JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

Abstract

מודלים מורכבים של מחלות דורשים כלים חדשניים המסוגלים לספק תובנות פיזיולוגיות ופתולוגיות רלוונטיות וניתנות לפעולה, ולחשוף תהליכים בלתי נראים אחרת. מבחני תאים מתקדמים המחקים באופן הדוק את נוף in vivo מבססים את עצמם כדרכים חדשות לדמיין ולמדוד את יחסי הגומלין הדו-כיווניים בין הגידול למארח המשפיעים על התקדמות הסרטן. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים רב-תכליתיים ליצירת תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות הניתנות לשליטה גבוהה במיקרו-מכשירים, המחקים את המורכבות של מיקרו-סביבה גידולית (TME), תחת מעקב חיסוני טבעי ומונע טיפול. בחלק 1, ניתנת הגדרה ניסיונית לניטור crosstalk בין תאי גידול דבקים לבין אוכלוסיות חיסוניות צפות, על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר בהילוך מהיר. כתרחיש אפליקטיבי, אנו מנתחים את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים, כגון מה שמכונה גורמים אימונוגניים למוות של תאי סרטן על גיוס והפעלה של תאים חיסוניים. בסעיף 2, מיקרו-סביבות תלת-ממדיות של גידולים חיסוניים מורכבים בפריסה תחרותית. חדירה חיסונית דיפרנציאלית מנוטרת על ידי תמונות פלואורסצנטיות עד 72 שעות, כדי להעריך אסטרטגיות טיפוליות משולבות. בשתי ההגדרות, שלבי עיבוד תמונה מתוארים כדי לחלץ שפע של פרמטרים של תאי מערכת החיסון (למשל, נדידת תאי מערכת החיסון ואינטראקציה, תגובה לחומרים טיפוליים). שיטות פשוטות וחזקות אלה יכולות להיות מותאמות עוד יותר כדי לדמות את המורכבות של TME המקיפה את ההטרוגניות והפלסטיות של תת-סוגים של תאי סרטן, סטרומה ותאי חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין שלהם כמניעים של אבולוציה של סרטן. התאימות של טכנולוגיות אלה המתפתחות במהירות עם הדמיה של תאים חיים עם תוכן גבוה יכולה להוביל ליצירת מערכי נתונים אינפורמטיביים גדולים, ולהביא אתגרים חדשים. ואכן, המשולש "תרביות משותפות/מיקרוסקופיה/ניתוח נתונים מתקדם" סולל את הדרך לפרמטריזציה מדויקת של הבעיה שעשויה לסייע לפרוטוקולים טיפוליים מותאמים אישית. אנו צופים כי שילוב עתידי של חיסון לסרטן על שבב עם בינה מלאכותית לעיבוד בתפוקה גבוהה יהווה סינרגיה גדולה קדימה במינוף היכולות ככלי חיזוי ופרה-קליניים לאונקולוגיה מדויקת ומותאמת אישית.

Introduction

האבולוציה של ענפי רפואה שונים כדיסציפלינות ניסיוניות הייתה תלויה ביכולת לתמרן את אוכלוסיית התאים ואת תפקודי האיברים בתנאים מבוקרים1. שורשיה של יכולת זו נעוצים בזמינותם של מודלים מדידים המסוגלים לשחזר תהליכים המתרחשים בגופנו.

בעידן האימונותרפיה ופרופיל גנומי חד-תאי 2, הביולוגיה של הסרטן צריכה לנצל את המודלים המתפתחים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני תקין 2,3.

מיקרו-סביבהגידולית 4 (TME) היא רקמה מורכבת שבה תאים סרטניים מתקשרים ברציפות ומתפתחים באופן דינמי עם תאים אחרים (תאי מערכת החיסון, סטרומה ואנדותל) ושאינם תאיים (המטריצה החוץ תאית, ECM). האופי הדינמי של הנוף המורכב הזה מכתיב אם תאי מערכת החיסון משחקים כחברים או אויבים של תאים ממאירים, ובכך משפיע מאוד הן על התקדמות המחלה והן על התגובה לטיפול. כיום, מאמצים גדולים של אונקו-אימונולוגים, ביואינפורמטיקאים ומומחים לביולוגיה מערכתית מתכנסים כדי להתמודד עם המשמעות הקלינית של הטרוגניות סרטן 5,6, הן במרחב (כלומר, באזורים גידוליים נפרדים) והן בזמן (כלומר, בשלבי התקדמות גידול מובהקים)5,6, ולאפיין פנוטיפ סרטן ותאי חיסון ולתפקד ברמה של תא יחיד. כדוגמה לסינרגיה זו, טכניקות מתקדמות של ראייה ממוחשבת משמשות כיום באופן שגרתי למיפוי מרחבי של חדירת מערכת החיסון בדגימות היסטולוגיות 7,8.

בחזית המודלים הניסיוניים, המגשרים בין מחקרים בבעלי חיים לבין שיטות מסורתיות במבחנה, ההתקדמות במיקרופלואידיקה ובטכניקות של תרבית משותפת מעניקה גישה לסוגים שונים של מודלים תאיים מהונדסים מיקרו כגון אורגנואידים, מערכות מיקרו-פיזיולוגיות 9,10,11 (MPS) ואיברים על שבב12,13,14 (OOC). הם חולקים את התכונה המשותפת להתמקד במבט "התמונה הגדולה" של המערכות האקולוגיות הסלולריות ולהרחיב את הפוטנציאל במבחנה לשלוט בגורמים מיקרו-סביבתיים תוך ניצול מיקרוסקופ15 בעל תוכן גבוה וגישות עיבוד תמונה.

כיום, מערכות MPS ו- OOC חדישות החלו לכלול היבטים אימונולוגיים , המשלבים תת-סוגים שונים של תאים חיסוניים ברקמות קיימות ובתרביות משותפות, כדי לחקור ולמדוד מגוון תהליכים כמו מחלות דלקתיות, ריפוי פצעים, חסינות רירית ותגובה לרעלים או מוצרי מזון יומיומיים16. דגמי TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, המשולבים גם עם מיקרו-כלים מתבלבלים 18,19,20,21, פותחו כדי לחקור אינטראקציות תלויות סוג תא, הפרעות פיזיקליות וכימיות והפעילות ציטוטוקסית של חדירת לימפוציטים22, כמו גם חומרים אימונומודולטוריים רלוונטיים מבחינה קלינית23.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים רב-תכליתיים, החל מטעינת תאים בשבבים ועד לכלי עיבוד תמונה, לניצול תרביות מיקרופלואידיות מתקדמות של גידולים וגידולים בדו-ממד (סעיף 1) ובתלת-ממד (סעיף 2)הגדרות 16, התואמות לניטור והדמיה דינמיים ורב-פרמטריים של24 פונקציות תאיות. זה מושג תוך שמירה על קלות השימוש והגמישות הן בניהול דגימות והן בניתוח נתונים, תוך ניצול תוכנת התוכנה החופשית של פיג'י וארגזי הכלים שלה25,26.

המכשיר המיקרופלואידי, המתואר בסעיף 1, נועד לבצע תרביות דו-ממדיות של סרטן דבק ותאים חיסוניים צפים. פלטפורמה זו אומתה למדידה חוץ גופית של התנהגות תאי מערכת החיסון בנוכחות מוטציות גנטיות27 ו/או ליקויים חיסוניים28. כאן, אנו מדגימים שלבים למעקב אחר תאי מערכת החיסון בתמונות שדה בהיר בהילוך מהיר, על ידי ניצול שיטה חצי-אוטומטית המבוססת על Trackmate (תוסף המיושם בתוכנת פיג'י). הליך זה מאפשר חילוץ של תיאורים קינמטיים של נדידת מערכת החיסון 29 ותגובה (כלומר, זמני אינטראקציה) כדי להתמקד בתאים סרטניים, מטופלים או לא עם גורמים למוות של תאים אימונוגניים27.

