Application du système RatWalker pour l’analyse de la marche dans un modèle génétique de la maladie de Parkinson chez le rat

Résumé

Nous décrivons ici le système RatWalker, construit en redessinant l’appareil MouseWalker pour s’adapter à l’augmentation de la taille et du poids des rats. Ce système utilise la réflexion interne totale frustrée (FTIR), la capture vidéo à grande vitesse et un logiciel d’analyse en libre accès pour suivre et quantifier les paramètres de marche.

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative progressive causée par la perte de neurones dopaminergiques (DA) dans la substance noire pars compacta. Les anomalies de la démarche, y compris la diminution du balancement des bras, la vitesse de marche plus lente et des pas plus courts sont fréquentes chez les patients atteints de MP et apparaissent tôt dans l’évolution de la maladie. Ainsi, la quantification des schémas moteurs dans les modèles animaux de MP sera importante pour la caractérisation phénotypique au cours de l’évolution de la maladie et lors du traitement thérapeutique. La plupart des cas de MP sont idiopathiques; cependant, l’identification de formes héréditaires de MP a révélé des mutations génétiques et des variantes, telles que des mutations de perte de fonction dans Pink1 et Parkin, deux protéines impliquées dans le contrôle de la qualité mitochondriale qui pourraient être exploitées pour créer des modèles animaux. Alors que les souris sont résistantes à la neurodégénérescence lors de la perte de Pink1 et Parkin (délétion simple et combinée), chez le rat, le déficit en Pink1 mais pas en Parkin entraîne une perte de neurones DA nigraux et une déficience motrice. Ici, nous rapportons l’utilité de l’imagerie IRTF pour découvrir les changements de démarche chez les jeunes rats mâles (âgés de 2 mois) qui marchent librement avec une perte combinée de Pink1 et Parkin avant le développement d’une anomalie motrice visuelle apparente globale à mesure que ces rats vieillissent (observée à 4-6 mois), caractérisée par un traînement des membres postérieurs comme précédemment rapporté chez les rats Pink1 knockout (KO).

Introduction

La MP, le trouble neurodégénératif du mouvement lié à l’âge le plus courant, est causée par la perte de neurones DA dans la substance noire pars compacta. Cette perte de neurones DA nigraux et les entrées DA dans le striatum conduisent aux altérations de la fonction motrice observées chez les patients atteints de ^1,2. Les caractéristiques motrices déterminantes des patients atteints de MP, connues collectivement sous le nom de parkinsonisme, comprennent la rigidité, les tremblements au repos, la bradykinésie, l’instabilité posturale et la micrographie³. De plus, les troubles de la marche, qui sont fréquents chez les patients atteints de MP, apparaissent tôt dans l’évolution de la maladie ^1,4,5. Bien que certains modes de vie soient suggérés pour aider à ralentir la progression de la MP, comme une alimentation saine et l’exercice régulier, il n’existe actuellement aucun remède contre la MP, seulement des médicaments pour gérer les symptômes. Cela laisse place à la nécessité d’approfondir les recherches dans l’espoir d’améliorer les traitements. Ainsi, la caractérisation du schéma de démarche dans les modèles animaux MP est un outil crucial pour caractériser la pertinence du modèle ainsi que la façon dont les traitements thérapeutiques visant à contrôler la MP préviennent ou améliorent les déficiences motrices.

