/ピクセルの空間分解能で収集しました。単一視野 (FOV) の 24 時間のムービー (3.5 GB スタック) は、条件ごとに 720 フレームで構成されます。
  4. データ解析:トラックメイトによる非標識免疫トラックの半自動抽出
    注:ここでは、TrackMateを使用して、2Dラベルなしタイムラプス画像の免疫運動分析が実行されます54、フィジー/ImageJソフトウェアバンドル(https://imagej.nih.gov/ij/)で利用可能なオープンソースツールボックス。自動化された単一粒子追跡を実行するために、いくつかのアルゴリズムが提供されています55(SPT)斑点状構造の。これらは、SNRの高い暗い背景(すなわち、サブ解像度蛍光スポット、標識された交通小胞、核)で物体が明るい蛍光画像に効率的に適用されています。1,25,56,57,58.SPTは主に2つの連続したステップに基づいています。まず、オブジェクトは、図式化されているように、複数のフレームで識別された位置(セグメンテーション)でローカライズされます。図 2.第2段階(パーティクルリンク)では、検出されたスポットが連続したフレームにわたってリンクされ、動きを推定し、トラックの形状でそれらの軌道を再構築します(図 3).数値特徴は、抽出された各 X、Y、Z 座標配列から経時的に計算できます。拡張ドキュメントは、54オンライン(http://imagej.net/TrackMate)と同様に、TrackMate入門チュートリアルに従います。プロセスの精度を即座に検査でき、直感的なグラフィカルユーザーインターフェイス(ウィザードのようなGUI)を使用して、ユーザーはすべてのステップで設定を再調整できます。次のパートでは、Trackmateを使用して、可視光画像に適用される画像処理と定量化の手順を簡単に説明します。
    1. フルタイムのビデオ/画像スタックをフィジーツールバーにドラッグアンドドロップします。
    2. キャリブレーションスタックのセットアップ(図2A)。
      1. 次元を確認し、[画像] > [プロパティ] を選択して画像のプロパティを割り当てます。[長さの塗りつぶし単位]、[ピクセルサイズ]、[フレーム間隔] ボックス。
        注意: キャリブレーションを実行するには、マイクロチャンネルの既知の長さ(500 μm、図1C)を使用し、対応する測定された長さ(ピクセル単位)で除算します。2D 時系列の場合は、Z スライスとして 1 を入力する Z/T フィールドと正しいムービー フレーム数を入れ替えてください。達成されない場合、トラックメイトの定量的出力とパラメーターはピクセル単位と時間枠で報告されます。
    3. 画像の前処理。
      1. ノイズの多い背景からの免疫細胞の正しい識別を強化するには、明視野画像を前処理してアーチファクトを補正します。データセットが 8 ビット TIFF 画像 (明るさの範囲: 0 から 255) で構成されていることを確認します。
        注:不均一な照明、低いSNR、および可視光画像の小さな破片粒子による汚染は、細胞追跡プロセスの成功を損なう可能性があります。ここでは、時系列データセットは、背景減算、明るさ/コントラスト調整機能、および元の画像からのガウスぼかしのローカル画像減算によって前処理されます。ImageJには、経験的勾配閾値(EGT)59など、位相差画像または明視野画像の処理とセグメンテーションのために利用できる他のさまざまな解析ツールキットがあります。
    4. 最初のキャリブレーションパネル(図2A)
      1. 画像スタックを選択した状態で、トラックメイト(プラグイン>トラッキング)を起動します。 データの次元と時間ウィンドウ(ピクセル幅とフレーム間隔など)を修正/確認します。
        注意: TrackMateは、画像のプロパティボックスを自動的に読み取り、キャリブレーションされた物理単位(つまり、μmと分)で最終的な追跡結果を提供します。
      2. 免疫トラックの抽出を計算するための関心領域を定義するには、手動で値を挿入するか、アクティブな画像の上に閉じた領域を描画し、[ソースの更新]ボタンを押します。全体的な免疫移動経路を抽出するには、マイクロチャネルの右側(中央チャンバー、図1E)と左側(腫瘍チャンバー、図1D)の長方形領域をそれぞれ選択します。がんと免疫ホットスポットの相互作用を分析するには、ROI ツールを使用して円形のサブ領域を描画します (「選択→編集」→「指定」に移動します)。
        注:このツールボックスを新しい生物学的アプリケーションで初めて実行する場合は、トラックを再構築するための設定を最適化するために必要な時間を費やしてください。
        注:セル軌道(約50〜100セル)を手動で追跡して、経験的に適切な構成を見つけ、次にベンチマークとして動きの自動抽出の信頼性を検証します。さらに、選択したパラメータの精度を簡単に確認できるように、最初はより小さな領域で作業します。