חשוב לציין כי פרמטרים אלה, המופקים מתמונות מסדרות זמן, ניתנים לעיבוד באמצעות מכונות מתמטיות מתקדמות. כדוגמה לפוטנציאל של גישה זו, הקבוצות שלנו פרסמו לאחרונה ניתוח המבוסס על שיטות מתמטיות מתהליכים סטוכסטיים ומכניקה סטטיסטית כדי למדל תכונות רשת תאית ולספק תיאור פרמטרי של התנהגות תאי מערכת החיסון (כלומר, הליכה אקראית מוטה או לא מתואמת, תנועה מתואמת מאוד או לא מתואמת30,31).

ההגדרה התלת-ממדית, המסופקת בחלק השני, מבוססת על פרוטוקול תרבית משותפת כדי ליצור מחדש TMEs מורכבים יותר של מערכת החיסון המשובצים בשני אזורי ג'ל עם שילובים שונים של סוגי תאים ותרופות באופן תחרותי. כאן, מתוארים שלבי עיבוד תמונה כדי למדוד, בנקודות זמן שונות, את החדירה של תאי חיסון מוכתמים בתאי מלנומה A375M אנושיים המעובדים בתוך מטריג'ל, כדי להעריך שילובים של חומרים אנטי-סרטניים32. קו A375M, קו תאים נגזר A375P המאופיין בפנוטיפ גרורתי מאוד נבחר כדי להעריך את יכולתם הגרורתית בנוכחות תאי חיסון32.

המודלים המתוארים יכולים להיות תואמים באופן מלא עם מקורות תאים שונים (מורין ובני אדם אימורטליזציה או קווי תאים ראשוניים, אורגנואידים, xenografts, בין היתר). במחקרים האחרונים של המעבדה שלנו, על ידי שילוב של מיקרוסקופ וידאו בתוכן גבוה עם ניתוח תמונה, הפריסה התלת-ממדית התחרותית יושמה כדי לחקור: i) תגובה חיסונית אנטי-גידולית (ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלוית נוגדנים, ADCC) ולנתח את התפקיד של פיברובלסטים בעמידות לטיפול בטרסטוזומאב במודלים של סרטן שד HER2+ על שבב33; 2) פעולתם של תאים מיאלואידים (כלומר, מקרופאגים הקשורים לסרטן) במנגנוני התחמקות הגידול וגיוס תאי T34; iii) יעילותם של משטרים אימונותרפיים, המבוססים במיוחד על תאים דנדריטיים מותנים אינטרפרון-α (IFN-DCs), המעובדים עם תאי סרטן המעי הגס שטופלו בתרופות במטריצות קולגן, ולהעריך תנועה יעילה ואת אירועי הפאגוציטוזה הבאים35; iv) נדידה כימוטקטית של אאוזינופילים שמקורם במח עצם לעבר תאי מלנומה IL-33 שטופלו או לא טופלו36.

מודלים מתקדמים אלה יכולים לשמש חלונות תצפית להבנת תפקיד מרקם החיסון בגרורות סרטניות ובמנגנוני עמידות, אך נדרשים מאמצים לתרגם את הממצאים למרפאות, ובכך לסגור את הפער במחקר בסיסי37.

כתרחיש מתפתח, רתימת כוחה של מיקרוסקופיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה בשילוב עם שימוש במיקרו-מערכות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית פותחת אתגרים פוטנציאליים חדשים לטיפול, עיבוד ופרשנות של מאות, ואפילו אלפי, ג'יגה-בייט של נתונים רב-פרמטריים, שניתן להפיק מקמפיין ניסיוני יחיד. משמעות הדבר היא קשר ישיר של ניסויי OOC עם אלגוריתמים מבוססי בינה מלאכותית 38,39,40,41,42 (AI) הן לניתוח אוטומטי מתקדם, והן ליצירת תכונות שיכולות להזין בתורן מודלים סיליקו של יחסי גומלין בין סרטן למערכת החיסון 43, עם יישומים חדשים ומלהיבים באופק, כגון פיתוח מבחני סינון תרופות מנבאים 44.

זרם הולך ומתרחב של מאמצים מתמקד בעיצוב מודלים של מחלות במשותף עם אופטימיזציה של אסטרטגיות ליישום מסכי הפרעה בקנה מידה גדול עם קריאות multi-omics תא יחיד. זה ללא ספק יעזור לפיתוח, ובתקווה, ליישום הקליני, המלווה במידה מתאימה של סטנדרטיזציה של שיטה, של גישה אונקו-אימונולוגיה-על-שבב שיטתית כדי לקבל תובנות חדשות על הפרעות חיסוניות ומנגנוני הפצת סרטן.

Protocol

1. תכנון שבבים לתאים דבקים וצפים בתרביות דו-ממדיות

הערה: פריסת התרבית המשותפת הדו-ממדית (איור 1A-C) מאופיינת בשלושה תאים (בגובה 100 מיקרומטר) המחוברים ביניהם באמצעות שתי קבוצות של מערכים מיקרו-ערוציים (500 x 12 x 10 מיקרומטר3, L×W×H). תא הביניים יוצר שני תאים סגורים ללא מוצא אשר חוסמים תאים חיסוניים צפים העולים על גדותיהם לאתר הגידול במהלך שלב ההעמסה 2.5. סוג התקן זה שימושי למדידות דו-ממדיות בזמן אמת של תנועתיות חד-תאית (דבקה או צפה), ושל אינטראקציות תא-תא 16,27,28,30,31. מחקר נדידת תאים טיפוסי (שנערך בין מספר שעות למספר ימים) משלב מיקרוסקופ תאים חיים עם אלגוריתמים לעיבוד תמונה45, על מנת לתרגם את רצפי התמונות הנרכשים לתכונות מספריות25. בהתבסס על דפוסי הנדידה, ניתן להעריך מספר אינדיקטורים ביופיזיים, כגון תזוזה ומהירות של תאים, כמו גם משך האינטראקציות בין תאי החיסון לתאי המטרה24.