Il existe différents modèles animaux de MP qui ont été utilisés pour tester des traitements thérapeutiques, mais chacun a ses limites. Par exemple, des modèles animaux traités avec la neurotoxine 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) ont fourni une grande quantité d’informations sur les processus importants pour la perte de neurones DA nigraux et les adaptations striatales subséquentes, et ont souligné le rôle des mitochondries dans la pathogenèse de la MP; cependant, le contexte pathogénique du modèle MPTP est de nature toxique plutôt que neurodégénérative comme dans le⁶ humain. D’autres modèles inductibles chimiquement comprennent la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) et la roténone. Le 6-OHDA a été le premier agent utilisé pour induire la MP par accumulation sélective du médicament dans les neurones DA, ce qui finit par tuer les neurones et conduit à des symptômes semblables à ceux de la MP. Ce modèle a d’abord été utilisé pour le suivi de la déplétion en DA en examinant le comportement en réponse à l’amphétamine et à l’apomorphine⁷. Cette méthode d’induction de la MP s’est avérée utile pour le dépistage des agents pharmacologiques qui ont un impact sur l’AD et ses récepteurs⁸. Bien que le modèle 6-OHDA soit un excellent modèle pour suivre les déficits moteurs quantifiables, ce modèle ne montre pas comment la perte progressive de neurones et la formation de corps de Lewy affectent l’animal. L’autre méthode d’induction, la roténone, s’est avérée avoir une dégénérescence progressive des neurones nigrostriataux avec la perte de tyrosine hydroxylase et de transporteur DA, permettant un meilleur modèle pour suivre la perte de neurones au fil du temps⁹. Les rats traités à la roténone présentaient une bradykinésie, une instabilité posturale et une démarche instable¹⁰. Cependant, cette méthode s’est avérée très variable entre les différentes souches de rats, ce qui a suscité des doutes quant à savoir si la roténone est ou non un modèle fiable^11,12,13. Bien qu’il ait été démontré que l’analyse de la marche est influencée par l’induction de la MP chez les rats, à ce jour, les modèles de rat de la MP génétiquement induite n’ont pas été facilement utilisés pour l’analyse de la marche en marchant librement sur une piste.

Une façon d’analyser la déficience motrice chez les rongeurs qui marchent librement est l’analyse cinématique de la démarche, qui peut être effectuée en utilisant l’imagerie FTIR. Cette méthode établie utilise un capteur tactile optique basé sur FTIR, qui enregistre et suit les empreintes des rongeurs lorsqu’ils descendent la piste^14,15,16. Par rapport à d’autres méthodes, le FTIR ne dépend d’aucun marqueur sur le corps de l’animal qui pourrait interférer avec les empreintes de pattes. La génération des données vidéo produit des empreintes numériques des quatre membres qui peuvent être combinées pour créer un modèle de marche dynamique et reproductible pour divers modèles de rongeurs. Le principe de l’analyse de la démarche basée sur l’imagerie est de prendre chaque patte individuelle et de mesurer la zone de contact au fil du temps lorsque le rongeur descend la piste. Chaque position est représentée par une augmentation de la surface des pattes (dans la phase de freinage) et une diminution de la surface de la patte (dans la phase de propulsion). Ceci est procédé par la phase de balancement, c’est-à-dire lorsqu’aucun signal de patte n’est détecté. Après l’évaluation de la vidéo, plusieurs paramètres sont générés qui peuvent être utilisés pour comparer le modèle de type sauvage (WT) et le modèle. Quelques exemples de paramètres sont la longueur de marche (distance parcourue par la patte en un pas), la durée de la balançoire (durée pendant laquelle la patte n’est pas en contact avec la piste), la vitesse de balancement (longueur de pas en fonction de la durée de la balançoire) et le motif des pas (pas diagonaux, marches latérales ou pas de ceinture).

Pour démontrer l’utilité du FTIR pour découvrir les premiers changements de la démarche chez les rats, nous avons utilisé un modèle génétique de la MP chez le rat. Alors que la plupart des cas de MP sont idiopathiques; l’identification de formes héréditaires de MP a mis au jour des mutations génétiques et des variants, tels que des mutations de perte de fonction chez Pink1 et Parkin, deux protéines impliquées dans le contrôle de la qualité mitochondriale¹⁷, qui pourraient être exploitées pour créer des modèles animaux¹⁸. Malheureusement, les souris sont résistantes à la neurodégénérescence lors de la perte de ces protéines (simples et combinées)19,20,21. Chez le rat, le déficit en rose1 mais pas en parkin entraîne une perte de neurones DA nigraux et des déficiences motrices²², mais sans pénétration complète. Par conséquent, nous avons généré un modèle combiné de rat Pink1/Parkin double knockout (DKO), qui affiche le phénotype de traînage des membres postérieurs visuellement apparent signalé chez les rats mâles Pink1 KO²², mais maintenant à un taux plus élevé : 100% contre 30-50% des mâles entre 4-6 mois.