    5. 免疫スポット検出ステップ(図2B)
      1. デフォルトのラプラシアンガウス(LoG)検出器を選択します。LoG検出器は、明るくブロブのような丸みを帯びたオブジェクトを見つけ、中間スポットサイズ(直径5〜20ピクセル)に調整された画像にガウスのラプラシアンフィルターを適用するように機能します。
      2. 推定ブロブ直径(ここでは10〜13 μm)に、予想されるスポットサイズよりわずかに大きい値を入力します。しきい値(ここでは1〜3μm)の値を、オブジェクトの特徴を削除せずに余分なスプリアスバックグラウンドスポットが減少するまで増やします。(品質指標に基づく) しきい値を下回る検出は、後続の分析から破棄されます。メディアンフィルターとサブピクセルローカリゼーションのチェックボックスをオンにして、スポット検出の品質を向上させます。
      3. プレビューボタンを使用すると、画像上にマゼンタ色の円を重ねた同定された免疫細胞を表示してすばやく検査できます。
        注意: 検出中の間違いは、リンクプロセスに大きな影響を与えます。その他の不要な検出は、ユーザー定義のフィルター(つまり、スポット強度、サイズ、または位置)によって後続のメニューで修正できます。
    6. 選択に満足したら、[次へ]をクリックします。
      注:これらの設定は、実験のセットアップと取得イメージングモダリティ(FOV、対物倍率、明視野または蛍光画像など)、細胞タイプ(接着細胞または浮遊細胞)、遅い運動性または速い運動性、細胞挙動の種類(相互作用するかどうか)、および観察領域の低/中/高密度。
    7. 続行し、初期しきい値メニューをスキップします。[ハイパースタック ディスプレイ] ウィンドウを選択します。
    8. スポットパネルにフィルターを設定します(図2C)。
      1. 選択:均一な色。図2Cに示すように、フィルタを追加して、可逆閾値を上回ったり下回ったりするヒストグラムで表示される特徴値を持つラベル付きスポットを保持することができます。
    9. トラッカー選択段階(図3A)。入力する3つのフィールドを要求するパーティクルリンクアルゴリズムとして、Simple LAPトラッカーを選択します(この場合、「リンク最大距離」:30〜50 μm、「ギャップを閉じる最大距離」:25〜50 μm、「ギャップを閉じる最大フレームギャップ」:4〜6)。この検出器は、ギャップを閉じるイベントを管理し、それぞれの距離のみに基づいてコストリンクを計算します。
      注:最大許容リンク距離は、2つの後続のフレーム間を移動する最大許容変位に対応して、一致する候補スポットの空間検索範囲を制限します(図3D)。
      1. 運動性の高い粒子のトラックの断片化に気付いたときに、最大変位の値を大きくします。
        注意: フレーム間の移動が指定された最大距離値よりも大きい場合、2つのリンクは接続されません。セグメントが 2 つの異なるセルをうまく橋渡ししない場合は、最大変位の値を小さくします。
      2. 「ギャップを閉じるための最大距離」と「最大フレームギャップ」の値を変えて、欠落しているスポットを再接続してみてください。
        注: これらのパラメータは、隣接していないフレームのギャップ クロージング イベントを処理します。スポット消失は、一部のフレーム(すなわち、焦点の合っていない粒子、FOV内の細胞が流出し、ノイズの多い画像でのセグメンテーションの失敗)で発生する可能性があります。
        注:イベントの分割またはマージを処理するには、リンクコストマトリックスペナルティを導入する検出器としてLAPリンカを選択します。
    10. [次へ] をクリックして、トラッキング計算を実行します。[次へ] を押します。
    11. フィルタリングトラックパネル(図3B)。ドロップダウンメニューから「トラックID」またはその他のトラック機能を選択して、免疫経路の色を変更します。この時点で、オプションで対話型フィルターを機能するように設定し、結果の品質を向上させ、手順を再検討することを選択します。
      注:スプリアススポットは、画像内のノイズとフィーチャ品質の低下から発生します。これにより、短いセグメントが生成されますが、関心のあるセルを多くのフレームで追跡できます。
      1. 短いパスを削除するには、パスに含まれるスポットの数に基づいて除外してみてください。さらに、トラックの変位、トラックの継続時間、最小/平均/最大速度などのオプションの組み合わせを使用してトラックを並べ替え、誤ったトラックや不要なトラック(タイムラプスの全体的な継続時間に対してフレームが少ない、または汚れたパーティクルや移動していないパーティクルを含む)を以降の後処理から除外します。