  1. הכנת תאי סרטן ותאי PBMC
    1. תרבית תאים סרטניים
      הערה: MDA-MB-231 טריפל נגטיב [קולטן אסטרוגן (ER)-, קולטן פרוגסטרון (PR)-, וקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2)-] תאי אדנוקרצינומה אנושיים של השד גדלים באופן שגרתי במדיום 1640 של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 100 IU mL−1 פניצילין G נתרן מלח ו 100 מיקרוגרם mL−1 סטרפטומיצין סולפט (מדיום צמיחה), בתנאי תרבית סטנדרטיים (37°C ו-5% CO2).
      1. כדי לייעל את גדילת תרבית התאים, לוחית MDA-MB-231 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות בצפיפות של 1 × 106 תאים mL-1 ב 12 עד 15 מ"ל של מדיום גידול.
      2. כאשר התאים מגיעים ל-75-80% מהמפגש, יש להשליך את מדיום הגידול, לשטוף תאים במי מלח חוצצי פוספט שחומם מראש (PBS) כדי להסיר לחלוטין FBS, ולאחר מכן לנתק אותם עם טריפסין שחומם מראש (1 עד 2 דקות ב-37°C).
      3. הוסף מדיום גידול כדי להשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין ולאסוף תאים מנותקים. שטפו תאים פעמיים במשך 5 דקות במהירות של 1,100 x גרם בטמפרטורת החדר (RT).
      4. ספירת תאים בשקופית ספירת תאים באמצעות בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן ולאחר מכן זרעתם מחדש או לתרבית תחזוקה (לא יותר מ -6 מעברים מהפשרה) או להליכים ניסיוניים.
      5. עבור ניסויים מיקרופלואידים, זרע 1 × 10 6 תאים בצלחות6 בארות ב 3 מ"ל של מדיום גידול או לטפל עם 25 מיקרומטר doxorubicin (DOXO) או נפח שווה של ממס DOXO (PBS) כמו בקרה.
      6. ארבע עד 6 שעות לאחר מכן, שטפו תאים שטופלו ב-DOXO פעמיים עם PBS שחומם מראש במשך 5 דקות ב-1,100 x גרם ב-RT.
      7. ספור תאי בקרה שטופלו ב- DOXO ו- PBS כמפורט לעיל (ראה שלב 1.1.1.5) והגדר את התרבית המשותפת עם תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) בהתקנים מיקרופלואידים.
    2. בידוד PBMC
      1. לאסוף דם ורידי שלם (10 מ"ל בערך) ממתנדבים בריאים בבקבוקונים heparinized ולערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור 2 עד 4 פעמים47.
      2. לדלל דם 1: 1 עם PBS ושכבה מעל 10 מ"ל של צפיפות שיפוע בינוני Lymphoprep בצינור 50 מ"ל.
        הערה: הקפד לבצע את השכבות בעדינות רבה ובאיטיות רבה כדי לתת לדם ולימפופר ליצור שתי שכבות נפרדות.
      3. צינורות צנטריפוגות למשך 30 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C בדלי מתנדנד החוצה ללא בלמים. ארבע שכבות נפרדות ייווצרו: (i) פלזמה בחלק העליון, (ii) שכבה לבנה ועכורה המכילה PBMCs, (iii) לימפופר, ו-(iv) גלולה של אריתרוציטים וגרנולוציטים.
      4. יש לשאוף בעדינות PBMCs עם פיפטה של 2 מ"ל ומיד להשהות מחדש במדיום צמיחה חם (אותו הדבר משמש בשלב 1.1.1) ולשטוף פעמיים במשך 5 דקות ב 1,100 x גרם ב RT.
      5. יש לספור PBMCs כדוריים לעיל (ראה שלב 1.1.1.5) ולהשתמש בהם להליכים ניסיוניים או להקפיא לאחסון לטווח ארוך.
  2. ציפוי התאים בשבבים דו-ממדיים
    הערה: PBMCs אינם מוכתמים בפרוטוקול זה. כדי לאפיין פנוטיפים ספציפיים על שבב, ניתן לבודד תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון על ידי בחירת חרוזים אימונומגנטית, להיות מוכתמות בעוקבי תאים פלואורסצנטיים, לערבב מחדש עם החלק הנותר ללא תווית, וכך להתמודד עם תאי סרטן מטרה, כפי שדווח בניסויים על שבב, המתוארים ב- Vacchelli et al.27, וב- Racioppi et al.34.
    1. לפני תחילת ניסויים בתרבית משותפת וכדי להקל על הוספת ריאגנטים, הפעל שבבים מאוחסנים על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך מספר שניות. מלאו מיד מאגרים במים נטולי יונים, או PBS, כדי לשמור על משטחי PDMS (polydimethylsiloxane) הידרופיליים עד לשלבי הציפוי.
      הערה: PDMS הוא הידרופובי במהותו, מה שעלול לגרום לקשיים בתפעול וללכידה של בועות אוויר במיקרו-ערוצים. ראה שלב 7 בקובץ המשלים המספק פרטים על הפעלת פלזמה חמצן.
    2. יש לעקר מתחת לארון UV למשך 20 דקות, לשטוף 2-3 פעמים עם PBS טרי, ולאחר מכן לדגור עם מדיה תרבותית במשך 1 שעה. יש לשמור את השבבים באינקובטור עד לביצוע שלבי הציפוי.
    3. למשוך מדיה עודפת מכל ששת המאגרים. היזהרו שלא לשאוב את התקשורת מחדרי התרבות המרכזיים.
    4. מרחו באיטיות 1 × 105 תאים סרטניים המרחפים מחדש ב-10-20 מיקרוליטר של מדיום גידול במאגר השמאלי העליון, ולאחר מכן בבאר התחתונה (איור 1A, מאגרים 1 ו-2). המתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתא הגידול. חלק מהתאים ישקעו ויתחברו למאגרים.
      הערה: הכנס את המתלה הסלולרי לצד פתחי הערוצים. הליך זה מוחל על תאי סרטן MDA-MB-231, קווים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות התא. כדי לשפר את ההתקשרות של תאים סרטניים, ניתן לבצע פונקציונליות ציפוי של משטחים (למשל, פולי-L-ליזין, פיברונקטין ). אנא עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור ציפוי שלבים16, 48,49,50.
    5. בצד ימין מזרימים בעדינות צינורות 1 × 106 PBMCs התלויים מחדש ב-50 מיקרוליטר של מצע גידול לתוך בארות 3 ו-4 (ראו איור 1A, מאגרים 3 ו-4).
      הערה: לאחר הזרימה, PBMC יתחלק לתוך תא הביניים וייצור "חזית", המייצגת את נקודת ההתחלה של הניסוי.
    6. מלאו את כל ששת המאגרים בעד 100-150 מיקרוליטר של מדיום גידול. תחת מיקרוסקופ בדקו שהתאים התפזרו כראוי בתאי התרבית כפי שמתואר באיור 1D-E. הכרכים הסופיים יכולים להשתנות בהתאם לגודל המאגרים. התאימו את הנפחים כך שיהיו שווים בכל הבארות.
    7. החזירו את השבבים לאינקובטור למשך כשעה כדי לייצב את המערכת לפני ההקלטה בהילוך מהיר. הוסף מדיום טרי כל 3 ימים, כפי שהוא עלול להיות נתון הפסדי אידוי.
      הערה: המערכת תואמת הן לאנליזה של תאים חיים/מתים והן לפרופיל דינמי של הפרשת ציטוקינים ממולטיפלקס ממדיה מותנית. עבור אנליזות כימוקינים, עד 200-250 μL aliquots של supernatants עשוי להיות נגיש על ידי איסוף מדיה משני המאגרים של כל תא. בדיקות פרופיל ציטוקינים קלאסיות של ELISA ו- Luminex דורשות כ- 50 μL של supernatants. ראה 51,52 דוגמאות למחקרים של מעבדות אחרות המבצעות פרופיל ציטוקינים במודלים של OOC.
  3. רכישה בהילוך מהיר של תאים סרטניים וחיסוניים לא מסומנים
    הערה: בדרך כלל, 3 שבבים מסודרים בשקופית מיקרוסקופ אחת (ראו איור 1A עבור שבב דו-ממדי ואיור 4B עבור שבב תלת-ממד). באמצעות מחזיקי במה המקצים 4 שקופיות, תרביות משותפות יכולות להיות מתאימות לניטור על ידי מיקרוסקופ אוטומטי בעל תוכן גבוה כדי לנתח קבוצות גדולות של תנאי ניסוי. ניתן להתקין שבבים בקלות על שקופיות בעובי השווה ל -1 מ"מ או 170 מיקרון (כיסויי פלסטיק או זכוכית, בארות מרובות תחתונות אופטיות 6 בארות) להדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה.
