将RatWalker系统应用于帕金森病遗传大鼠模型中的步态分析

摘要

在这里，我们描述了RatWalker系统，该系统是通过重新设计MouseWalker设备来构建的，以适应增加的老鼠的尺寸和重量。该系统使用受挫全内反射 （FTIR）、高速视频捕获和开放式访问分析软件来跟踪和量化步态参数。

摘要

帕金森病 （PD） 是一种进行性神经退行性疾病，由黑质致密部多巴胺能 （DA） 神经元丢失引起。步态异常，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步数缩短，在帕金森病患者中很常见，并且出现在病程早期。因此，PD动物模型中运动模式的定量对于病程和治疗期间的表型表征非常重要。大多数PD病例是特发性的;然而，PD遗传形式的鉴定揭示了基因突变和变异，例如Pink1和Parkin的功能丧失突变，这两种蛋白质参与线粒体质量控制，可以用来创建动物模型。虽然小鼠在失去Pink1和Parkin（单次和组合缺失）时对神经变性具有抵抗力，但在大鼠中，Pink1而不是Parkin缺乏导致黑质DA神经元丧失和运动障碍。在这里，我们报告了FTIR成像的效用，以揭示自由行走的年轻（2个月大）雄性大鼠的步态变化，随着这些大鼠年龄的增长（在4-6个月时观察到），其特征是后肢拖曳，如先前在Pink1敲除（KO）大鼠中报道的那样。

引言

PD是最常见的年龄相关性神经退行性运动障碍，是由黑质致密体中DA神经元的缺失引起的。这种黑质DA神经元的缺失和进入纹状体的DA输入导致PD^1，2患者观察到的运动功能障碍。帕金森病患者的运动特征（统称为帕金森综合征）包括强直、静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和显微照片³。此外，步态障碍在PD患者中很常见，^{出现在疾病早期}1，^4，5。虽然建议采取某些生活方式来帮助减缓PD的进展，例如健康饮食和定期运动，但目前尚无治愈PD的方法，只有药物来控制症状。这为进一步研究留下了空间，以期改进治疗方法。因此，PD动物模型中步态模式的表征是表征模型相关性以及旨在控制PD的治疗如何预防或改善运动障碍的关键工具。

有各种PD动物模型已被用于测试治疗，但是每种模型都有其局限性。例如，用神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）处理的动物模型已经产生了大量关于对黑质DA神经元缺失和随后的纹状体适应很重要的过程的信息，并指出线粒体在PD发病机制中的作用;然而，MPTP模型的致病背景具有毒性，而不是像人类PD⁶那样的神经退行性过程。其他化学诱导模型包括6-羟基多巴胺（6-OHDA）和鱼藤酮。6-OHDA是第一种通过药物在DA神经元中的选择性积累来诱导PD的药物，最终杀死神经元并导致PD样症状。该模型首先用于通过检查对苯丙胺和阿扑^{吗啡的反应}来跟踪DA耗竭7。这种PD诱导方法已被证明可用于筛选影响DA及其受体的药物⁸。虽然6-OHDA模型是跟踪可量化运动缺陷的一个很好的模型，但该模型并未显示神经元的逐渐丧失和路易体的形成如何影响动物。另一种诱导方法鱼藤酮已被证明具有黑质纹状体神经元的进行性变性，酪氨酸羟化酶和DA转运蛋白的丢失，从而允许更好的模型来跟踪神经元随时间的损失⁹。鱼藤酮处理的大鼠表现出运动迟缓，姿势不稳定和步态不稳¹⁰。然而，已经发现这种方法在不同品系的大鼠之间差异很大，这引发了对鱼藤酮是否是可靠的PD模型的质疑¹¹，^12，13。虽然步态分析已被证明受到大鼠PD诱导的影响，但迄今为止，遗传诱导的PD大鼠模型尚未通过自由走在跑道上轻松用于步态分析。

分析自由行走的啮齿动物运动障碍的一种方法是运动学步态分析，可以通过利用FTIR成像进行。这种既定方法使用基于FTIR的光学触摸传感器，该传感器记录和跟踪啮齿动物在^{跑道14，15，16}上移动时的脚印。与其他方法相比，FTIR不依赖于动物身体上任何可能干扰爪印的标记。视频数据的生成产生所有四个肢体的数字爪印，可以组合在一起，为各种啮齿动物模型创建动态且可重复的行走模式。基于成像的步态分析的原理是，当啮齿动物走下跑道时，取下每只爪子并测量随时间推移的接触面积。每种姿势都由爪面积的增加（在制动阶段）和爪面积的减少（在推进阶段）表示。这是通过摆动阶段进行的，即没有检测到爪子信号时。在对视频进行评估后，将生成几个参数，可用于比较野生型（WT）与PD模型。参数的一些示例包括步长（爪子一步覆盖的距离）、摆动持续时间（爪子不与跑道接触的时间持续时间）、摆动速度（步长与摆动持续时间的函数）和步型（对角线步、横向步长或腰带步）。