        注:フィルターの選択は、特定のアプリケーションと生物学的システムによって異なります。
    12. [表示オプション] インターフェイスですべてのトラックを調べ、時間をスクロールして、トラックがセル移動パスとどの程度一致するかを確認します。ドロップダウンメニューには、スポットとパスのカラーコードが表示され、いくつかのモダリティ(運動パラメータ、強度、時間的または空間的位置など)による視覚化とフィルタリングを簡単に行うことができます。
      注:高密度培養または高運動細胞を追跡するには、取得フレームレートを上げて、連続した時間間隔で移動する細胞の変位を最小限に抑えます。
    13. セグメンテーションとリンクの間違いを手動で修正します(図3E)。
      1. 結果の品質をさらに高めるには、手動でスポット(破片粒子、静止細胞)を編集し、腫瘍と免疫の相互作用のROIを分析するときに、検出された腫瘍境界に由来する誤ったトラックを削除します。
      2. まず、ImageJツールバーでトラックメイトツールを選択します。スタック全体の既存のスポットを削除するには、Shiftキーを押しながらマウスカーソルでターゲットスポットの上にROIマスクを作成し(緑色の円で編集)、DELキーを押します。
      3. 新しいスポットを追加するには(スポットが消えたためにトラックが欠落している場合)、Aキーを押して、ポイントされた場所にマウスを置きます。このステップの後、トラックリンク計算プロセスを繰り返します。
    14. 問題がなければ、[表示オプション]パネルの[解析]を選択して、3つのテキストファイルを生成します(図3Cおよび3F)。「トラック内のスポット統計」の表は、免疫スポットの時空間座標(関連するフレームとトラック番号でラベル付けされた細胞のX-Y-Z位置)を提供します。「トラック統計内のリンク」と「トラック統計」には、トラックに関連する情報(トラックの継続時間、検出されたギャップまたはスポットの数、トラックの初期フレームとストップフレームなど)が含まれます。データセットごとに保存してエクスポートします。
      注:結果表示ウィンドウ内の行をクリックすると、タイムラプスビデオ内でそれぞれのスポット、リンク、またはトラックがアクティブになり、目視検査が行われます。フィルタリング手順を繰り返して、トラックを選択/削除します。今後エクスポートされるすべてのデータが更新されます。ヒント:トラックの初期フレームとストップフレームの値、およびトラック期間の値を利用して、相互作用のROIを処理するときにがんと免疫細胞の間の接触時間を計算することができます。
    15. [保存] ボタンを押すと、すべてのパラメーター値、画像へのパス、および時間内のスポット位置を含む結果の XML ファイルが生成されます。''TrackMate ファイルをロード'' コマンド (プラグイン> トラッキング) は、各ムービーファイルのプロセスセッション全体を個別に復元します。
    16. GUIの最後のパネル「アクションの選択」に移動します。リストで、オーバーレイ>実行機能を使用して、トラックがオーバーレイされたビデオを作成します。ヒント:「Nスポット対時間プロット」オプションを使用して、ROIにおける免疫細胞の空間密度を計算できます(図6B、右パネル)。
    17. 後処理分析と移行統計
      1. 生の位置データをトラックメイトで直接分析するか、またはデータをエクスポートして、包括的な運動パラメータ29(すなわち、総軌道長、ユークリッド距離、閉じ込め比、平均二乗変位56、平均または瞬間トラック速度、停止係数、移動角の分布、前方移動指数、平均直線速度)を計算して、免疫細胞遊走挙動(例えば、指向性または拡散運動30、31)および標的癌細胞に対する応答(例えば、治療対対照)。
        注:走化性および移行ツール(http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/)などの追加の便利なプラグインは、さまざまなグラフ(図6に示されているようなローズプロットまたはセクタープロットなど)と、実験的な移動および走化性データの高度な分析と視覚化のための統計テストを提供します。細胞追跡および細胞セグメンテーションアルゴリズム24、25、45を組み合わせることで、単一細胞レベルでの形態学的測定基準(すなわち、細胞表面積、長軸および短軸の長さ、ならびに細胞アスペクト比)の測定が可能になり得る。

2. 競合アッセイにおける3D免疫コンピテントがんオンチップモデル