    1. הקלט סדרות תמונות בשדה בהיר של תאים ללא תווית באמצעות מערך מיקרוסקופ וידאו המצויד במערכת דגירה.
      הערה: כאן נרכשו מערכי נתונים של סדרות זמן (חלון זמן: 48 שעות, קצב פריימים: 2 דקות) במיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בפיקסלים 4x objective ו-CMOS 1.3M, המותאמים להתאמה לחממה סטנדרטית של תרביות תאים.
    2. חממו את המיקרוסקופ במשך שעתיים לפחות כדי לאזן ל-37°C ו-5%CO2 לפני תחילת הרכישה.
    3. בחר את חלון התצפית על ידי מרכוז מערך המיקרו-ערוצים בין הגידול לתא המרכזי. זה מאפשר לדמיין את הדינמיקה של חדירה חיסונית ואת האינטראקציות בתוך האזור שבו תאים סרטניים נזרעים.
    4. התאימו את עוצמת התאורה והמיקוד של תאי סרטן ומערכת החיסון.
    5. להשקת רכישת קיטועי זמן, מטב את קצב הפריימים ואת משך הזמן בהתאם לניסוי ולסוג התא הנחקר.
      הערה: יש למטב את תנאי ההדמיה כדי למנוע חשיפה מוגזמת לתמונות תוך שמירה על יחס אות לרעש (SNR) טוב. מכיוון שתאי מערכת החיסון תנועתיים מאוד, קצב הפריימים של הרכישה צריך להיות גבוה מספיק כדי לעקוב אחר התהליך הדינמי המעניין ולאפשר מעקב קל53. יש להגיע לפשרה בין אלגוריתם המעקב, התאימות לגודל מערך הנתונים המתקבל, והכדאיות, הצפיפות והתנועתיות של התאים הנצפים.
    6. בסוף קיטועי הזמן, השתמש בפונקציה Import Image Sequence ו- Save as של תוכנת ImageJ כדי להמיר את ערכת הנתונים של המסגרת בקובץ וידאו לא דחוס של 25 fps.
      הערה: קובץ הווידאו שנוצר מוכן כעת לניתוח מעקב אחר תאים. כאן, תמונות RGB (1280x1024 פיקסלים) נאספו ברזולוציה מרחבית של 1.33 מיקרומטר לפיקסל. סרט באורך 24 שעות (ערימה של 3.5 GB) של שדה ראייה יחיד (FOV) כולל 720 מסגרות לכל תנאי.
  4. ניתוח נתונים: חילוץ חצי אוטומטי של מסלולים חיסוניים לא מסומנים על ידי Trackmate
    הערה: כאן, ניתוח תנועתיות החיסון בתמונות דו-ממדיות ללא תווית בהילוך מהיר מתבצע באמצעות TrackMate54ארגז כלים בקוד פתוח הזמין בחבילת התוכנה פיג'י/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)., מספר אלגוריתמים מסופקים לביצוע מעקב אוטומטי אחר חלקיק יחיד55(SPT) של מבנים דמויי נקודה. הם יושמו ביעילות על תמונות פלואורסצנטיות, שבהן אובייקטים בהירים על רקע כהה עם SNR גבוה (כלומר, כתמים פלואורסצנטיים מתחת לרזולוציה, שלפוחיות תנועה מסומנות, גרעינים)1,25,56,57,58. SPT מבוסס בעיקר על שני שלבים עוקבים. ראשית, אובייקטים עוברים לוקליזציה עם מיקומים מזוהים במסגרות מרובות (סגמנטציה), כפי שסכמטי ב-תרשים 2. בשלב השני (קישור חלקיקים), כתמים שזוהו מקושרים על פני מסגרות עוקבות כדי להעריך תנועה ולשחזר את מסלולם, בצורת מסילה (תרשים 3). ניתן לחשב תכונות מספריות מכל מערך קואורדינטות X, Y, Z שחולץ לאורך זמן. תיעוד מורחב מדווח ב54וכן באופן מקוון (http://imagej.net/TrackMate), בעקבות ערכת הלימוד תחילת העבודה עם TrackMate. ניתן לבדוק את דיוק התהליך באופן מיידי, תוך שימוש בממשק משתמש גרפי אינטואיטיבי (GUI דמוי אשף) המאפשר למשתמשים, בכל שלב, להתאים מחדש את ההגדרות. החלק הבא מתאר בקצרה כיצד להשתמש ב- Trackmate לשלבי עיבוד וכימות תמונה, המוחלים על תמונות אור נראה:
    1. גרור ושחרר את ערימת הווידאו/תמונות המלאה בסרגל הכלים של פיג'י.
    2. הגדרת מחסנית כיול (איור 2A).
      1. בדוק את המימדיות והקצה את מאפייני התמונה על-ידי בחירה באפשרות Image> Properties. תיבות המילוי 'יחידת אורך', 'מידות פיקסלים' ו'מרווח זמן של מסגרת'.
        הערה: כדי לבצע את הכיול, השתמש באורך הידוע של המיקרו-ערוצים (500 מיקרומטר, איור 1C) וחלק באורך הנמדד המתאים בפיקסלים. לסדרות זמן דו-ממדיות, הקפד להחליף את שדה Z/T המזין 1 כ- z פרוסה ואת המספר הנכון של מסגרות סרט. אם הדבר לא יושג, התפוקות והפרמטרים הכמותיים של Trackmate ידווחו ביחידות פיקסלים ובמסגרות זמן.
    3. עיבוד מראש של תמונות.
      1. כדי לשפר את ההבחנה הנכונה של תאי מערכת החיסון מרקע רועש, יש לעבד מראש תמונות של שדה בהיר כדי לפצות על תוצרים. ודא שערכות הנתונים מורכבות מתמונות TIFF של 8 סיביות (טווח בהירות: 0-255).
        הערה: תאורה לא אחידה, SNR נמוך וזיהום על ידי חלקיקי פסולת קטנים בתמונות אור נראה עלולים לסכן את ההצלחה של תהליך מעקב אחר תאים. כאן, ערכות נתונים של סדרות זמן מעובדות מראש באמצעות חיסור רקע, פונקציית התאמת בהירות/ניגודיות, ועל ידי חיסור תמונה מקומי של טשטוש גאוס מתמונות מקוריות. קיימות ערכות כלי ניתוח שונות אחרות הזמינות ב- ImageJ לעיבוד ופילוח של תמונות עם ניגודיות פאזה או שדה בהיר, כולל סף הדרגתי אמפירי (EGT)59.
    4. לוח הכיול הראשון (איור 2A)
      1. לאחר בחירת אוסף תמונות, הפעל את Trackmate (תוספים>מעקב).  לשנות/לאשר את המימדיות ואת חלון הזמן של הנתונים (כלומר, רוחב פיקסלים ומרווח פריימים).
        הערה: TrackMate קורא באופן אוטומטי בתיבת מאפייני התמונה כדי לספק את תוצאות המעקב הסופיות ביחידות פיזיות מכוילות (כלומר, מיקרומטר ודקות).
      2. הגדר אזור עניין לחישוב חילוץ רצועות החיסון, על-ידי הוספה ידנית של ערכים או על-ידי ציור אזור סגור מעל התמונה הפעילה ולאחר מכן לחיצה על לחצן רענן מקור. כדי לחלץ נתיבי נדידת חיסון גלובלית, בחרו אזורים מלבניים בהתאמה בצד ימין של מיקרו-ערוצים (החדר המרכזי, איור 1E) ובצד שמאל (תא הגידול, איור 1D). כדי לנתח אינטראקציות בין סרטן ונקודות חמות של מערכת החיסון, ציירו אזורי משנה מעגליים באמצעות כלי החזר השקעה (עבור אל ערוך → בחירה → ציין).
        הערה: בעת הפעלת ארגז כלים זה בפעם הראשונה ביישום ביולוגי חדש, הקדש את הזמן הדרוש כדי למטב את ההגדרות לשחזור המסילות.
        הערה: בצע מעקב ידני אחר מסלולי התאים (כ- 50-100 תאים) כדי למצוא אמפירית את התצורה הנכונה ולאחר מכן לאמת כאמת מידה את המהימנות של חילוץ אוטומטי של תנועות. בנוסף, לעבוד בתחילה על שטח קטן יותר כדי לבדוק בקלות את הדיוק של הפרמטרים שנבחרו.
    5. שלב זיהוי כתמים חיסוניים (איור 2B)
      1. בחר את ברירת המחדל Laplacian של גלאי Gaussian (LoG). גלאי LoG עובד כדי למצוא עצמים בהירים, דמויי כתמים ועגולים ולהחיל מסנן Laplacian של גאוס על התמונה המכוונת לגדלי ספוט בינוניים (5 עד 20 פיקסלים קוטר).
      2. בקוטר Blob משוער (כאן, 10-13 מיקרומטר) הזן ערך מעט גדול יותר מגודל הספוט הצפוי. הגדל את ערך הסף (כאן 1-3 מיקרומטר) עד להפחתת כתמי רקע מזויפים נוספים, אולי מבלי להסיר את תכונות האובייקט. זיהויים מתחת לערך סף (בהתבסס על מדדי איכות) יימחקו מהניתוח הבא. סמן את התיבה עבור המסנן החציוני ולוקליזציה של תת-פיקסלים כדי לשפר את איכות זיהוי הספוטים.
      3. השתמש בלחצן תצוגה מקדימה כדי להציג ולבדוק במהירות תאים חיסוניים מזוהים המונחים על התמונות על ידי עיגולים בצבע מגנטה.