Bien que cette méthode fonctionne bien pour analyser les déficits moteurs chez les souris¹⁴, les spécifications du système d’imagerie FTIR pour tenir compte de la taille et du poids des rats n’étaient pas disponibles auparavant à des fins non commerciales. Nous expliquons ici comment construire le RatWalker, un système d’imagerie de la marche FTIR modifié inspiré du MouseWalker¹⁴, sauf adapté à la taille et au poids des rats. Ce système utilise un effet optique, FTIR, pour fournir une méthode permettant de visualiser et d’enregistrer ensuite les empreintes d’animaux à des fins d’analyse. Le contact du pied d’un animal avec le guide d’ondes optique (plate-forme) provoque une perturbation du trajet de la lumière, ce qui entraîne un effet de diffusion visible, qui est capturé à l’aide d’une vidéographie à haute vitesse de qualité domestique et d’un traitement à l’aide d’un logiciel libre. Cette étude démontre la puissance de l’imagerie IRTF dans l’étude des changements de démarche dans les modèles génétiques de MP chez le rat. Par exemple, alors que des changements moteurs visuellement apparents manifestes (c’est-à-dire le traînement des membres postérieurs) sont observés chez les rats DKO mâles à 4 mois au plus tôt, en utilisant le FTIR, nous sommes en mesure de découvrir des anomalies de la porte chez les rats DKO mâles à l’âge de 2 mois.

Protocole

Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université du Nebraska.

1. Appareil de marche

REMARQUE: Modélisé à partir du MouseWalker¹⁴, le RatWalker a été conçu avec des dimensions proportionnelles à la différence de longueur de pas entre les rats et les souris. Il se compose d’un rétroéclairage à éclairage latéral, d’une enceinte de passerelle, d’une passerelle de guide d’ondes optique, d’un miroir et d’une caméra (figure S1). Des bandes de LED, orientées en quinconce, ont été utilisées de chaque côté de la passerelle et des guides d’ondes de rétroéclairage pour accueillir le matériau supplémentaire. Les matériaux nécessaires à la construction de l’appareil de marche modifié se trouvent dans le tableau S1.

1. Utilisez un rétroéclairage (Figure S2) pour créer une silhouette de l’animal qui est utilisée par le logiciel pour attribuer la position, la direction du mouvement et les qualités morphométriques. La construction est composée d’un panneau stratifié composé d’un diffuseur en acrylique, d’un guide d’ondes optique, d’un réflecteur et de bandes lumineuses LED assemblées dans un cadre en aluminium de série (tableau S1).
2. Utilisez un enclos de passerelle (figure S3) pour guider l’animal le long de la plate-forme et dirigez-le vers la cage de la maison. La construction est constituée de feuilles d’acrylique transparentes soudées au solvant avec du dichlorométhane (tableau S2).
3. Utilisez la passerelle (figure S4) pour fournir le support permettant de générer des empreintes éclairées. La passerelle est construite en acrylique transparent, qui est éclairé latéralement avec des LED à bande et logé dans un angle en aluminium (tableau S3).
4. Placez un miroir (figure S5) directement sous la passerelle à un angle de 45 degrés pour refléter le dessous de la passerelle pour la vidéographie. Il est construit à partir d’un miroir en verre de 1/4 » d’épaisseur soutenu par de l’acrylique et de supports inclinés disposés en rangée (tableau S4).
5. Effectuez une vidéographie à l’aide d’une caméra d’action haute vitesse de qualité domestique montée sur trépied.

2. Configuration de l’équipement

1. Alignez le rétroéclairage, la passerelle et le miroir conformément à la figure S1, au-dessus d’un comptoir, d’un établi ou d’un chariot stable. Assurez-vous que chaque composant est centré par rapport à la passerelle.
2. À l’aide d’un niveau, assurez-vous que les composants sont à plomb horizontal.
3. Placez l’enceinte de la passerelle au-dessus de la passerelle.
4. Nettoyez toutes les surfaces de contact avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous d’utiliser une serviette non abrasive pour éviter de rayer la passerelle.
5. Montez la caméra haute vitesse sur un trépied de 57 pouces et placez-la au milieu de la ligne du miroir, suffisamment espacée pour capturer toute la passerelle à l’intérieur du champ de vision. Dans le menu des paramètres vidéo, assurez-vous que la caméra haute vitesse est réglée sur l’acquisition linéaire en mode 1080p à 120 images par seconde (ips) avec tout type de réglage automatique ou d’optimisations désactivé.
6. Branchez et allumez les bandes lumineuses LED pour le rétroéclairage et la passerelle. Il peut être nécessaire d’atténuer le rétroéclairage pour réduire la capture de l’arrière-plan.

3. Acclimatation des animaux

REMARQUE : Une semaine avant la première expérience, faites passer les animaux à travers l’appareil de marche modifié.