注:図4に示す 3Dチップの設計は、浮遊免疫細胞摂取用の中央コンパートメント、ヒドロゲルマトリックス(高さ150〜250μm)に腫瘍細胞を埋め込むための2つのサイド領域、および培地灌流チャンバーの5つの主要なコンパートメントで構成されています。免疫室および腫瘍室は、2組の狭いアレイのマイクロチャネル(200×12×10μm3、L×W×H、図4E)によって接続されている。規則的に100μm間隔の台形二等辺三角形のマイクロピラー(各側ゲル領域に約25〜30の界面、図4C)は、表面張力と毛細管力のバランスを利用して、注入中にゲル溶液を閉じ込めるための障壁として機能し60,61、腫瘍領域を2つの横方向の追加媒体チャンバーに接続してゲル-液体界面を設定します(図5)。3D競合アッセイの詳細な特徴を図4に示します。異なる治療を受けた腫瘍細胞をホストする2つのヒドロゲル区画への免疫細胞の優先的移動をモニターおよび定量化することができる。特定の競合レイアウトは、多数の異なるがん生物学表現型(例えば、薬剤耐性対攻撃性、原発性または転移性、レスポンダー対非レスポンダー)を調査するために適用することができる。さらに、ゲル包埋領域は、異なる細胞集団と容易に統合して、間質成分(線維芽細胞、内皮細胞)23を含むより不均一なTMEを再現したり、薬剤耐性および腫瘍回避のメカニズムを解剖するための特異的免疫抑制環境34(マクロファージなど)をシミュレートしたりすることができます。
注:Nguyenらで報告されているように、核および活性カスパーゼ染色は、生/死アッセイ用の市販キット(サーモフィッシャーサイエンティフィック、Incucyte試薬など)を使用して実施できます。

  1. 細胞を含むマトリックス溶液の調製とデバイスへのローディング
    注:次の実験設定では、2つのゲル領域には、マトリックス溶液(マトリゲルなど)で増殖し、単剤療法または組み合わせて使用される治療薬にさらされたヒトA375Mメラノーマ細胞株の混合物が含まれています。この設定により、単一の薬剤に対する2つの薬剤の組み合わせの有効性を競争力のある方法で評価し、PBMCを引き付ける能力を定量化することができました。
    1. 実験の1日前に、氷上に4°Cの冷蔵庫に入れて、マトリックス溶液(マトリゲルなど)のストックを解凍します。
      注意: 製品は「塊状」になるため、製品を複数の凍結解凍サイクルにさらさないでください。他の合成または天然ヒドロゲルのプロトコルは、この設定において使用するのに適し得る。コラーゲンマトリックス中の癌細胞の調製については、33,34,35を参照してください。
    2. A375ヒト黒色腫細胞を、生態性PKH67緑色蛍光細胞リンカーでマトリックス溶液(2 mg mL-1)に再懸濁します。指示がある場合は、DACと呼ばれる5-アザ-2'-デオキシシチジン(DAC;2.5 μM)、および/またはIFNと呼ばれるIFN-α2bを適切な用量で追加します32。
      注意: マトリックスボトルのスペックシートのロット#と一致します。濃度に基づいて、最大2 mg mL-1を作るのに必要な培地の量を計算します 目的の用途に応じて、最適なタンパク質濃度と癌細胞懸濁液濃度を調整してください。
    3. 気泡の発生を避けるために慎重に上下にピペットします。不要な重合を防ぐために、混合中は微量遠心チューブを氷上に置いてください。
    4. 滅菌後、セルローディングの全手順中にマトリックス溶液が固化するのを防ぐために、デバイスを氷上に置きます(アイスバケットと蓋を使用)。
    5. 2つのIFNおよびDAC/IFNマトリゲル/腫瘍細胞混合物(2〜4 μL)を、コールドチップを使用してそれぞれ10 μLのマイクロピペットで左右のゲルポートにゆっくりと注入します(図5A)。穏やかな圧力を加えて、マトリックス溶液を反対側に達するまで一方の側から押します。
      注:マトリックス溶液の体積は、隣接するチャネルにオーバーフローしないように選択されました。溶液が媒体や中央チャネルに漏れるのを防ぐために、過度のピペッティング圧力をかけないでください。ローディング中にゲル経路がチャネルに沿ってブロックされている場合は、ゲルの前面が出会うまで、もう一方の入口から溶液を挿入してみてください。マイクロピペットを入口から取り外すときは、プランジャーを握ってください、そうでなければ負圧がマトリックス溶液を吸引します。
    6. 装置を37°Cの直立位置のインキュベーターに置き、5%CO2を30分間使用して、マトリックス溶液のゲル化を起こさせます(図5B)。未重合ゲルが埋め込まれたケアチップで取り扱い、ゲルチャネルからの漏れを防ぎます。
    7. それまでの間、PKH67標識PBMC(1x106細胞)を10 μLの完全DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)に再懸濁します。
    8. マトリックスゲル化後、チップ内のゲル乾燥を防ぐために、6つのリザーバーすべてに培地チャネルに同じアリコートの培地(50-100 μL)を満たします。免疫細胞懸濁液が播種されるまでインキュベーターに保管してください。