        הערה: לטעויות במהלך הזיהוי תהיה השפעה ניכרת על תהליך הקישור. זיהויים לא רצויים אחרים ניתנים לתיקון בתפריטים הבאים באמצעות מסננים המוגדרים על-ידי המשתמש (כלומר, לפי עוצמת ספוט, גודל או מיקום).
    6. לאחר שתסתפק בבחירות, לחץ על הבא.
      הערה: הגדרות אלה עשויות להשתנות בהתאם לאופני ההדמייה של ההקמה והרכישה של הניסוי (לדוגמה, FOV, הגדלה אובייקטיבית, תמונות שדה בהיר או פלואורסצנטי), סוג התא (תאים נצמדים או צפים), החל מתנועתיות איטית או מהירה, סוג ההתנהגות התאית (אינטראקציה או לא) וצפיפות נמוכה/בינונית/גבוהה באזור התצפית.
    7. המשך ודלג על תפריט סף ראשוני. בחר בחלון Hyperstack Displayer.
    8. קבעו מסננים בחלונית 'ספוט' (איור 2C).
      1. בחר: צבע אחיד. ניתן להוסיף מסננים, כפי שמוצג באיור 2C, כדי לשמור על נקודות מסומנות עם ערכי תכונות, המוצגות בהיסטוגרמה, מעל או מתחת לסף הפיך.
    9. שלב בחירת כלי המעקב (איור 3A). בחר את מעקב LAP פשוט, כאלגוריתם קישור חלקיקים המבקש שלושה שדות למלא (במקרה זה, "קישור מרחק מקסימלי": 30-50 מיקרומטר, "מרחק מקסימלי סגירת פער": 25-50 מיקרומטר, "פער סגירת פער מסגרת מקסימלי": 4-6). גלאי זה מנהל אירועי סגירת פערים, עם חישוב קישור עלויות אך ורק על בסיס המרחק שלהם.
      הערה: מרחק הקישור המרבי המותר מגביל את טווח החיפוש המרחבי אחר נקודות תואמות מועמדים, בהתאם לתזוזה המרבית המותרת בין שתי מסגרות עוקבות (איור 3D).
      1. ספק ערכים גדולים יותר של תזוזה מקסימלית כאשר מבחינים בפיצול רצועות של חלקיקים תנועתיים מאוד.
        הערה: שני קישורים לא יחוברו אם תנועת מסגרת למסגרת גדולה מערך המרחק המרבי הנתון. אם מקטעים מגשרים בצורה גרועה בין שני תאים שונים, הפחיתו את ערך התזוזה המרבית.
      2. נסו לחבר מחדש נקודות חסרות, תוך שינוי הערכים של "המרחק המרבי לסגירת הפער" ו"פער המסגרת המקסימלי".
        הערה: פרמטרים אלה עוסקים באירועי סגירת פערים במסגרות שאינן סמוכות. היעלמות נקודתית עלולה להתרחש בחלק מהפריימים (כלומר, חלקיקים מחוץ למיקוד, תאים שנותרו בחוץ וב-FOV, כשלים בסגמנטציה בתמונה רועשת).
        הערה: כדי לטפל בפיצול או מיזוג אירועים, בחר במקשר LAP כגלאי המציג קנסות מטריצת עלות קישור.
    10. לחץ על הבא כדי להפעיל את חישוב המעקב. לחץ על הבא.
    11. החלונית 'רצועות סינון' (איור 3B). שנה את הצבע של בחירת נתיבי החיסון, מהתפריט הנפתח, "מזהה מסלול" או תכונות מסלול אחרות. בשלב זה, בחר באופן אופציונלי להגדיר מסננים אינטראקטיביים פונקציונליים, כדי לשפר את איכות התוצאה ולבקר שוב את ההליך.
      הערה: כתמים מזויפים נובעים מרעש בתמונה ומאובדן איכות התכונה. זה ייצור מקטעים קצרים בעוד תאים מעניינים ניתן לעקוב על פני מסגרות רבות.
      1. להסרת נתיבים קצרים, נסו לסנן, בהתאם למספר הכתמים שהם מכילים. בנוסף, מיין רצועות באמצעות שילוב של אפשרויות כגון הזחת מסלול, משך מעקב או מהירות מינימלית/ממוצעת/מקסימלית כדי לא לכלול רצועות שגויות או לא רצויות (עם פחות מסגרות ביחס למשך הכולל של קיטועי זמן או הכוללים חלקיקים מלוכלכים או לא נעים) מהמשך העיבוד.
        הערה: בחירת המסננים עשויה להשתנות בהתאם ליישום הספציפי ולמערכת הביולוגית.
    12. בדוק את כל הרצועות בממשק אפשרויות תצוגה, גלול בזמן וודא עד כמה רצועות מדויקות תואמות נתיבי נדידת תאים. התפריט הנפתח מספק קודי צבע עבור כתמים ונתיבים להדמיה וסינון קלים לפי מספר אופנים (למשל, פרמטרים קינטיים, עוצמה, מיקום זמני או מרחבי).
      הערה: למעקב אחר תרביות בצפיפות גבוהה, או תאים בעלי תנועה גבוהה, הגדל את קצב מסגרות הרכישה תוך מזעור תזוזת התאים במרווחי זמן עוקבים.
    13. תיקון ידני של טעויות סגמנטציה וקישור (איור 3E).
      1. כדי לשפר עוד יותר את איכות התוצאות, ערוך באופן ידני כתמים (חלקיקי פסולת, תאים נייחים) והסר עקבות שגויות הנובעות מגבולות הגידול שזוהו בעת ניתוח החזר השקעה על אינטראקציה בין הגידול למערכת החיסון.
      2. תחילה, בחר בכלי TrackMate בסרגל הכלים ImageJ. לביטול נקודה קיימת לאורך כל הערימה, הקש Shift וצור באמצעות סמן העכבר מסיכת ROI מעל נקודת היעד (ערוכה בעיגול ירוק), ולאחר מכן לחץ על מקש DEL.
      3. להוספת נקודה חדשה (במקרה של רצועות חסרות עקב היעלמות כתמים) הקש על מקש A והנח את העכבר במיקום המחודד. חזור על תהליך החישוב של קישור רצועות לאחר שלב זה.
    14. כשתרצו בכך, בחרו 'ניתוח' בחלונית 'אפשרויות תצוגה' ליצירת שלושה קובצי מלל (איור 3C ו - 3F). הטבלה ב"כתמים בסטטיסטיקה של מסלולים" מספקת את הקואורדינטות המרחביות-זמניות של נקודות החיסון (מיקומי X-Y-Z של התאים המסומנים במסגרת ובמספר הרצועה המשויכים). "קישורים בסטטיסטיקת מסלולים" ו"סטטיסטיקת מסלול" מכילים מידע ביחס למסלולים: משכי מסלול, מספר פערים או נקודות שזוהו, מסלול ראשוני ומסגרת עצירה וכו'. שמור וייצא עבור כל ערכת נתונים.
      הערה: בעת לחיצה על שורה בתוך חלונות התוצאות, הספוט, הקישור או הרצועה המתאימים מופעלים בתוך סרטון קיטועי הזמן לצורך בדיקה חזותית. חזור על שלבי הסינון כדי לבחור/להסיר רצועות. כל הנתונים המיוצאים בעתיד יעודכנו. עצה: ניתן לנצל את ערכי משך הזמן הראשוניים והעצירה-פריים והמסלול כדי לחשב זמני מגע בין תאים סרטניים וחיסוניים בעת עיבוד החזר השקעה על אינטראקציה.
    15. לחצו על הלחצן 'שמור' ליצירת קובץ XML שיתקבל הכולל את כל ערכי הפרמטרים, הנתיב לתמונות ומיקומי הספוט בזמן. הפקודה "טען קובץ TrackMate" (תוספים> מעקב) משחזרת את כל הפעלת התהליך עבור כל קובץ סרט בנפרד.
    16. מעבר לחלונית האחרונה של ממשק המשתמש הגרפי בשם Select an action. ברשימה, השתמש בפונקציה Captureoverlay > Execute כדי להפיק סרטון עם רצועות בשכבת-על. טיפ: ניתן להשתמש באפשרות "Plot N-spots vs time" כדי לחשב את הצפיפות המרחבית של תאי מערכת החיסון בהחזר השקעה (איור 6B, פאנל ימני).
    17. ניתוח לאחר עיבוד וסטטיסטיקות הגירה
      1. נתח את נתוני המיקום הגולמיים ישירות ב- Trackmate או יצא נתונים כדי לחשב פרמטרים קינטיים מקיפים29 (כלומר, אורך מסלול כולל, מרחק אוקלידי, יחס כליאה, תזוזה בריבועממוצע 56, מהירות מסלול ממוצעת או מיידית, מקדם מעצר, התפלגות זוויות נדידה, מדד הגירה קדימה, מהירות קו ישר ממוצעת) כדי לסווג התנהגות נדידת תאי חיסון (למשל, תנועה מכוונת או דיפוזית30, 31) ותגובה לתאי מטרה סרטניים (למשל, טיפול לעומת ביקורת).
        הערה: תוספים שימושיים נוספים כגון כלי הכימוטקסיס וההגירה (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) מספקים גרפים שונים (למשל, רוז או חלקות סקטור, כמו שמתואר באיור 6) ומבחנים סטטיסטיים לניתוח מתקדם והדמיה של נתוני הגירה ניסיונית וכימוטקסיס. שילוב של אלגוריתמים24,25,45 למעקב אחר תאים ופילוח תאים עשוי לאפשר מדידות של מדדים מורפולוגיים ברמת התא הבודד (כלומר, שטח פני התא, אורך הציר הראשי והמינורי ויחס הגובה-רוחב של התא).