1. Placez une cage domestique au terminus de la passerelle.
2. Une fois l’enceinte installée et les lumières éteintes, placez le rat au bout de la passerelle en face de la cage de la maison et laissez-le traverser la passerelle de manière non forcée.
3. Faites passer chaque rat à travers l’appareil de marche modifié plusieurs fois, jusqu’à ce qu’ils puissent traverser en douceur toute la passerelle.
4. Répétez le processus deux jours avant l’expérience.

4. Procédure de marche

1. Placez une cage à la fin de la passerelle avant le début de chaque course pour servir de signal positif au rat pour traverser la passerelle.
2. Éteignez les lumières de la pièce, allumez la caméra et commencez à enregistrer plusieurs secondes avant que le rat ne soit placé sur la plate-forme.
   REMARQUE: Assurez-vous d’utiliser une carte mémoire officiellement recommandée par le fabricant de l’appareil photo. Une carte mémoire non répertoriée peut toujours fonctionner, mais il n’est pas garanti de capturer à la fréquence d’images supposée.
3. Une fois l’enceinte installée, placez le rat au bout de la passerelle en face de la cage de la maison et laissez-le traverser la passerelle de manière non forcée.
4. Arrêtez l’enregistrement une fois que l’animal atteint le terminus de la passerelle.
5. Nettoyez la passerelle en utilisant de l’éthanol à 70 % et une serviette non abrasive entre les courses et après qu’un animal urine ou défèque, puis laissez l’éthanol s’évaporer avant d’introduire un autre animal.
6. Faites passer les rats à travers la passerelle un total de 7 fois au cours de chaque période d’observation, en prenant les trois premiers passages qui marquent comme passant pour analyse.
7. Marquez une course comme passant si l’animal fait quatre pas consécutifs ou plus en direction de la cage d’accueil sans interruption en raison du toilettage, de la pause ou des mouvements errants.
   NOTE: Il est recommandé d’enregistrer la masse des animaux avant chaque série de mesures. Pour notre étude, WT (n = 7) et DKO (n = 8) pesaient respectivement 200,3 ± 21,67 g et 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, test t non apparié avec correction de Welch). Nous ne voyons pas de problème avec les rats de tout âge ou de toute taille.

5. Prétraitement vidéo

REMARQUE: Les vidéos capturées par la caméra haute vitesse sont rendues au format mp4 à 120 ips et une résolution de 1080p. Pour alléger la charge du logiciel analytique en aval, coupez d’abord les séquences inutiles et supprimez l’audio de chaque vidéo à l’aide du logiciel LosslessCut (version 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), puis convertissez le flux vidéo mp4 en une séquence d’images png à l’aide du logiciel open source FFmpeg (version 4.2, http://ffmpeg.org/). Remarque : d’autres formats sans perte tels que tiff peuvent être utilisés à la place de png.

1. Créez un répertoire pour les vidéos sur un PC exécutant Windows 7 ou une version ultérieure, puis transférez les vidéos du périphérique de stockage de la caméra haute vitesse vers le répertoire nouvellement créé. En outre, copiez ffmpeg.exe au même emplacement.
2. Dans LosslessCut, faites glisser les vidéos vers l’interface pour les ouvrir. Supprimez l’audio, définissez les points de coupe de début et de fin pour n’inclure que la partie analytiquement pertinente de la vidéo, définissez le format d’image de capture sur png et exportez. Une fois la vidéo exportée, renommez le fichier vidéo en utilisant n’importe quelle convention de nommage suivie de « _trimmed ».
3. Pour convertir par lots les vidéos en séquences d’images, ouvrez une invite de commande, définissez le répertoire de travail sur l’emplacement des vidéos avec « cd [chemin vers le répertoire] », puis exécutez les commandes suivantes:
   for %i in (*) do mkdir « %~ni_cropped »
   for %i in (*) do mkdir « %~ni_trimmed »
   for /f « tokens=1 delims=. » %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i « %a.MP4 » « %a/%a_%04d.png »
4. Une fois le traitement par lots terminé, ouvrez chaque séquence d’images dans ImageJ Fiji²³ et recadrez la séquence à la région d’intérêt (ROI) englobant la zone du sol dans laquelle le rat est observé.
5. Pour réduire l’arrière-plan de l’éclairage de la passerelle, augmentez l’équilibre des couleurs minimum du canal cyan à 76.
6. Enregistrez en tant que séquence d’images et changez le suffixe « _trimmed » en « _cropped », en enregistrant les fichiers dans leur dossier « _cropped » respectif.