      注:顕微鏡で、ゲル内の腫瘍細胞の正確で均質な分布と重合ゲルバリアの完全性を確認します。混合物中の部分的または均一ではないゲル化領域または気泡は、圧力初期変動のために、実験の開始点でゲル媒体チャネルにおけるPBMCの早期流動をもたらす。
    9. 6つのウェルから培地を吸引し、先端を培地チャネルの入口付近に配置して、中程度の圧力のPBMC細胞懸濁液を穏やかに注入します。読み込み時間シーケンスを図 5C に示します。
      1. PBMCを10 μL培地で上部中央ウェルに入れます。
      2. 50〜100μLの培地を横方向チャネルの4つのウェルのそれぞれに入れる。
      3. 上部中央ウェルに40〜90μLの培地を入れます。
      4. 50〜100μLの培地を下部中央ウェルに入れます。
    10. 顕微鏡下で、ローディングステップ後、PBMCの分布が中央チャンバーに閉じ込められたままであることを確認します。(図7A)。
      注意: 最適でない場合は、必要に応じて濃度を調整し、手付かずのチップを使用して播種手順を繰り返します。計画された実験条件の体積を計算するときは、潜在的なエラーと調整を考慮して、過剰なチップ数(15〜20%)を参照してください。容量と濃度は、特定の用途に応じて最適化する必要があります。
    11. 組み立てたデバイスをインキュベーター内の平らな面に37°C、5%CO2で置き、その後の蛍光イメージング取得を行います。浮遊している免疫細胞をロードした後、ケアチップで取り扱ってください。
      注意: 2〜3日ごとにメディアを交換することにより、リザーバー内のボリュームの蒸発損失を補います。ケモカインプロファイリングでは、培養コンパートメントの2つのウェルのそれぞれから最大100 μLを吸引できます(ステップ1のステップ2.7を参照してください)。
  2. ImageJのシングルチャンネル蛍光画像中のリクルートされたPBMCの自動カウント
    注:共焦点高解像度イメージングのための免疫蛍光の古典的な方法は、エンドポイント測定としてオンチップ操作に適用できます。基本的な染色手順には、細胞オンチップ固定、透過処理、ブロッキング、抗体結合、核の染色が含まれ、その間に洗浄ステップがあります。がん微小環境が埋め込まれた3Dゲル領域に浸潤した非標識免疫細胞は、所望の時点で固定し、活性化/枯渇/成熟の発現マーカーについて染色することができます(例:CD8細胞の場合、CD69、CD95、PD1、TIM3マーカーのモニタリング)。パルラートらで。35、SW620アポトーシス細胞の食作用は、厚さ170μmのカバーガラスに取り付けられたデバイスを使用して、共焦点顕微鏡によって評価されました。IFN-DCは、オンチップの抗ヒトHLA-DR-FITC Abアリコートを加えて染色した。
    競合シグナルに挑戦した浸潤蛍光染色された生きた免疫細胞の程度を計算するために、一般的な画像解析ワークフローを次のように設定します(図 7D-G):
    1. 腫瘍細胞を含む左右のゲル領域を、それぞれ単一または薬理学的レジームの組み合わせに曝露した左右のゲル領域の特定の時間エンドポイント、位相差、および赤/緑チャネルの蛍光顕微鏡写真を取得します。
      注:ここでは、細胞ローディング後(0時間)、48時間後、およびインキュベーション72時間後にEVOS-FL蛍光顕微鏡で画像を取得しました(図7A-B)。4倍から10倍の倍率を使用して、中央チャンバー、マイクロチャネルアレイ、およびA375とIFNとA375とDAC / IFNを含む2つの並置されたサイドチャネルを取得しました。
      1. 取得操作を実行するときは、カウントするフィーチャの飽和を測定して回避するためのパラメータを考慮してください。最適なセグメンテーションの結果は、生物学的サンプル自体のばらつき、染色の品質、およびユーザー指向のアプリケーションに使用される顕微鏡技術により、取得した画像の性質によって異なります。
    2. 蛍光シングルチャンネルデータ(この場合は赤=PBMC)をメインウィンドウにドラッグしてフィジーにロードします(図7D)。最終セグメンテーションまでの前処理フィルターの選択中に生データが上書きされないように、画像を複製します。
      1. 画像がカラー画像(RGB)の場合は、画像>タイプ8または16ビットを押してグレースケールに変換します。[ 変換> > オプションの編集]が変換時に拡大縮小に設定されていることを確認します。
    3. ノイズやアーティファクトのクリーンアップによる生データの前処理。
      1. ローリングボールアルゴリズムを適用して、[バックグラウンド>減算]メニューに移動し、強度の空間的変化が大きい不均一なノイズバックグラウンドを修正します。半径を少なくとも最大の前景パーティクルのサイズに設定します。最適な結果を得るための試行錯誤の手順のプレビューボックスを選択します。値が小さすぎると、目的の構造体が誤って削除される可能性があります。