2. מודל תלת ממדי של סרטן על שבב בבדיקה תחרותית

הערה: תכנון השבב התלת-ממדי, המתוארבאיור 4, מורכב מ-5 תאים עיקריים: אחד מרכזי לצריכת תאי מערכת החיסון הצפים, שני אזורים צדדיים להטמעת תאי גידול במטריצות  הידרוג'ל (בגובה 150-250 מיקרומטר) ותאי זילוח מדיה. תאי החיסון ותאי הגידול מחוברים באמצעות שתי קבוצות של מערכים צרים של מיקרו-ערוצים (200×12×10 מיקרומטר3, L×W×H, איור 4E). באופן קבוע, מיקרו-עמודים של איזוצלות טרפזיות במרווחים של 100 מיקרומטר (כ-25-30 ממשקים עבור כל אזור ג'ל צדדי, איור 4C) פועלים כמחסומים לתמיסת ג'ל מוגבלת במהלך ההזרקה, תוך ניצול האיזון בין מתח פני השטח לכוחות נימים60,61 ומחברים אזורי גידול לשני תאי המדיה הצדדיים הנוספים כדי ליצור ממשק ג'ל-נוזל (איור 5). המאפיינים המפורטים של המבחן התחרותי התלת-ממדי מוצגים באיור 4. נדידה מועדפת של תאי מערכת החיסון לעבר שני תאי ההידרוג'ל המארחים תאי גידול שעברו טיפולים שונים ניתנת לניטור ולכימות. ניתן ליישם את הפריסה התחרותית המסוימת כדי לחקור שפע של פנוטיפים שונים של ביולוגיה של סרטן (למשל, עמידים לתרופות לעומת אגרסיביים, ראשוניים או גרורתיים, מגיבים לעומת לא מגיבים). בנוסף, ניתן לשלב בקלות את האזורים המשובצים בג'ל עם אוכלוסיות תאים שונות כדי ליצור מחדש TME הטרוגניים יותר, כולל רכיבי סטרומה (פיברובלסטים, תאי אנדותל)23 או כדי לדמות סביבה חיסונית34 ספציפית (למשל, מקרופאגים) לניתוח מנגנונים של עמידות לתרופות והתחמקות מגידולים.
הערה: צביעת קספז גרעינית ופעילה, באמצעות ערכות מסחריות לבדיקות חיות/מתות (למשל, Thermo Fisher Scientific, ריאגנטים אינקוציטים), ניתנת ליישום כדי להעריך אירועי מוות מיטוטי או אפופטוטי, כפי שדווח ב- Nguyen et al.33.