为了证明FTIR在揭示大鼠早期步态模式变化方面的效用，我们使用了PD的遗传大鼠模型。虽然大多数PD病例是特发性的;PD遗传形式的鉴定发现了基因突变和变异，例如Pink1和Parkin的功能丧失突变，这两种蛋白质参与线粒体质量控制¹⁷，可以用来创建动物模型¹⁸。不幸的是，小鼠在失去这些蛋白质（单一和组合）时对神经变性具有抗性¹⁹，^20，21。在大鼠中，Pink1而不是Parkin缺乏导致黑质DA神经元丢失和运动障碍²²，但没有完全外显。因此，我们生成了一个组合的Pink1 / Parkin双敲除（DKO）大鼠模型，该模型显示了雄性Pink1 KO大鼠²²中报告的明显视觉上明显的后肢拖曳表型，但现在的比率更高:100%对4-6个月之间的雄性30-50%。

虽然这种方法适用于分析小鼠¹⁴的运动缺陷，但FTIR成像步态系统规格以适应大鼠的大小和体重以前是非商业性的。在这里，我们解释了如何构建RatWalker，这是一种以MouseWalker¹⁴为模型的改进的FTIR步态成像系统，除了适应老鼠的大小和体重。该系统利用光学效应FTIR提供了一种可视化并随后记录动物足迹以进行分析的方法。动物的脚与光波导（平台）接触会导致光路中断，从而产生可见的散射效应，这是使用家用级高速摄像和使用开源软件进行处理的。这项研究证明了FTIR成像在研究PD遗传大鼠模型中步态变化方面的能力。例如，虽然最早在雄性DKO大鼠4个月时观察到明显的视觉上明显的运动变化（即后肢拖拽），但使用FTIR，我们能够在2个月大时发现雄性DKO大鼠的门异常。

研究方案

所有动物研究均由内布拉斯加大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 步态仪

注意:以MouseWalker¹⁴为模型，RatWalker设计的尺寸与大鼠和小鼠之间的步长差异成正比。它由侧面照明背光、走道外壳、光波导走道、镜子和摄像头组成（图 S1）。在人行道和背光波导的每一侧都使用了交错定位的 LED 灯条，以容纳额外的材料。构建改进的步态装置所需的材料可以在 表S1中找到。

1. 使用背光（图S2）创建动物的轮廓，软件利用该轮廓来分配位置，运动方向和形态测量质量。结构由丙烯酸扩散器、光波导、反射器和 LED 灯条的分层面板组成，组装在库存铝框架中（表 S1）。
2. 使用走道围栏（图S3）沿着平台引导动物并将动物引导到家笼。结构由用二氯甲烷溶剂焊接的透明丙烯酸板组成（表S2）。
3. 使用走道（图S4）提供介质以产生照明足迹。走道由透明丙烯酸制成，带有带状LED的侧光，并以铝角安装（表S3）。
4. 将镜子（图S5）以45度角直接放置在人行道下方，以反射人行道的底部以进行摄像。它由一个 1/4 英寸厚的玻璃镜子制成，由丙烯酸支撑，角支架排列成一排（表 S4）。
5. 使用安装在三脚架上的家用品质高速运动相机进行摄像。

2. 设备设置

1. 根据 图 S1 将背光、走道和镜子对齐在台面、工作台或马厩推车的顶部。确保每个组件相对于人行道居中。
2. 使用标高时，确保组件水平垂直。
3. 将人行道围栏放在人行道顶部。
4. 用70%乙醇清洁所有接触表面区域。确保使用非研磨性毛巾，以防止划伤人行道。
5. 将高速摄像机安装在 57 英寸三脚架上，并将其放置在镜子的中线，间距足以捕捉视野内的整个走道。从视频设置菜单中，确保将高速摄像机设置为以 1080p 模式以每秒 120 帧 （fps） 的速度进行线性采集，并关闭任何类型的自动调整或优化。
6. 插入并打开背光和走道的 LED 灯条。可能需要调暗背光以减少背景捕获。

3. 动物适应

注意:在第一次实验前一周，通过改良的步态装置运行动物。

1. 在人行道的终点放置一个笼子。
2. 安装好围栏并关闭灯后，将老鼠放在家笼对面的人行道尽头，让它以非强迫的方式穿过人行道。
3. 让每只老鼠通过改良的步态装置几次，直到它们可以顺利穿过整个人行道。
4. 在实验前两天重复该过程。

4. 步态程序

1. 在每次跑步开始之前，在人行道的尽头放置一个家庭笼子，作为老鼠穿越人行道的积极提示。
2. 关掉房间的灯，打开相机电源，在将老鼠放在平台上之前几秒钟开始录制。
   注:请务必使用相机制造商正式推荐的存储卡。未列出的存储卡可能仍然可以工作，但不能保证以所谓的帧速率捕获。
3. 安装围栏后，将老鼠放在家笼对面的人行道尽头，让它以非强迫的方式穿过人行道。
4. 一旦动物到达人行道的终点，就停止记录。
5. 在跑步之间和动物排便后，使用 70% 乙醇和非研磨性毛巾清洁人行道，然后在引入另一只动物之前让乙醇蒸发。
6. 在每个观察期间，大鼠在人行道上总共跑7次，将得分的前三次作为通过进行分析。
7. 如果动物向笼子方向连续四步或更多步，而没有因梳理、暂停或错误的动作而中断，则得分为通过。
   注意:在每轮测量之前记录动物的质量是一种很好的做法。在我们的研究中，WT（n = 7）和DKO（n = 8）分别±21.67 g和296.6±3.85 g的重量分别为200.3（p = 0.004，韦尔奇校正的未配对t检验）。我们没有看到任何年龄或大小的老鼠有问题。

5. 视频预处理

注意:高速摄像机捕获的视频以 mp4 格式呈现，速度为 120 fps，分辨率为 1080p。为了减轻下游分析软件的负担，首先使用 LosslessCut 软件（版本 3.23.7，https://github.com/mifi/lossless-cut）修剪不必要的素材并从每个视频中剥离音频，然后使用开源软件 FFmpeg（版本 4.2，http://ffmpeg.org/）将 mp4 视频流转换为 png 图像序列。注意:可以使用其他无损格式（例如 tiff）代替 png。

1. 在运行 Windows 7 或更高版本的电脑上为视频创建一个目录，然后将视频从高速相机的存储设备传输到新创建的目录。此外，将 ffmpeg.exe 复制到同一位置。
2. 在无损剪切中，将视频拖到界面以打开。放弃音频，将开始和结束剪切点设置为仅包括视频的分析相关部分，将捕获帧格式设置为 png，然后导出。导出视频后，使用后跟"_trimmed"的任何命名约定重命名视频文件。
3. 若要将视频批量转换为图像序列，请打开命令提示符，使用"cd [目录路径]"将工作目录设置为视频的位置，然后运行以下命令:
   对于 （*） 中的 %i do mkdir "%~ni_cropped"
   对于 （*） 中的 %i do mkdir "%~ni_trimmed"
   对于 /f "tokens=1 delims=." %a in （'dir /B *_trimmed.MP4'） do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png"
4. 批处理完成后，在 ImageJ^{Fiji 23} 中打开每个图像序列并将序列裁剪为感兴趣区域 （ROI），包括观察大鼠的地板区域。
5. 要减少人行道照明的背景，请将青色通道的最小色彩平衡增加到 76。
6. 另存为图像序列并将"_trimmed"后缀更改为"_cropped"，将文件保存在各自的"_cropped"文件夹中。

6. 步态处理

注意:步态数据使用免费提供的软件MouseWalker（http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/）¹⁴进行处理和量化。

1. 解压缩 MouseWalker 软件并将其安装到运行安装了 Microsoft Excel 的 64 位 Windows 环境的 PC 上。
2. 启动 MouseWalker.exe 后，对每组运行执行初始刻度校准。加载图像序列并使用视频中捕获的地标或标尺，测量已知距离的两个点。计算视频帧中每厘米的像素数，并将此值与视频采集帧速率一起输入到设置表单的参数部分中。
3. 同样，测量大鼠的头部、尾部和脚，以确定头部长度、最大尾巴宽度和面积、最小和最大脚面积以及完成 MouseWalker 设置表单的跟踪参数部分所需的其他功能。有关用户手册和其他文档，请参阅 http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/。
4. 要获得身体面积值，请在 ImageJ 中打开相同的图像序列，绘制概述大鼠的选择，并执行感兴趣区域 （ROI） 像素计数。
5. 用于本出版物的参数和设置（图 S6）。
   注:参数仅供说明之用，取决于视频比例、采集硬件和条件。每次重新定位相机或设备时，都需要进行软件校准和调整。在采集中捕获测量设备可提高精度并便于校准。
6. 校准后，加载每个图像序列。选择自动将开始自主分配封装。
7. 滚动浏览序列的每一帧，手动更正错误分配的占用空间。此步骤完成后保存。
8. 最后，选择评估以处理封装位置和压力数据。一系列图形、图像和带有定量步态指标的电子表格将导出到结果文件夹中。

7. 数据分析

1. 使用在每次评估结束时导出的电子表格，其中包含每次运行的定量步态数据。连接每次运行的数据和每只大鼠的平均值。绘制平均数据并使用 GraphPad Prism 版本 7.0a 检验显著性。

结果

鼠群维护
Pink1和Parkin单KO大鼠的产生和表征已在前面描述过²²。Pink1和Parkin单只KO大鼠是从SAGE实验室获得的（现在可以从Envigo获得）。DKO大鼠是通过将Pink1-/-大鼠与Parkin-^/-大鼠杂交以获得Pink1 ⁺ / / / Parkin+/-大鼠而产生的，这些大鼠杂交以获得Pink1-/-/Parkin-^/-大鼠（可从Envigo获得）。为了确认Park6?...

讨论

步态障碍，包括手臂摆动减少、行走速度减慢和步数缩短，是帕金森病的一个决定性特征，发生在病程早期^1，5。多年来，已经开发了几种方法来观察和记录脚步，以便在PD的啮齿动物模型中进行步态分析，手动技术用于量化脚步位置，从而产生了更灵敏且能够捕获动态参数的自动化方法。一些静态方法涉及"墨迹"啮齿动物的爪子，并带有指示器，以跟?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1