      2. [明るさとコントラスト] コマンドで、[最小/最大] スライダーをドラッグして、ヒストグラムの強度の範囲を変更します。[最大] スライダーを左にシフトして、ウォッシュアウト機能なしで明るさを上げます。[最小] スライドを右に移動すると、画像のコントラストが上がり、背景の目立たないフィーチャが消えなくなります。[適用] をクリックして変更を修正します。
    4. 画像強調。
      1. >フィルターの処理に移動し、画像の中央値、ガウスフィルターを試してください(図7E)。
        注意: 事前フィルタリング半径は、画像のノイズピクセルに適合させる必要があります。非線形メディアンフィルターは、ピクセル値を隣接の中央値に置き換えて、塩コショウのノイズを低減します。「ガウスぼかし」は、ピクセルを周囲のピクセルの加重平均に置き換えることにより、デジタル画像を滑らかにするために使用されます。重みはガウス確率分布から取得されるため、最も近いピクセルがより影響力があります。
      2. 必要に応じて、[>数学>ガンマをオンにしたプレビューボックスで処理]に移動して、コントラストを上げます。
        注:B&Cパネルで設定された強度は、2つの最小制限と最大制限の間でスケーリングされます。値 < 1.0 は低強度間の違いを強調し、値 > 1.0 は高強度間の違いを強調します。ガンマ補正は、表示範囲を見つけるために機能し、最も明るいオブジェクトを飽和させることなく、最も暗いオブジェクトを表示します。
    5. バイナリイメージマスクの作成。
      1. 画像に移動し>>しきい値を調整します。閾値を決定するために最も簡単に採用される方法は、図7Fに示すように、強度レベルのヒストグラム分析に依存しています。ドロップダウンメニューで、さまざまなグローバルしきい値処理方法を試します(この場合、Otsuが適用されます)。
      2. 手動でスクロールするか、ヒストグラムパネルに既知の範囲のピクセル強度を入力し、実際のセル領域にほとんど似ている画像にオーバーレイする赤いパターンの変化を観察します。[リセット] ボタンをクリックすると、オーバーレイが削除されます。問題がなければ、[適用] をクリックしてイメージのバイナリ バージョンを生成します。[バイナリ>>処理オプション]をオンにして、しきい値画像の表示方法とパーティクルアナライザによるオブジェクトの識別方法を制御します。
    6. メニュー コマンドの[プロセス/バイナリ/集水域パーティクル]を使用して、しきい値中に部分的に重なり合っている、またはマージされているものを分割します。集水域では、多くの場合、1 ピクセルの太い線を追加することで、それらを正確に分割できます。拡張操作や侵食操作などの形態学的操作を実行して、飽和不足または過飽和のピクセルからピクセルを拡大または削除します。
      注: 詳細については、「メニュー コマンド」セクションを参照するか、バイナリ データを処理するための数学的形態に基づく統合ライブラリである MorphoLibJ を参照してください。
    7. 定量的な画像機能の説明。
      1. 満足のいく物体認識が得られたら、[分析]>[粒子の分析]から粒子分析ツールを開きます。粒子は、ピクセルまたはキャリブレーションされた測定単位で表すサイズと円形度によって除外できます(画像>のプロパティで顕微鏡設定に対する正しいスケールを確認してください)。すべてを含めるには、既定値の 0-無限大と真円度の既定の範囲を 0.00 から 1.00 (0 = 直線、1 = 完全な円) のままにします。
      2. 小さな「ノイズ」ピクセルまたは関心のないフィーチャをフィルタリングするには、最小範囲と最大範囲を設定します。ウィンドウフィールドに穴を含める、表示、アウトライン、および結果を表示するオプションにチェックマークを付けます。[エッジで除外]は、画像の境界で検出されたパーティクルを破棄します。[マネージャに追加]は、取得した選択範囲をROIマネージャに追加し、パーティクルの位置情報を保持したままさらに解析します。
        注:「ROIマネージャー」では、自動セグメンテーションの記録出力を修正することができます(分割セルのマージ、マージされたセルの分割)。フィジーツールバーの選択ツールを使用して、がん細胞が埋め込まれている両方のゲル領域内のROIを選択し、免疫浸潤を推定します。
    8. 取得した値をスプレッドシートにエクスポートして、図7Gに示すように統計分析を実行します。「結果」は、識別された番号付き概説粒子特性に関連するデータテーブルをリストする。「要約」は、画像の名前、合計数、および画像全体のその他の情報を含むウィンドウを開きます。
      1. [測定値の分析>セット]に移動して、さまざまなパラメータを含めます。