  1. הכנת פתרון מטריצה עם תאים וטעינה במכשיר
    הערה: במסגרת הניסוי הבאה, שני אזורי הג'ל מכילים תערובות של קווי תאי מלנומה אנושיים A375M, הגדלים בתמיסת מטריצה (למשל, מטריג'ל), החשופים לחומרים טיפוליים המשמשים כמונותרפיה או בשילוב. הגדרה זו אפשרה לנו להעריך את היעילות של שילוב של שתי תרופות ביחס לתרופות בודדות באופן תחרותי ולכמת את יכולתן למשוך PBMCs.
    1. הפשיר מלאי של תמיסת מטריצה (למשל, מטריג'ל) על ידי הנחת קרח במקרר 4 מעלות צלזיוס יום אחד לפני הניסוי.
      הערה: אין לחשוף את המוצר למחזורי הקפאה-הפשרה מרובים מכיוון שהוא הופך ל"גושי". פרוטוקולי הידרוג'ל סינתטיים או טבעיים אחרים יכולים להתאים לשימוש בסביבה זו. אנא עיין 33,34,35 להכנת תאים סרטניים במטריצות קולגן.
    2. השהה מחדש תאי מלנומה אנושיים A375, מוכתמים במקשר תאים פלואורסצנטיים ירוק PKH67 תואם חי בתמיסת מטריצה (2 מ"ג מ"ל-1). היכן שצוין, הוסף 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2.5 μM), המכונה DAC, ו / או IFN-α2b, המכונה IFN, במינונים המתאימים32.
      הערה: התאם את ה- Lot # בגיליון המפרט של בקבוק המטריצה. בהתבסס על הריכוז, חשב את נפח התווך הדרוש לייצור עד 2 מ"ג מ"ל-1 אנא התאם את ריכוז החלבון האופטימלי ואת ריכוז תרחיף התאים הסרטניים בהתאם ליישום העניין שלך.
    3. פיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי למנוע את הדור של בועות. שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח בזמן הערבוב כדי למנוע פילמור לא רצוי.
    4. לאחר העיקור, הניחו את המכשירים על קרח (באמצעות דלי קרח ומכסה) כדי למנוע התמצקות תמיסת מטריצה במהלך כל הליך טעינת התא.
    5. הזריקו באיטיות את שתי תערובות תאי הגידול IFN ו-DAC/IFN (2-4 μL) לתוך יציאת הג'ל השמאלית והימנית, בהתאמה, עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר באמצעות קצוות קרים (איור 5A). הפעל לחץ עדין כדי לדחוף את תמיסת המטריצה מצד אחד עד שתגיע לצד הנגדי.
      הערה: נפח פתרון המטריצה נבחר כדי למנוע גלישה לערוצים סמוכים. אל תפעילו לחץ פיפטינג מוגזם כדי למנוע זליגת הפתרון לתקשורת ולערוצים מרכזיים. אם במהלך ההעמסה נתיב הג'ל חסום לאורך הערוץ, נסו להכניס את התמיסה מהכניסה השנייה עד שחזיתות הג'ל נפגשות. בעת הסרת micropipette מן המפרצים, להחזיק את הבוכנה, אחרת הלחץ השלילי יהיה לשאוף פתרון מטריצה.
    6. הניחו את המכשיר באינקובטור במצב זקוף בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר ג'לציה של תמיסת המטריצה להתרחש (איור 5B). טפל עם שבבי טיפול עם ג'ל לא פולימרי מוטבע כדי למנוע דליפה מתוך תעלת הג'ל.
    7. בינתיים, השהה מחדש PBMCs המסומנים ב- PKH67 (1x106 תאים) ב- 10 μL של DMEM מלא (תווך הנשר השונה של Dulbecco).
    8. לאחר הג'לציה של המטריצה, ממלאים את תעלות המדיה (50-100 μL) באותו אליקוט של מדיום תרבית בכל ששת המאגרים כדי למנוע התייבשות ג'ל בשבבים. יש לשמור באינקובטור עד להשעיית תאי מערכת החיסון.
      הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ את הפיזור הנכון וההומוגני של תאי הגידול בג'ל ואת שלמות מחסומי הג'ל הפולימרי. אזורים או בועות ג'ל אחידים חלקית או לא אחידים בתערובת מובילים לזרימה מוקדמת מדי של PBMCs בערוצי מדיה ג'ל בנקודת ההתחלה של הניסוי עקב תנודות התחלתיות של לחץ.
    9. יש לשאוף מדיה משש הבארות ולמקם את הקצה ליד פתח ערוץ מדיה כדי להזריק בעדינות עם מתלה תאי PBMC בלחץ בינוני. רצף זמני הטעינה מתואר באיור 5C:
      1. PBMCs ב 10 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית העליונה.
      2. 50-100 מיקרוליטר בינוני לכל אחת מארבע בארות של תעלות רוחביות.
      3. 40-90 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית העליונה.
      4. 50-100 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית התחתונה.
    10. ודא תחת מיקרוסקופ כי התפלגות PBMCs נשארת כלואה בתא המרכזי לאחר שלב ההעמסה. (איור 7A).
      הערה: אם זה לא אופטימלי, להתאים את הריכוז במידת הצורך ולחזור על שלבי הזריעה, באמצעות שבבים טהורים. בעת חישוב נפחים עבור תנאי הניסוי המתוכננים, להתייחס למספר עודף של שבבים (15-20%) לקחת בחשבון שגיאות והתאמות פוטנציאליות. נפחים וריכוזים צריכים להיות אופטימליים בהתאם ליישום הספציפי.
    11. מקם התקנים מורכבים על משטח ישר באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לרכישת הדמיה פלואורסצנטית לאחר מכן. טפל עם שבבי טיפול לאחר העמסת תאי החיסון הצפים.
      הערה: לפצות על הפסדי אידוי של נפחים במאגרים על ידי החלפת מדיה כל 2-3 ימים. עבור פרופיל כימוקין, ניתן לשאוף עד 100 μL מכל אחת משתי בארות של תאי תרבית, עיין בשלב 2.7, בשלב 1.
  2. ספירה אוטומטית של מרכזיות מגויסות בתמונות ניאון חד-ערוציות ב-ImageJ
    הערה: שיטות קלאסיות של immunofluorescence עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית ניתן ליישם על פעולות על שבב כמו מדידות נקודת קצה. הליך הצביעה הבסיסי כולל קיבוע תא על שבב, חלחול, חסימה, קשירת נוגדנים, צביעת גרעינים עם שלבי שטיפה ביניהם. תאים חיסוניים לא מסומנים שהוחדרו לאזורי ג'ל תלת-ממדיים עם מיקרו-סביבות סרטניות משובצות יכולים להיות קבועים בנקודות הזמן הרצויות ומוכתמים עבור סמני ביטוי של הפעלה/תשישות/התבגרות (למשל, עבור תאי CD8, ניטור של CD69, CD95, PD1, TIM3 סמנים). ב Parlato et al.35פגוציטוזה של תאים אפופטוטיים SW620 הוערכה במיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות התקנים שהורכבו על כיסויים בעובי 170 מיקרומטר., IFN-DCs הוכתמו והוסיפו על שבב אנטי אנושי HLA-DR-FITC Ab aliquots.
    כדי לחשב את המידה של תאי חיסון חיים מוכתמים פלואורסצנטית המאותגרים באותות תחרותיים, תהליך עבודה נפוץ של ניתוח תמונה מוגדר באופן הבא (איור 7D-ג):
    1. לרכוש, בנקודות קצה זמן ספציפיות, ניגודיות פאזה ותעלות אדומות/ירוקות מיקרופוטוגרפיות פלואורסצנטיות של אזורי הג'ל השמאלי והימני המכילים תאי גידול שנחשפו בהתאמה למשטר יחיד או שילובים של משטרים פרמקולוגיים.
      הערה: כאן התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS-FL לאחר העמסת תאים (0 שעות), לאחר 48 שעות ולאחר 72 שעות דגירה (איור 7A-B). נעשה שימוש בהגדלה של 4x-10x כדי לרכוש את התא המרכזי, את מערכי המיקרו-ערוצים ואת שתי התעלות הצדדיות הסמוכות המכילות A375 בתוספת IFN ו-A375 בתוספת DAC/IFN.
      1. בעת ביצוע פעולות רכישה, שקול את הפרמטרים למדידה ולהימנע מרוויה של תכונות שיש לספור. תוצאות פילוח אופטימליות תלויות באופי התמונות הנרכשות, בשל השונות בדגימות הביולוגיות עצמן, באיכות הצביעה ובטכניקות המיקרוסקופ המשמשות ליישומים מוכווני משתמש.
    2. טען נתונים חד-ערוציים פלואורסצנטיים (במקרה זה אדום = PBMCs), בפיג'י על-ידי גרירתם לחלון הראשי (איור 7D). שכפלו את התמונה כדי להימנע מדריסת הנתונים הגולמיים במהלך בחירת מסנני קדם-עיבוד עד לסגמנטציה הסופית.
      1. אם התמונה היא תמונה צבעונית (RGB), לחצו על Image > Type 8 או 16-bit כדי להמיר לגווני אפור. ודא שהאפשרות ערוך אפשרויות > > 'המרותs' מוגדרת לשינוי גודל בעת ההמרה.
    3. עיבוד מראש של נתונים גולמיים באמצעות ניקוי רעש וחפצים.
      1. עבור אל תפריט Process > Subtract Background על-ידי החלת אלגוריתם הכדור המתגלגל כדי לתקן רקע רעש לא אחיד עם וריאציות מרחביות גדולות של עוצמות. הגדר את הרדיוס לפחות לגודל של החלקיק הקדמי הגדול ביותר. בחר בתיבה תצוגה מקדימה עבור הליך ניסוי וטעייה כדי להניב תוצאות מיטביות. ערכים קטנים מדי עלולים להסיר באופן שגוי מבנים בעלי עניין.
      2. בפקודה 'בהירות וניגודיות', גררו מחוונים 'מינימום/מקסימום' כדי לשנות את טווח העוצמות בהיסטוגרמה. הזז את המחוון 'מרבי' שמאלה כדי להגביר את הבהירות, ללא תכונות שטיפה. הזז את השקופית המינימלית ימינה כדי להגדיל את ניגודיות התמונה ולמנוע היעלמות של תכונות פחות גלויות ברקע. לחץ על החל כדי לתקן שינויים.
    4. שיפור תמונה.
      1. עברו אל 'עבד מסנני >' והתנסו במסננים החציוניים, גאוסיאניים בתמונות (איור 7E).
        הערה: יש להתאים את רדיוס הסינון מראש לפיקסלים של רעשי התמונה. המסנן החציוני הלא ליניארי מחליף את ערך הפיקסלים בערך החציוני של השכנים, כדי להפחית את רעש המלח והפלפל. "טשטוש גאוסיאני" משמש להחלקת תמונה דיגיטלית, על-ידי החלפת פיקסלים בממוצע משוקלל של הפיקסלים שמסביב. המשקולות מגיעות מהתפלגות ההסתברות של גאוס, ולכן הפיקסלים הקרובים ביותר משפיעים יותר.
      2. עבור באופן אופציונלי אל עבד > מתמטיקה > גמא עם תיבת תצוגה מקדימה מסומנת כדי להגדיל את הניגודיות.
        הערה: העוצמות המוגדרות בלוח B&C משתנות בין שתי מגבלות המינימום והמקסימום. ערכים < 1.0 מדגישים הבדלים בין עוצמות נמוכות בעוד ערכים > 1.0 מדגישים הבדלים בין עוצמות גבוהות. תיקון גמא הוא פונקציונלי כדי למצוא טווח תצוגה, המציג את האובייקטים המעומעמים ביותר מבלי להרוות את הבהירים ביותר.
    5. יצירת מסיכת תמונה בינארית.
      1. עבור אל תמונה > התאם סף >. השיטה הפשוטה ביותר לקביעת ערכי סף מסתמכת על ניתוח היסטוגרמה של רמות עוצמה, כפי שניתן לראות באיור 7F. בתפריט הנפתח, לשחק עם שיטות סף גלובליות שונות (במקרה שלנו, Otsu מוחל).
      2. גללו או הקלידו ידנית טווח ידוע של עוצמות פיקסלים בחלוניות ההיסטוגרמה, שימו לב לשינוי דוגמת המילוי האדומה המכסה את התמונה, הדומה בעיקר לאזור התא בפועל. הלחצן 'איפוס' מסיר את השכבת-על. לאחר שביעות רצון, לחץ על החל כדי ליצור גרסה בינארית של התמונה. סמן את האפשרות תהליך > אפשרויות > בינארי כדי לשלוט באופן ההצגה של תמונות סף ובאופן שבו אובייקטים מזוהים על-ידי מנתח החלקיקים.
    6. השתמש בפקודה בתפריט Process/Binary/Watershed Particles כדי לחלק חפיפה חלקית או ממוזגת במהלך הסף. קו פרשת המים יכול לעתים קרובות לחתוך אותם במדויק על ידי הוספת קו בעובי של פיקסל אחד. בצע פעולות מורפולוגיות כגון פעולות הרחבה או שחיקה כדי להגדיל או להסיר פיקסלים מתחת או מפיקסלים רוויים מדי.
      הערה: לקבלת מידע נוסף, עיין בסעיף פקודות תפריט או עיין ב- MorphoLibJ, ספריה משולבת המבוססת על מורפולוגיה מתמטית לעיבוד נתונים בינאריים.
    7. תיאור תכונת תמונה כמותית.
      1. לאחר קבלת זיהוי אובייקט משביע רצון, פתח את מנתח החלקיקים מניתוח > ניתוח חלקיקים. ניתן להוציא חלקיקים על ידי גודלם ומעגליותם, המבוטאים בפיקסלים או ביחידת מידה מכויילת (בדוק את קנה המידה הנכון ביחס להגדרות המיקרוסקופ תחת מאפייני > תמונה). כדי לכלול הכל, השאר את ברירת המחדל של 0-Infinity ואת טווח ברירת המחדל המעגלי על 0.00 - 1.00 (0 = קו ישר, 1 = מעגל מושלם).
      2. כדי לסנן פיקסלים קטנים "רעש" או תכונות שאינן מעניינות, הגדר את הטווח המינימלי והמקסימלי. סמן את האפשרויות כלול חורים, הצג, מיתאר והצג תוצאות בשדה החלון. האפשרות 'אל תכלול בקצוות' תמחק חלקיקים שזוהו בגבולות התמונה. הוסף למנהל מוסיף את הבחירה המתקבלת למנהל החזר ההשקעה לניתוח נוסף תוך שמירה על מידע המיקום של החלקיק.
        הערה: ב "ROI Manager", ניתן לתקן פלט רשום פילוח אוטומטי (מיזוג תאים מפוצלים, פיצול תאים ממוזגים). בחר, באמצעות כלי בחירה בסרגל הכלים של פיג'י, החזר השקעה בתוך שני אזורי הג'ל שבהם מוטבעים תאים סרטניים כדי להעריך חדירה חיסונית.
    8. יצא את הערכים שהתקבלו לגיליון אלקטרוני כדי לבצע ניתוח סטטיסטי כפי שמוצג באיור 7G. "תוצאות" מפרטת טבלת נתונים ביחס למאפייני חלקיקים מחולקים לרמות שזוהו. "סיכום" פותח חלון עם שם התמונה, ספירות כוללות ומידע נוסף עבור התמונה כולה.
      1. עבור אל נתח > הגדר מדידות כדי לכלול מגוון רחב של פרמטרים.
    9. הקלט מאקרו אופציונלי (על-ידי בחירה באפשרות תוספים > פקודות מאקרו >- Record) כדי להפוך את זרימת העבודה של העיבוד לאוטומטית ולחסוך ניתוח זמן בערכות נתונים גדולות.
      1. השתמש באותה שגרת עיבוד כדי לנתח ערוץ פלואורסצנטי ירוק באותם אזורים לניתוח שינויים מורפולוגיים של תאי גידול באזורים תלת-ממדיים16