6. Traitement de la marche

NOTE: Les données de marche sont traitées et quantifiées à l’aide du logiciel disponible gratuitement, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)¹⁴.

1. Décompressez et installez le logiciel MouseWalker sur un PC exécutant un environnement Windows 64 bits avec Microsoft Excel installé.
2. Après avoir lancé MouseWalker.exe, effectuez un étalonnage initial de l’échelle pour chaque série d’exécutions. Chargez une séquence d’images et, à l’aide de points de repère ou d’une règle capturée dans la vidéo, mesurez deux points de distance connue. Calculez le nombre de pixels par centimètre dans l’image vidéo et entrez cette valeur dans la section des paramètres du formulaire de paramètres avec la fréquence d’images d’acquisition vidéo.
3. De même, mesurez la tête, la queue et les pattes du rat pour déterminer la longueur de la tête, la largeur et la surface maximales de la queue, la surface minimale et maximale des pieds et d’autres caractéristiques nécessaires pour remplir la section des paramètres de suivi du formulaire de paramètres MouseWalker. Consultez http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ pour le manuel d’utilisation et d’autres documents.
4. Pour obtenir les valeurs de surface corporelle, ouvrez la même séquence d’images dans ImageJ, dessinez une sélection décrivant le rat et effectuez un comptage de pixels par région d’intérêt (ROI).
5. Paramètres et paramètres utilisés pour cette publication (figure S6).
   REMARQUE : Les paramètres sont fournis à titre d’illustration et dépendent de l’échelle de la vidéo, du matériel d’acquisition et des conditions. Un étalonnage et un réglage du logiciel sont nécessaires chaque fois que la caméra ou l’équipement est repositionné. La capture d’un appareil de mesure dans l’acquisition améliore la précision et facilite l’étalonnage.
6. Après l’étalonnage, chargez chaque séquence d’images. La sélection automatique lancera l’attribution autonome des empreintes.
7. Faites défiler chaque image de la séquence, en corrigeant manuellement les empreintes mal attribuées. Enregistrez une fois cette étape terminée.
8. Enfin, sélectionnez évaluer pour traiter les données de position et de pression de l’empreinte. Une série de graphiques, d’images et d’une feuille de calcul avec des mesures quantitatives de la démarche seront exportées dans un dossier de résultats.

7. Analyse des données

1. Utilisez la feuille de calcul exportée à la fin de chaque évaluation qui contient des données quantitatives sur la marche pour chaque essai. Concaténer les données de chaque exécution et la moyenne par rat. Tracez les données moyennes et testez la signification à l’aide de GraphPad Prism version 7.0a.

Résultats

Entretien de la colonie de rats
La génération et la caractérisation des rats KO simples Pink1 et Parkin ont été décrites précédemment²². Les rats KO simples Pink1 et Parkin ont été obtenus auprès de SAGE Labs (et maintenant disponibles chez Envigo). Les rats DKO ont été générés en croisant des rats Pink1-/- avec des rats Parkin-/- pour obtenir des rats Pink1+/-/Parkin+/-, qui ont été croisés pour obtenir des rats Pink1-/-/Park...

Discussion

Les troubles de la démarche, y compris la diminution du balancement des bras, la vitesse de marche plus lente et les pas plus courts, sont une caractéristique déterminante de la MP et surviennent tôt au cours de l’évolution de la maladie ^1,5. Plusieurs méthodes ont été développées au fil des ans pour observer et enregistrer les pas pour l’analyse de la marche dans des modèles de chez les rongeurs, avec des techniques manuelles pour quantifier la po...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum
1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 8
1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 4
32 Gauge Aluminum Sheet			Dimensions: 10' Qty: 1
1” Aluminum Tube (1/8” - 6063)			Dimensions: 8' Qty: 1
Acrylic
7/32” Clear Acrylic Sheet			Dimensions: 4'x8' Qty: 2
1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447)			Dimensions: 4'x8' Qty: 1
Mirror
7/32” Glass Mirror			Dimensions: 60"x12" Qty: 1
LED
5050 LED Tape Light (Green)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
5050 LED Tape Light (Red)			Dimensions: 16.4' Qty: 1
Camera
GoPro Hero 6 Black			Qty: 1
Tripod			Dimensions: 57" Qty: 1