    9. オプションでマクロを記録し(プラグイン>マクロ>記録を選択)、処理ワークフローを自動化し、大規模なデータセットの分析時間を節約します。
      1. 同じ処理ルーチンを使用して同じ領域の緑色蛍光チャネルを分析し、3D領域の腫瘍細胞の形態学的変化を解析する16

結果

腫瘍免疫浸潤は、宿主抗腫瘍応答のパラメータである。腫瘍は、浸潤白血球の組成、密度、位置、および機能状態において不均一であり、癌細胞との相互作用は、疾患の経過および治療への反応を予測するための臨床的関連情報の根底にある可能性があります。この意味で、マイクロ流体技術は、腫瘍の免疫コンテクスチャーを探索し、抗がん療法に対する反応を監視するための補完的で特?...

ディスカッション

記載された方法は、より関連性の高いin vitroモデルの採用から利益を得ることができる腫瘍免疫学の分野における2つの重要な側面を、調節可能な程度の複雑さで再現するための一般的なアプローチを設計しようとする。1つ目は腫瘍細胞集団側に関するもので、単一細胞の特徴に取り組むことで、治療に対する耐性、転移に対するプロペンション、幹細胞、分化グレードなど、不均一性と相関...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。ASは、イタリア・スル・カンクロ財団(AIRC、スタートアップ2016 #18418)とイタリアン・デッラ・サルーテ大臣(RF_GR-2013-02357273)によってサポートされています。GSとFMは、イタリア癌研究協会(AIRC)番号21366からGSによってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture materials 
50 mL tubesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-hypomethylating agent
6-well platesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506culture dishes
75 cm2 cell culture treated flaskCorning, New York, NY430641Uculture flasks
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochlorideMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0728LCulture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o MagnesiumEuroClone Spa, Milan, ItalyECB4004Lsaline buffer solution
Fetal Bovine SerumEuroClone Spa, Milan, ItalyECS0180Lancillary for cell culture
FicollGE-Heathcare17-1440-02separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometerNeubauerCell counter
Heparinized vialsThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAVials for venous blood collection
interferon alpha-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595recombinant human cytokine
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milan, ItalyECB3000Dancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation mediaCedarlane Labs, Burlington, CanadaSeparation of lymphocytes by density gradient centrifugation
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
MatrigelCorning, New York, NY354230growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA HTB-26human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X  EuroClone Spa, Milan, ItalyECB3001Dancillary for cell culture
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLred fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgreen fluorescent cell dye
RPMI-1640EuroClone Spa, Milan, ItalyECM2001LCulture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solutionThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061cell stain to assess cell viability
TrypsinEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0920Ddissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscopeThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Steril VBH 72 MPLaminar flow hood
Optical microscopeZeiss
Refrigerable centrifugeBeckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)Sigma AldrichA3648silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ MB W&A,  Germanyoptical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)Ibidi, Germany10812
Hydrogen Peroxide solution 30%Carlo Erba Reagents412081reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketoneCarlo Erba Reagents461945PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm Sail Brand7101substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mmTedpelladermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDaAllresist,GermanyAR-P. 679.04Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslipsIbidi, Germany10813substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron DopedGambetti Xenologia Srl, Italy30255
Propan-2-olCarlo Erba Reagents415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 resists developer
SU-8 3005Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0001Negative Photoresists
SU-8 3050Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0005Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%Carlo Erba Reagents410381reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDowsil, Dow Corning11-3184-01Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLsilanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litographyRaith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography systemEV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

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