תוצאות

חדירה חיסונית של הגידול היא פרמטר של התגובה האנטי-סרטנית של המארח. גידולים הם הטרוגניים בהרכב, צפיפות, מיקום ומצב תפקודי של לויקוציטים חודרים, אשר אינטראקציות עם תאים סרטניים יכולות לעמוד בבסיס מידע רלוונטי מבחינה קלינית לחיזוי מהלך המחלה והתגובה לטיפול. במובן זה, טכנולוגיות מיקרופלואיד?...

Discussion

השיטות המתוארות מנסות לעצב גישה כללית כדי לשחזר, עם מידת מורכבות ניתנת לשינוי, שני היבטים משמעותיים בתחום האונקו-אימונולוגיה, אשר יכולים להפיק תועלת מאימוץ מודלים רלוונטיים יותר במבחנה. הראשון נוגע לצד אוכלוסיית תאי הגידול, שם התמודדות עם מאפייני תא בודד עשויה להוביל לתיאור טוב יותר של ה?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף. AS נתמך על ידי Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) ו- Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS ו- FM נתמכים על ידי האגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC) מס '21366 ל- G.S.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture materials 
50 mL tubesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DACMillipore-Sigma; St. Louis, MOA3656DNA-hypomethylating agent
6-well platesCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS3506culture dishes
75 cm2 cell culture treated flaskCorning, New York, NY430641Uculture flasks
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochlorideMillipore-Sigma; St. Louis, MOD1515anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0728LCulture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o MagnesiumEuroClone Spa, Milan, ItalyECB4004Lsaline buffer solution
Fetal Bovine SerumEuroClone Spa, Milan, ItalyECS0180Lancillary for cell culture
FicollGE-Heathcare17-1440-02separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometerNeubauerCell counter
Heparinized vialsThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAVials for venous blood collection
interferon alpha-2bMillipore-Sigma; St. Louis, MOSRP4595recombinant human cytokine
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milan, ItalyECB3000Dancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation mediaCedarlane Labs, Burlington, CanadaSeparation of lymphocytes by density gradient centrifugation
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
MatrigelCorning, New York, NY354230growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231 American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA HTB-26human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X  EuroClone Spa, Milan, ItalyECB3001Dancillary for cell culture
Pipet aidDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH26GLred fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linkerMillipore-Sigma; St. Louis, MOPKH67GLgreen fluorescent cell dye
RPMI-1640EuroClone Spa, Milan, ItalyECM2001LCulture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MOCLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)EuroClone Spa, Milan, ItalyECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solutionThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061cell stain to assess cell viability
TrypsinEuroClone Spa, Milan, ItalyECM0920Ddissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscopeThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)Steril VBH 72 MPLaminar flow hood
Optical microscopeZeiss
Refrigerable centrifugeBeckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)Sigma AldrichA3648silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ MB W&A,  Germanyoptical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)Ibidi, Germany10812
Hydrogen Peroxide solution 30%Carlo Erba Reagents412081reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketoneCarlo Erba Reagents461945PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm Sail Brand7101substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mmTedpelladermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDaAllresist,GermanyAR-P. 679.04Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslipsIbidi, Germany10813substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron DopedGambetti Xenologia Srl, Italy30255
Propan-2-olCarlo Erba Reagents415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 resists developer
SU-8 3005Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0001Negative Photoresists
SU-8 3050Micro resist technology,GermanyC1.02.003-0005Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%Carlo Erba Reagents410381reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDowsil, Dow Corning11-3184-01Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLsilanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litographyRaith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography systemEV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching systemOxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

References

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. . Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, 282 (2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -. H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -. T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235 (2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639 (2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737 (2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450 (2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093 (2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664 (2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985 (2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789 (2019).
  54. Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -. Y., Herbert, S. . The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014 (2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  84. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  85. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , (2018).
  86. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  87. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  88. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16 (2019).
  89. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  90. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved